鄭偉 ?；⒘?海軍 宋曉雪 杜立學(xué)

作者單位：710068 西安，陜西省人民醫(yī)院肝膽外科

肝纖維化是指由各種因素所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，病因和發(fā)病機制不清，肝纖維化是肝硬化的前期病變，肝纖維化可發(fā)展成為肝硬化，肝硬化往往因引起并發(fā)癥而死亡，上消化道出血為肝硬化最常見的并發(fā)癥，而肝性腦病是肝硬化最常見的死亡原因[1]。逆轉(zhuǎn)肝纖維化可阻止大多數(shù)慢性肝病進展[2]。肝星狀細胞是肝內(nèi)一種具有多功能、變化不定的非實質(zhì)細胞[3]。研究表明，肝星狀細胞活化和增生是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[4]。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是調(diào)節(jié)水鹽代謝及血壓的激素，是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的主要活性物質(zhì)[5]。研究表明，AngⅡ與多種腫瘤的增殖和遷移密切相關(guān)，但其在肝星狀細胞中的作用研究較少，分子機制不明確[6-7]。本研究探討AngⅡ?qū)Ω涡菭罴毎鲋澈突罨挠绊懠捌渥饔脵C制。

材料與方法

一、實驗材料

（一）實驗試劑

人源肝星狀細胞LX2細胞系（上海復(fù)祥生物科技有限公司），胎牛血清（杭州四季青），AngⅡ（上海源葉生物科技有限公司），RPMI 1640細胞培養(yǎng)基（美國Gibico公司），胰酶、Lipofectamine 2000（美國thermofisher公司），羥脯氨酸檢測試劑盒-消化法（南京建成生物工程研究所），siRNA-Notch1及其對照物siRNA-NC（廣州銳博生物科技有限公司），CCK8檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司），Notch1，Sox2 Rabbit mAb（美國CST公司）。

二、實驗方法

（一）細胞培養(yǎng)與細胞轉(zhuǎn)染

人肝星狀細胞LX2細胞用含有10﹪胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37 ℃、5﹪ CO2培養(yǎng)，每2天換1次培養(yǎng)基，細胞匯合至80﹪以上傳代培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)染前1天，6孔板接種LX2細胞，用不含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細胞密度達到70﹪ ～80﹪時，按照Lipofectamine 2000操作說明進行細胞轉(zhuǎn)染，Notch1的siRNA靶向序列為，5'-GATCCTGGCGGGAAGTGTGAAGCGT-3'，對照組NC的siRNA靶向序列為5'-AGACGCTTCACACTTCCCGCCATTA-3'，加 入轉(zhuǎn)染試劑和siRNA混合物，6 h后去除培養(yǎng)基，加入含10﹪胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。37 ℃、5﹪CO2正常培養(yǎng)后用于后續(xù)檢測實驗。

（二）CCK8法檢測細胞增殖

取處理后的人肝星狀細胞LX2，0.25﹪胰酶消化離心，調(diào)整細胞濃度為2×104個/ml，均以100 μl/ 孔種植于 96 孔板中，37 ℃、5 ﹪ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h 后加入不同終濃度（0、5、10、20、40、80 nmol/L）的AngⅡ，每組設(shè)置3個復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μl CCK8溶液培養(yǎng)2 h，于450 nm下測定各孔吸光值（A450），并繪制CCK8曲線圖。

（三）羥脯氨酸法檢測膠原合成

收集細胞培養(yǎng)液，按照羥脯氨酸檢測試劑盒說明書（消化法）進行檢測。取細胞培養(yǎng)液0.25 ml（或標準應(yīng)用液），加入0.05 ml消化液，37 ℃水浴3 h進行酶解，再加入0.5 ml試劑一，混勻后室溫靜置10 min，加入0.5 ml試劑二，混勻后靜置5 min，加入1 ml試劑三，60 ℃水浴 15 min，用雙蒸水調(diào)零，于550 nm處測定吸光值，計算羥脯氨酸含量。

（四）Western Blot檢測蛋白表達

培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的人肝星狀細胞LX2，處理后加入蛋白裂解液收集細胞蛋白樣品，定量后取等量蛋白樣品進行 SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜，5﹪脫脂奶粉封閉 1 h，加入（1 : 500）稀釋的一抗（Notch1，Sox2，Oct4，GAPDH），室溫孵育1 h。洗滌后加入HRP標記的二抗，室溫孵育1 h，洗滌后加入化學(xué)發(fā)光液顯色，成像拍照，蛋白相對表達量采用軟件Image J進行灰度值統(tǒng)計。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS 17.0軟件進行分析，CCK8、羥脯氨酸檢測結(jié)果和Western Blot結(jié)果采用表示。CCK8、羥脯氨酸檢測結(jié)果和Western Blot結(jié)果數(shù)據(jù)中，多組間的比較采用單因素方差分析，兩組間的比較采用獨立t檢驗，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、AngⅡ促進肝星狀細胞LX2增殖

CCK8結(jié)果顯示，AngⅡ能促進肝星狀細胞的增殖，其A450值分別為 0.67±0.06、0.88±0.07、0.98±0.07、1.08±0.07、1.23±0.07，增殖能力高于NC組0.57±0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=45.76，P＜0.01）。（表 1）

二、AngⅡ?qū)X2細胞膠原合成的影響

羥脯氨酸檢查結(jié)果顯示，AngⅡ（10、20、40 nmol/L）預(yù)處理能促進肝星狀細胞膠原合 成，其羥脯氨酸濃度分別為（2.60±0.20）、（3.47±0.25）、（4.17±0.21）mg/L，羥脯氨酸濃度高于NC組（1.90±0.10）mg/L，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=75.18，P＜0.0001）。這表明 AngⅡ能夠促進LX2細胞膠原合成。（表2）

三、AngⅡ?qū)X2細胞Notch1蛋白表達的影響

進一步檢測AngⅡ?qū)X2細胞Notch1蛋白表達的影響。Western Blot結(jié)果顯示，AngⅡ10、20、40 nmol/L組Notch1蛋白表達水平分別為0.20±0.02、0.54±0.04、0.82±0.03，與正常對照組比較 0.11±0.02 升高（F= 400.50，P＜ 0.0001）。表明AngⅡ可以促進肝星狀細胞Notch1蛋白的表達。（圖1）

四、干擾Notch1抑制AngⅡ誘導(dǎo)的肝星狀細胞增殖

上述研究表明，AngⅡ可劑量依賴性的促進肝星狀細胞活力，因此進一步檢測AngⅡ是否介導(dǎo)Notch1抑制肝星狀細胞增殖。CCK8結(jié)果顯示，siRNA-Notch1+AngⅡ組（10、20、40 nmol/L）A450值分別為 0.53 ± 0.06，0.83 ± 0.03，1.03 ± 0.03，與siRNA-NC+ Ang Ⅱ?qū)φ战M（0.97±0.06，1.43±0.06，1.73±0.06）比較降低（P＜ 0.01）。表明 Ang Ⅱ可能是通過促進Notch1的表達促進肝星狀細胞增殖。（表3）

五、干擾Notch1對AngⅡ的肝星狀細胞蛋白表達的影響

AngⅡ 40 nmol/L處理 24 h后，AngⅡ組Notch1，HES1和Sox2蛋白表達水平分別為2.83±0.15、2.20±0.10和 1.17±0.06，分別與正常對照組 1.07±0.12、1.06±0.11和 0.57±0.06比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）；Notch1敲低組（AngⅡ+siRNA-Notch1）Notch1，HES1 和 Sox2蛋白表達水平分別為 1.47±0.12、0.77±0.06和0.50±0.10，分別與AngⅡ組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）（圖2和表4）。這表明干擾Notch1可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的Sox2蛋白表達，表明AngⅡ可能通過激活Notch1/Sox2信號軸促進細胞增殖。

表1 不同濃度AngⅡ處理后CCK8檢測LX2細胞A450值比較（± s）

表1 不同濃度AngⅡ處理后CCK8檢測LX2細胞A450值比較（± s）

注：與 NC 組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01

NC 3 0.57±0.05 5 nmol/L 3 0.72±0.03*10 nmol/L 3 0.88±0.07**20 nmol/L 3 0.98±0.07**40 nmol/L 3 1.08±0.07**80 nmol/L 3 1.23±0.07**F值 45.76 P值 ＜ 0.01

表2 不同濃度AngⅡ處理后消化法檢測LX2細胞羥脯氨酸濃度（mg/L，± s）

表2 不同濃度AngⅡ處理后消化法檢測LX2細胞羥脯氨酸濃度（mg/L，± s）

注：與NC組比較，**P ＜ 0.01

分組 樣本數(shù) 羥脯氨酸濃度NC 3 1.90±0.10 10 nmol/L 3 2.60±0.20**20 nmol/L 3 3.47±0.25**40 nmol/L 3 4.17±0.21**F值 75.18 P值 ＜ 0.01

圖1 AngⅡ?qū)Ω涡菭罴毎鸑otch1蛋白表達的影響

表3 不同濃度AngⅡ誘導(dǎo)Notch1干擾前后的肝星狀細胞增殖率A450的變化（nmol/L，± s）

表3 不同濃度AngⅡ誘導(dǎo)Notch1干擾前后的肝星狀細胞增殖率A450的變化（nmol/L，± s）

分組 樣本數(shù)不同濃度0 10 20 40 siRNA-NC 組 3 0.47±0.06 0.97±0.06 1.43±0.06 1.73±0.06 siRNA-Notch1 組 3 0.45±0.05 0.53±0.06 0.83±0.03 1.03±0.03 t 值 9.19 16.09 20.09 P值 0.0008 ＜ 0.01 ＜ 0.01

表4 干擾Notch1AngⅡ誘導(dǎo)的肝星狀細胞蛋白表達的變化（ ± s）

表4 干擾Notch1AngⅡ誘導(dǎo)的肝星狀細胞蛋白表達的變化（ ± s）

注：與NC組比較，aP ＜ 0.01；與AngⅡ組比較，bP ＜ 0.01；Notch1相對表達量：Notch/GAPDH；HES1相對表達量：HES1/GAPDH；Sox2相對表達量：Sox2/GAPDH

分組 樣本數(shù) Notch1相對表達量 HES1相對表達量 Sox2相對表達量NC 組 3 1.07±0.12 1.06±0.11 0.57±0.06 Ang Ⅱ組 3 2.83±0.15a 2.20±0.10a 1.17±0.06a AngⅡ +siRNA-Notch1組 3 1.47±0.12b 0.77±0.06b 0.50±0.10b F值 154.5 192.9 72.8 P 值 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01

圖2 干擾Notch1和AngⅡ?qū)θ烁涡菭罴毎鞍妆磉_的影響

討 論

肝星狀細胞是肝臟特異性的間充質(zhì)細胞，在肝臟生理和纖維發(fā)生中起著重要作用。它們位于Disse空間內(nèi)并與竇狀內(nèi)皮細胞和肝上皮細胞保持密切的相互作用[8]。越來越多的研究表明肝星狀細胞在肝發(fā)育和再生過程中對其他肝細胞類型的分化，增殖和形態(tài)發(fā)生有著深遠的影響。研究表明，肝星狀細胞的活化與肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移以及肝纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9]。大量研究表明，減緩或阻止肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展可預(yù)防肝硬化和肝癌的發(fā)生[10]。肝星狀細胞是肝細胞外基質(zhì)的主要來源，激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞樣細胞，因此，肝星狀細胞活化和增生是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[11]。本研究以人源性肝星狀細胞LX2為細胞模型，研究肝纖維化發(fā)生發(fā)展的機制。

AngⅡ由血管緊張素Ⅰ在酶的作用下水解生成的激素，是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的主要活性物質(zhì)[12]。AngⅡ參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，成為篩選藥物的重要靶點，對心血管、肝病等診斷和治療有重要意義[13-14]。推測AngⅡ?qū)Ω涡菭罴毎簿哂酗@著的影響，基于該推論，通過CCK8檢測了AngⅡ?qū)Ω涡菭罴毎鲋车挠绊?。結(jié)果顯示AngⅡ能夠促進肝星狀細胞LX2細胞增殖，這與之前的研究結(jié)果一致，表明AngⅡ可能通過激活肝星狀細胞促進肝纖維化的生成。

羥脯氨酸在膠原蛋白中占13.4﹪，在彈性蛋白中占極少量，其它蛋白中均不存在，因此羥脯氨酸的含量能反映細胞或者組織的膠原蛋白情況[15]。細胞分泌膠原量增加易導(dǎo)致細胞外基質(zhì)大量沉積，導(dǎo)致纖維化疾病的發(fā)生[16]。大量研究表明，肝星狀細胞分泌膠原含量的升高是肝纖維化發(fā)展的重要機制之一。檢測了AngⅡ?qū)Ω涡菭罴毎z原合成的影響。結(jié)果顯示AngⅡ能夠促進肝星狀細胞膠原合成，進一步提示AngⅡ可能參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。

Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路由Notch受體、配體和結(jié)合蛋白三部分組成。Notch信號通路是一條影響細胞增殖和分化的一條重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，幾乎涉及所有細胞的增殖和分化活動，在調(diào)節(jié)細胞分化、細胞干性及一系列生理、病理過程中都起重要作用[17]。眾多研究發(fā)現(xiàn)Notch1信號具有促腫瘤作用，在腫瘤組織中的表達量比正常組織多[18]。SOX2（sex determining region Y-box 2）是一種轉(zhuǎn)錄因子SOX家族的成員，該蛋白質(zhì)家族擁有高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，含有大約80個氨基酸的HMG，對維持未分化胚胎干細胞的自我更新或多能性至關(guān)重要[19]。SOX2與癌癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，研究表明SOX2可能與結(jié)直腸癌和乳腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[20]。本研究結(jié)果顯示，AngⅡ在促進肝星狀細胞增殖的過程中，Notch1的蛋白表達升高，而通過siRNA敲低Notch1的蛋白表達可以抑制AngⅡ誘導(dǎo)的肝星狀細胞增殖，且抑制Sox2的蛋白表達水平。表明AngⅡ?qū)Ω涡菭罴毎鲋车恼{(diào)控是通過調(diào)控Notch1/Sox2信號軸來實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究證實了Notch1是AngⅡ下游重要靶點之一，AngⅡ通過激活Notch1/Sox2信號軸促進人肝星狀細胞增殖。AngⅡ是如何影響Notch1的表達及作用機制還需要進一步研究。本課題研究結(jié)果有助于了解AngⅡ和Notch1在肝纖維化中的作用，為肝纖維化的治療提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。