付軍明 肖招蘭 何富強 郭君其 譚建明 朱凌峰

作者單位：350025 福州，福州總醫(yī)院泌尿外科

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma）簡稱腎癌，是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在最近20年內(nèi)發(fā)病率逐年上漲，截至2017年，其在成人惡性腫瘤中比例達(dá)到3﹪[1]。腎透明細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC），是腎癌最常見的病理類型，約占腎癌的70﹪～ 80﹪[2]?，F(xiàn)階段對ccRCC的發(fā)病機制尚未研究清楚，由于其對放化療敏感性差，因而手術(shù)治療仍是其首選治療方案。近年來隨著分子醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，大量的腫瘤標(biāo)志物相繼被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床，為臨床治療提供了有力的幫助[3-5]。然而目前尚未有ccRCC的生物標(biāo)志物應(yīng)用于臨床，因此，尋找切實有效的ccRCC腫瘤標(biāo)志物顯得尤為重要。

MicroRNA（miRNA）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[6]。近年來已有大量報道多種miRNA參與各類型腫瘤疾病的發(fā)生與發(fā)展進程[7-9]。本研究運用生物信息學(xué)方法，從癌癥基因組圖譜TCGA（The Cancer Genome Atlas）數(shù)據(jù)庫中下載ccRCC中miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，篩選出差異表達(dá)miRNA并對其進行系統(tǒng)性分析，為探索ccRCC發(fā)病的分子機制以及后續(xù)尋找可行的治療靶點提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、材料

（一）數(shù)據(jù)材料

通過GDC（https://portal.gdc.cancer.gov/） 工具下載TCGA數(shù)據(jù)庫中ccRCC臨床資料以及miRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)（miRNAseq 3級數(shù)據(jù)）。選擇的數(shù)據(jù)集為Kidney Renal Clear Cell Carcinoma（KIRC）。截至2018年3月，該數(shù)據(jù)集miRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)來源于545個ccRCC樣本以及71個對應(yīng)的癌旁組織樣本。本研究嚴(yán)格遵守TCGA發(fā)布的發(fā)表指導(dǎo)規(guī)范（https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines）。

（二）分析軟件及數(shù)據(jù)庫

R軟件（https://www.r-project.org/）及其附帶的“edgeR”包、“Survival”包；Cytoscape軟件（http://www.cytoscape.org/）及其插件“ClueGO”； Funrich軟件（http://www.funrich.org/）； Perl軟件 ； miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫 Targetscan（http://www.targetscan.org/vert_71/）、miRDB（http://www.mirdb.org/）、miRTarBase（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）。

（三）方法

利用R軟件的“edgeR”包篩選出ccRCC與正常組織的差異表達(dá)miRNA，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：|LogFC|≥ 2，adj.P ≤ 0.01。然后使用“Survival”包，運用Kaplan-Meier法對差異表達(dá)的miRNA進行生存分析，閾值設(shè)置為P≤0.05。接著利用Perl軟件將生存期有意義的差異表達(dá)miRNA在三個數(shù)據(jù)庫（Targetscan、miRDB、miRTarBase）中進行靶基因預(yù)測，預(yù)測結(jié)果取交集。在Cytoscape軟件中對miRNA及其靶基因進行可視化分析，最后利用軟件自帶的ClueGO插件以及FunRich軟件對靶基因分別進行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析和GO（Gene Ontology）富集分析。

結(jié) 果

一、差異表達(dá)的miRNA篩選結(jié)果

經(jīng)過對TCGA數(shù)據(jù)庫中545個ccRCC樣本及71正常組織樣本數(shù)據(jù)的處理，一共篩選出54個差異表達(dá)miRNA，其中上調(diào)33個，下調(diào)21個（表1）。同時，利用“edgeR”包繪制出了差異表達(dá)miRNA的熱圖（圖1）和火山圖（圖2）。

二、差異表達(dá)miRNA生存期分析結(jié)果

將從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載的ccRCC臨床資料（共530例病人生存時間信息）進行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，運用“Survival”包對差異表達(dá)miRNA進行生存分析，按照P≤0.05的標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-21和hsamiR-155的差異表達(dá)與患者的總體生存率（Overall survival）具有相關(guān)性，即二者高表達(dá)時，患者總體生存率明顯下降（圖3）。

三、 hsa-miR-21與hsa-miR-155靶基因預(yù)測結(jié)果

將hsa-miR-21與hsa-miR-155在Targetscan、miRDB、miRTarBase和miRPath這四個數(shù)據(jù)庫中進行靶基因預(yù)測，取交集結(jié)果發(fā)現(xiàn)共預(yù)測到129個靶基因，在Cytoscape軟件中對miRNA與靶基因的關(guān)系對進行可視化（圖4）。

表1 差異表達(dá)的miRNA（TOP 5）

圖1 差異表達(dá)miRNA熱圖

四、 靶基因GO分析及KEGG通路分析結(jié)果

GO富集分析主要分為三大類：細(xì)胞組分（Cellular Component， CC）、分子功能（Molecular Function，MF）、生物過程（Biological Process，BP）。利用Funrich軟件分析靶基因的MF、BP，按照P值大小排序前十名結(jié)果見圖5。其中BP富集分析主要包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（Signal transduction）、細(xì)胞通訊（Cell communication）以及堿基、核苷核苷酸和核酸的代謝（Nucleobase ,nucleoside, nucleotide and nucleic acid metabolism）。KEGG通路分析結(jié)果表明靶基因主要富集在FoxO信號通路（FoxO signaling pathway）以及TNF信號通路（TNF signaling pathway）等，具體通路及相關(guān)靶基因見圖6。

圖2 差異表達(dá)miRNA火山圖

討 論

圖3 hsa-miR-21與hsa-miR-155在ccRCC中的生存曲線

圖4 miRNA-Target Genes網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 靶基因GO分析

圖6 靶基因KEGG分析

在本研究中，利用TCGA數(shù)據(jù)庫一共篩選出了54個在ccRCC中差異表達(dá)的miRNA，其中上調(diào)33個、下調(diào)21個。然后從中篩選出與ccRCC的預(yù)后相關(guān)的miRNA：hsa-miR-21和hsa-miR-155，并在多個數(shù)據(jù)庫中預(yù)測這兩個miRNA的靶基因，最后對這些靶基因進行通路富集和功能分析。通路富集分析發(fā)現(xiàn)這些靶基因主要與MAPK、Ras、TNF等信號通路密切相關(guān)。近年來對miRNA在腫瘤中的研究日益增多，但這些研究往往集中對在一個miRNA的單個或一類靶基因的研究[10-11]。而本研究采用的綜合分析miRNA靶基因的方法，有助于對miRNA及其功能進行更全面的分析。本研究是首次利用TCGA數(shù)據(jù)庫篩選出與ccRCC患者總體生存率相關(guān)的miRNA，并對其靶基因進行GO和KEGG分析，對臨床上尋找ccRCC的治療靶點具有重要指導(dǎo)意義。

近年來，已有大量研究表明hsa-miR-21與hsamiR-155均涉及多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展進程。如Maachani等[12]發(fā)現(xiàn)hsa-miR-21在神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中高表達(dá)并且與腫瘤的分期分級以及病人的預(yù)后不良密切相關(guān)，在體外實驗中通過敲低hsa- miR- 21的表達(dá)發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的增殖受到抑制，并且在體內(nèi)實驗中也證實了通過敲低hsa-miR-21能夠顯著的抑制腫瘤的形成。Kong等[13]研究發(fā)現(xiàn)在三陰性乳腺癌中，hsa-miR-155通過靶向VHL基因并影響其表達(dá)來促進腫瘤的血管生成，進而影響患者的預(yù)后情況。根據(jù)最新的文獻報道，這兩個miRNA均在ccRCC進程中扮演著重要角色。如hsa-miR-21在ccRCC中能夠刺激上皮到間質(zhì)的轉(zhuǎn)化以及腫瘤發(fā)生[14]，hsa-miR-155則能夠影響ccRCC的增值能力以及侵襲性[15]。

GO富集分析可以深入了解miRNA的靶基因參與的分子功能和生物學(xué)過程等。在hsa-miR-21和hsa-miR-155對應(yīng)的靶基因GO富集結(jié)果中，涉及到轉(zhuǎn)錄因子活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞通訊等功能均與ccRCC的產(chǎn)生及發(fā)展有密切的聯(lián)系[16-18]。KEGG通路分析結(jié)果中，諸如FoxO以及TNF等信號通路，不僅有大量文獻報道這些通路與ccRCC有關(guān)[19-21]，更是在其他多種腫瘤的病理過程中發(fā)揮著重要作用[22-24]。

綜上所述，本研究采用生物信息學(xué)方法篩選出了ccRCC中差異表達(dá)的miRNA，通過分析hsa- miR-21與hsa-miR-155的預(yù)后生存曲線發(fā)現(xiàn)它們的高表達(dá)與患者的預(yù)后差有密切聯(lián)系，并且二者靶基因參與的信號通路與ccRCC的發(fā)生發(fā)展有著密不可分的聯(lián)系?？傊?，本研究對hsa-miR-21和hsa- miR-155在ccRCC中的潛在發(fā)病機制進行了深入分析，進一步對ccRCC的基礎(chǔ)研究和臨床治療靶點的發(fā)現(xiàn)提供了理論指導(dǎo)。