国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx

維持人胚胎干細(xì)胞多能性順式作用元件的篩選

2021-05-12 02:24:56孫夢(mèng)瑤劉思琪周凡琦馬艷妮
關(guān)鍵詞:誘導(dǎo)型能性流式

孫夢(mèng)瑤,劉思琪,周凡琦,馬艷妮,余 佳

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100005)

人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells,hESCs)是一類源于人囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán),經(jīng)過(guò)體外分離純化及培養(yǎng),所得到的穩(wěn)定的多能干細(xì)胞,可在適當(dāng)?shù)臈l件下分化形成體內(nèi)各種類型的細(xì)胞,因具有潛在的再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景而被廣泛研究[1]。多能性是hESCs的重要特征之一,以O(shè)CT4、NANOG、SOX2等為代表的一系列轉(zhuǎn)錄因子,在維持hESCs多能性上發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[2]。目前,對(duì)于參與維持多能性基因表達(dá)的順式作用元件及染色質(zhì)高級(jí)構(gòu)象,仍不是十分清楚。例如,哪些增強(qiáng)子與絕緣子通過(guò)發(fā)揮順式作用影響hESCs的多能性等,因此有待進(jìn)一步研究和揭示。

成族規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)基因編輯技術(shù)為實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的基因功能篩選提供良好的解決方案,通過(guò)構(gòu)建CRISPR文庫(kù),感染目的細(xì)胞,以細(xì)胞某種表型變化作為檢測(cè)和篩選手段,分離得到具有特殊表型的細(xì)胞,測(cè)序得到其中的基因敲除信息[3-5]。由于CRISPR關(guān)聯(lián)因子(CRISPR associated, Cas)9,也叫“Cas9蛋白”的持續(xù)性表達(dá)可能會(huì)對(duì)hESC的多能性產(chǎn)生影響[6],因此首先構(gòu)建了誘導(dǎo)型的Cas9穩(wěn)定表達(dá)株,再通過(guò)感染CRISPR文庫(kù),以O(shè)CT4的表達(dá)水平作為多能性的衡量標(biāo)準(zhǔn),通過(guò)流式分析,發(fā)現(xiàn)存在基因敲除后多能性下降的hESC群體。通過(guò)成功創(chuàng)建該種方法,可以獲得影響hESC多能性的順式作用元件的信息,為進(jìn)行下一步的功能與機(jī)制研究做好鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料

hESC(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院石莉紅課題組)。hESC培養(yǎng)試劑:mTesR1培養(yǎng)基、RelesR、accutase和dispase(Stem Cell公司);Matrigel(Corning公司)。HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)試劑:DMEM培養(yǎng)基(Corning公司);胎牛血清(Gibco公司);pcw-Cas9質(zhì)粒(Addgene公司);流式抗體:human-anti OCT4 流式抗體和human-anti SSEA4流式抗體(BD公司)。藥物:強(qiáng)力霉素(doxcycline,DOX,TaKaRa公司);嘌呤霉素(puromycin,puro)和殺稻瘟菌素(blasticidin,BSD,Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)hESCs細(xì)胞:使用mTesR1培養(yǎng)基培養(yǎng)hESC,一般培養(yǎng)于matrigel包被的6孔板上,每孔使用500 μL RelesR按1∶6~1∶10比例進(jìn)行傳代,每4~7 d傳代1次。

1.2.2 誘導(dǎo)型Cas9穩(wěn)定表達(dá)株的獲?。簩cw Cas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝,高速離心收集病毒沉淀。使用病毒感染hESC,48 h后puro篩選得到感染成功的細(xì)胞。藥篩后的細(xì)胞使用accutase消化酶進(jìn)行單細(xì)胞傳代,待小克隆長(zhǎng)成之后,使用dispase消化并在顯微鏡下挑取單克隆于24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。至單克隆增殖成穩(wěn)定細(xì)胞株后,對(duì)培養(yǎng)得到的細(xì)胞進(jìn)行Cas9蛋白表達(dá)鑒定,從而得到誘導(dǎo)型Cas9穩(wěn)定表達(dá)株(induced Cas9-hESC,iCas9-hESC)。

1.2.3 多能性基因相關(guān)順式作用元件的獲?。涸贜CBI數(shù)據(jù)庫(kù)中,得到15個(gè)多能性基因的基因組位置(OCT4、KLF4、NANOG、SOX2、DPPA5、DNMT3L、REX1、KLF5、KLF2、DPPA2、STELLA、HORMAD1、MAEL、TFCP2L1和UTF1)。分別在每個(gè)基因位置上下游100 Mb(1 Mb=1 000 kb)內(nèi)篩選其中的增強(qiáng)子與絕緣子,作為候選順式作用元件研究對(duì)象,確定其起始位置。

1.2.4 CRISPR文庫(kù)的構(gòu)建:以候選順式作用元件的起始位置為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)gRNA(guide RNA),每個(gè)候選靶點(diǎn)設(shè)計(jì)3條gRNA,構(gòu)建雙gRNA基因敲除的慢病毒載體。1個(gè)載體中包含2個(gè)U6啟動(dòng)子,分別表達(dá)1條gRNA[7],載體上同時(shí)帶有mcherry熒光標(biāo)記和BSD抗性篩選標(biāo)記。

1.2.5 CRISPR文庫(kù)感染hESCs:CRISPR文庫(kù)在MOI(multiple of infection)=0.5時(shí)感染hESCs,保證1個(gè)細(xì)胞中只進(jìn)入1對(duì)gRNA。感染文庫(kù)48 h后細(xì)胞進(jìn)行BSD藥物篩選,藥物篩選7 d后,加入2 ng/mL DOX(Doxcycline)誘導(dǎo)Cas9蛋白表達(dá),Cas9蛋白表達(dá)7 d后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作[8]。

1.2.6 流式抗體染色和分析:對(duì)CRISPR文庫(kù)編輯后的hESCs進(jìn)行OCT4流式抗體染色,染色方法為,PBS清洗細(xì)胞,細(xì)胞使用4%多聚甲醛固定10 min,0.1% T×100通透10 min,流式抗體染色30~45 min,上機(jī)分析[9]。

2 結(jié)果

2.1 iCas9-hESC特征鑒定

成功構(gòu)建的hESC誘導(dǎo)型Cas9穩(wěn)定表達(dá)株(iCas9-hESC),可以在DOX誘導(dǎo)后1 d內(nèi)高水平表達(dá)Cas9蛋白(圖1A)。選擇OCT4和SSEA4兩個(gè)基因衡量干細(xì)胞多能性,研究發(fā)現(xiàn),在hESCs向中胚層誘導(dǎo)過(guò)程的第2天和第4天,OCT4和SSAE4的表達(dá)水平持續(xù)下降(圖1B)。當(dāng)iCas9-hESC表達(dá)Cas9蛋白時(shí),OCT4和SSEA4的表達(dá)水平并未發(fā)生顯著變化(圖1C)。

A.expression of Cas9 protein one day after Dox induction; B.with the induction of hESCs to the mesoderm, the expression levels of OCT4 and SSEA4 continued to decline; C.when iCas9-hESC expressed Cas9 protein, the expression levels of OCT4 and SSEA4 did not change significontly圖1 iCas9-hESC特征鑒定Fig 1 iCas9-hESC characterization

2.2 成功構(gòu)建CRISPR文庫(kù)

以候選順式元件的兩端作為靶點(diǎn),分別設(shè)計(jì)3對(duì)gRNA進(jìn)行敲除,通過(guò)兩步克隆將帶有 gRNA 的片段插入到慢病毒骨架上,最終得到由 2.7×107個(gè)單克隆組成的慢病毒文庫(kù)。合成的gRNA文庫(kù)覆蓋率為99.97%,且gRNA豐度的分布符合正態(tài)分布,整體分布呈現(xiàn)比較均勻的狀態(tài)(圖2)。

圖2 CRISPR文庫(kù)質(zhì)控Fig 2 CRISPR library quality control

2.3 使用CRISPR文庫(kù)感染iCas9-hESC

在MOI=0.5時(shí)將CRISPR文庫(kù)感染進(jìn)iCas9-hESC,進(jìn)行BSD藥物篩選后仍有細(xì)胞存活,對(duì)感染文庫(kù)后的細(xì)胞進(jìn)行流式分析,可檢測(cè)到mcherry的表達(dá)(圖3)。

圖3 細(xì)胞感染CRISPR文庫(kù)后mcherry的表達(dá)Fig 3 Expression of mcherry after cell infected with CRISPR library

2.4 CRISPR文庫(kù)編輯后hESCs多能性發(fā)生變化

流式分析發(fā)現(xiàn)確實(shí)存在一群細(xì)胞,在CRISPR文庫(kù)感染后OCT4表達(dá)水平下降[12]。并可通過(guò)流式分選將這批細(xì)胞分析出來(lái),進(jìn)行后續(xù)的基因敲除鑒定(圖4)。

圖4 hESCs多能性的變化Fig 4 Changes in hESCs pluripotency

3 討論

CRISPR技術(shù)是目前進(jìn)行基因編輯的主要方法之一,通過(guò)構(gòu)建CRISPR文庫(kù),可以對(duì)一系列基因進(jìn)行敲除,并進(jìn)一步通過(guò)表型的變化篩選出功能性基因。本文主要研究以增強(qiáng)子和絕緣子為代表的順式元件對(duì)hESCs多能性的影響,順式元件雖然不編碼蛋白質(zhì),但是可以參與基因的表達(dá)調(diào)控,通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄進(jìn)而影響蛋白編碼基因的表達(dá)水平[13-14]。多能性是hESCs的特殊特征,但在hESCs中特異性影響多能性的順式元件的研究尚不全面。因此本工作針對(duì)hESCs中多能性相關(guān)的順式元件構(gòu)建CRISPR文庫(kù),旨在篩選出潛在影響hESCs多能性的順式作用元件。

首先通過(guò)構(gòu)建誘導(dǎo)型Cas9穩(wěn)定表達(dá)株(iCas9-hESC),排除Cas9的持續(xù)性表達(dá)對(duì)hESCs多能性的影響,并通過(guò)OCT4和SSEA4兩種多能性marker的表達(dá)水平,鑒定出iCas9-hESC的多能性狀態(tài)未收到影響。接下來(lái)對(duì)候選順式元件構(gòu)建雙gRNA CRISPR敲除文庫(kù),在文庫(kù)成功感染iCas9-hESC后,誘導(dǎo)Cas9蛋白表達(dá),排除Cas9蛋白表達(dá)影響CRISPR文庫(kù)感染效率的可能性。接下來(lái)對(duì)基因編輯后的細(xì)胞,通過(guò)OCT4表達(dá)水平的變化,成功區(qū)分出多能性下降和不變的hESCs,證明確實(shí)存在影響hESCs多能性的順式作用元件。

本工作建立了在hESCs中進(jìn)行大規(guī)模功能性基因組元件篩選的可行性方案,以本工作為基礎(chǔ),可通過(guò)流式分選得到多能性下降的細(xì)胞群體,對(duì)其中的gRNA進(jìn)行測(cè)序分析,即可確定敲除后影響hESCs多能性的重要基因元件。通過(guò)建立篩選方案,也可應(yīng)用于其他DNA序列的功能性篩選,具有較強(qiáng)的應(yīng)用性與普適性。

猜你喜歡
誘導(dǎo)型能性流式
施硅提高玉米抗蚜性的組成型和誘導(dǎo)型生理代謝機(jī)制
“V得/不過(guò)來(lái)”結(jié)構(gòu)的語(yǔ)義分析
輻流式二沉池的結(jié)構(gòu)優(yōu)化研究
試論“信息型”“誘導(dǎo)型”說(shuō)明文本的翻譯策略
戲劇之家(2019年4期)2019-03-28 10:50:40
微球測(cè)速聚類分析的流式液路穩(wěn)定性評(píng)估
基于調(diào)查問(wèn)卷的泰國(guó)華裔學(xué)生兩種能性結(jié)構(gòu)習(xí)得研究
多藥耐藥性腫瘤動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)
自調(diào)流式噴管型ICD的設(shè)計(jì)與數(shù)值驗(yàn)證
流式在線直播視頻的采集
河南科技(2015年8期)2015-03-11 16:23:41
利用化學(xué)小分子實(shí)現(xiàn)人胚胎干細(xì)胞多能性狀態(tài)的轉(zhuǎn)化*
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
石泉县| 陆丰市| 旬邑县| 师宗县| 济南市| 玉屏| 博白县| 闵行区| 大足县| 马公市| 林州市| 绥阳县| 肃宁县| 文水县| 芜湖县| 社旗县| 兴国县| 宝清县| 武义县| 寿阳县| 岐山县| 岳阳县| 新密市| 绥中县| 柞水县| 新蔡县| 葫芦岛市| 和龙市| 潼南县| 高密市| 万荣县| 防城港市| 新安县| 都兰县| 利川市| 永登县| 长海县| 繁峙县| 陵川县| 娄烦县| 伽师县|