任宇 梁紅宇 楠吉桑漠 劉曉玲

作者單位：010017 呼和浩特，內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心

近年來糖尿病發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，已成為繼心血管疾病、腫瘤之后第三大慢性非傳染性疾病，嚴重影響人類健康而且給國家和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔。目前全世界約有3.76億糖尿病患者，到2030年預(yù)計這一數(shù)字將達到4.49億[1]。在我國目前約有9 400萬糖尿病患者，糖尿病平均發(fā)病率達到4.8﹪以上，已成為目前糖尿病患病人數(shù)最多的國家。

隨著科技的發(fā)展、醫(yī)學的進步干細胞替代治療成為糖尿病治療一項非常重要的策略之一。其中干細胞來源主要包括：（1）全能型胚胎干細胞和誘導型多能干細胞，它們具有分化為胰島β細胞的能力但受到倫理學的限制且在體內(nèi)容易形成畸胎瘤[2]；（2）專能型胰島干細胞，能夠分化為功能成熟的胰島β細胞，但目前還沒有找到對其進行高效分離、純化及鑒定的方法[3]；（3）多能型間充質(zhì)干細胞，來源豐富、易于培養(yǎng)，但增殖能力有限而且還存在分化效率低等問題[4-5]。

骨骼肌衛(wèi)星細胞（muscle-derived satellite cells，MDSCs）是存在于骨骼肌肌膜和基底膜之間的多能干細胞，取材方便、分離方法簡單易操作，體外增殖能力強且基因穩(wěn)定性高[6]，細胞免疫原性低適合細胞移植且無致瘤性，基于以上優(yōu)點MDSCs被認為是未來用于干細胞治療的理想種子細胞。在體外培養(yǎng)MDSCs的研究中發(fā)現(xiàn)MDSCs能夠向培養(yǎng)液中分泌趨化因子受體及多種細胞因子如表皮生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、成纖維生長因子等，趨化因子受體能夠促使MDSCs向受損的胰島遷移。以上研究結(jié)果表明，利用MDSCs移植促進胰島β細胞再生的方法是可行的[7]。在前期探索中發(fā)現(xiàn)，MDSCs在體外可以定向分化為成骨細胞、成熟肌管細胞、神經(jīng)細胞等。低糖DMEM+DMSO誘導3 d后MDSCs開始變?yōu)閳A形并聚集成為胰島樣的細胞團塊，更換高糖DMEM誘導10 d后，部分細胞雙硫腙染色陽性，說明它們很有可能就是胰島樣細胞團，但是陽性細胞率較低，說明誘導方法仍需進一步改善。因此，本研究將探討如何高效率地將MDSCs誘導分化為胰島素生成細胞（insulin producing cells，IPCs）及MDSCs-IPCs功能的完整性，這將為MDSCs移植治療糖尿病提供新方法、新思路。

材料與方法

一、主要材料

1.實驗動物：免疫缺陷（NOD-SCID）小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。SPF級Sprague-Dawley（SD）大鼠購自內(nèi)蒙古大學哺乳動物繁殖生物學與生物技術(shù)重點實驗室。大鼠胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESCs）和 β 細胞購自中科院上海細胞庫。

動物倫理聲明：本文中所有動物實驗由內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會批準，同時遵循國際醫(yī)學科學組織理事會頒布的《涉及動物的生物醫(yī)學研究的國際指導原則》。

2.試驗試劑及耗材：Ⅳ型膠原酶、Ⅰ型膠原酶、0.25﹪胰蛋白酶、明膠、DMSO等購買于美國Sigma公司；DMEM、PMI、PBS、B27等購買于美國Invitrogen公司；FBS、HS購買于美國Gibco公司；Insulin等抗體購買于美國Abcam公司；100 mm培養(yǎng)皿、6孔細胞培養(yǎng)板、凍存管等均購自美國Corning 公 司；KGF、Noggin、GLP-1、IGF-I、 HGF等細胞因子均購自美國BD公司。

二、方法

1.MDSCs體外分離、純化與培養(yǎng)：無菌條件下取10日齡大鼠腿部骨骼肌組織5 g并盡可能剔除血液、結(jié)締及脂肪組織等雜物。首先顯微鏡下用眼科剪將組織剪至1 ～ 2 mm大小，分裝入50 ml無菌無酶離心管中，隨后加入與組織等體積的含0.1﹪Ⅳ型膠原酶的PBS。然后將離心管置于搖床中37 ℃恒溫震蕩酶解；60 min后100×g離心5 min棄上清液并加入0.25﹪胰蛋白酶于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置孵育，20 min后加入FBS中止消化反應(yīng)并離心棄上清液。最后用MDSCs生長培養(yǎng)基（DMEM/F12+20﹪ FBS+10﹪HS+1﹪青/鏈霉素）重懸細胞沉淀并經(jīng)200目細胞篩網(wǎng)過濾，過濾后的細胞懸液經(jīng)離心后接種于細胞培養(yǎng)板并采用Gharaibeh等[8]報道的差速貼壁法純化大鼠MDSCs。

2.MDSCs標記蛋白鑒定：以1×105個/ml的密度將純化后的MDSCs接種于24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，待其生長至80﹪匯合時利用免疫組織化學的方法鑒定 MDSCs中 MyoD1、Desmin、PAX7、Myf5和α-Sarcomeric Actinin的表達。其中，二抗為FITC標記，DAPI為細胞核染料，PBS替代一抗作為陰性對照，共聚焦顯微鏡下同時觀察實驗組和對照組細胞染色情況。

3.MDSCs 致瘤性分析：為了證明MDSCs在體內(nèi)應(yīng)用的安全性首先進行畸胎瘤實驗。首先分別收集第5代的大鼠ESCs和MDSCs，PBS重懸細胞沉淀至1×107個/ml，然后取0.5 ml細胞懸液分別注射到6周齡NOD-SCID小鼠腋背部皮下，每組設(shè)10個重復。3 ～ 4周后，檢測畸胎瘤的形成情況并對瘤體進行HE染色。

4.MDSCs體外誘導分化為胰島素分泌細胞技術(shù)體系的建立：（1）成胰誘導：MDSCs接種于100 mm培養(yǎng)皿中，待其生長至70﹪以上匯合時更換為成胰誘導培養(yǎng)基。成胰誘導第一階段培養(yǎng)基 RPMI+25 ng/ml Wnt3a+100 ng/ml Activin A 培養(yǎng)1 d后于RPMI+0.2﹪FBS+100 ng/ml Activin A繼續(xù)培養(yǎng)2 d此時第一階段的誘導完成。接著進行第二階段的誘導，更換誘導培養(yǎng)基為RPMI+2﹪FBS+25 ng/ ml KGF（Keratinocyte Growth Factor）培養(yǎng)3 d。第三階段的誘導培養(yǎng)基為 DMEM+1﹪B-27 + 2 u mol/L Retinoic Acid + 0.25 u mol/L Cyclopamine + 50 ng/ml Noggin，誘導 3 d 后進入第四階段。第四階段的誘導培養(yǎng)基為 DMEM+1﹪B-27+10 m mol/L Nictinamide+100 nmol/L GLP-1（Preproglucagon 72-107 amide），繼續(xù)誘導 3 d。最后進入第五階段更換誘導培養(yǎng)基為 IMDM+1﹪B27+10 m mol/L Nictinamide+100 n mol/L GLP- 1+50 ng/ml IGF-1（Insulin-like Growth Factor 1）+50 ng/ml HGF（HumanHepatocyte Growth Factor），繼續(xù)誘導培養(yǎng)3 d。只加入MDSCs基礎(chǔ)培養(yǎng)基細胞作為對照組與誘導組在同一條件下進行培養(yǎng)。（2）雙硫腙（DTZ）染色：成胰誘導結(jié)束后棄掉原培養(yǎng)基，誘導組和對照組細胞同時加入100 : 1（培養(yǎng)基：STZ貯存液）DTZ并置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育，15 min后棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3次，顯微鏡下觀察不同組別細胞的著色情況。（3）Q-PCR和Western Blot檢測C-peptide和Insulin的表達：以β細胞為對照，GAPDH為內(nèi)參基因，通過Q-PCR和Western Blot分別檢測MDSCs-IPCs中C-peptide和Insulin mRNA及蛋白相對表達量。（4）MDSCs-IPCs生物學功能鑒定：以β細胞為對照，首先分別將4×105MDSCs-IPCs或β細胞置于24孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入1640培養(yǎng)液平衡培養(yǎng)，12 h后吸出培養(yǎng)液并用無糖無血清1640培養(yǎng)液清洗3次，30 min后吸出培養(yǎng)液并加入低糖、無血清1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后留取上清液并加入高糖、無血清1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后留取上清液，用ELISA試劑盒檢測不同組別胰島素分泌情況，每組設(shè)3個重復孔，重復3次。

三、統(tǒng)計學分析方法

采用SPSS Statistics 19統(tǒng)計軟件，SUVmax數(shù)據(jù)以± s表示，β細胞和MDSCs-IPCs兩組間SUVmax比較采用兩樣本t檢驗，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、細胞形態(tài)

經(jīng)Gharaibeh差速貼壁法初次接種細胞2 h后，大部分雜細胞均已貼壁，此時吸出培養(yǎng)液及其中未貼壁細胞并再次移入明膠處理后的6孔細胞培養(yǎng)板中貼壁培養(yǎng)，二次接種的大多數(shù)細胞即為MDSCs，呈圓形、折光性強（圖1a）。二次接種細胞培養(yǎng)12 ～ 14 h后開始貼壁且呈現(xiàn)梭形或多角形，仍有部分細胞未貼壁，可能為死細胞（圖1b）；二次接種培養(yǎng)48 ～ 72 h后細胞完全貼壁并逐漸延展為典型的多角形或梭形（圖1c）。以上結(jié)果表明，MDSCs貼壁時間為48 ～ 72 h，非MDSCs雜細胞在貼壁時間為2 h，通過細胞貼壁時間差即可去除雜細胞保證原代MDSCs的純度。

圖1 倒置顯微鏡下觀察不同時期原代 MDSCs形態(tài)特征（×100）

二、MDSCs標記蛋白的表達

本研究中分離、純化得到的MDSCs經(jīng)免疫組化檢測均表達 MyoD1、Desmin、PAX7、Myf5和α-Sarcomeric Actinin且蛋白密集于胞漿中，細胞核位于細胞中央DAPI復染呈藍色，未檢測到上述蛋白的表達（圖2）。

三、MDSCs 致瘤性

細胞注射3 ～ 4周后，觀察到注射ESCs后NOD - SCID小鼠皮下畸胎瘤形成率為85﹪（圖3），而注射MDSCs組小鼠皮下無畸胎瘤形成。經(jīng)石蠟切片、HE染色后發(fā)現(xiàn)，畸胎瘤內(nèi)部可形成類似外胚層來源的表皮組織、類似中胚層來源的肌肉組織和類似內(nèi)胚層來源的腺體組織。結(jié)果表明與ESCs相比，應(yīng)用MDSCs進行自體細胞治療在體內(nèi)沒有致癌作用，更加可靠、更加安全。

四、MDSCs 體外誘導分化為IPCs

圖2 倒置顯微鏡下觀察MDSCs免疫組化染色情況（綠色熒光染色，×100）

圖3 倒置顯微鏡下觀察畸胎瘤三胚層分化情況（HE染色，×200）

在成胰誘導第一階段MDSCs細胞形態(tài)無明顯變化，仍為多角形或梭形且細胞核清晰可見。在誘導第二階段MDSCs迅速增殖并逐漸向一個方向聚集，聚集后的細胞團折光性明顯增強。誘導第三階段細胞形態(tài)發(fā)生改變，胞質(zhì)減少、由典型的成纖維細胞樣轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)皮細胞樣呈現(xiàn)圓形或橢圓形，細胞體積變小、邊緣呈鋸齒狀并相互嵌合。第四階段細胞的形態(tài)與第三階段對比無明顯變化，細胞繼續(xù)成簇增殖。第五階段，簇狀細胞團增多，呈現(xiàn)立體狀，形態(tài)接近β細胞團。經(jīng)DTZ染色后大部分MDSCs-IPCs細胞團被染成猩紅色，部分單個細胞也被染成猩紅色，證明胰島素分泌細胞的存在（圖4）。Insulin免疫組化染色陽性。對照組細胞形態(tài)無明顯改變，DTZ染色陰性，Insulin免疫組化染色陰性。

圖4 MDSCs誘導分化為IPCs（×100，NIKON A1）

Q-PCR結(jié)果顯示成胰誘導后MDSCs-IPCs中C-peptide和Insulin mRNA表達量分別是β細胞的0.73 倍（P＞ 0.05）和 0.79 倍（P＞ 0.05），差異無統(tǒng)計學意義。Western Blot結(jié)果同樣顯示MDSCs-IPCs中有 C-peptide和 Insulin蛋白的表達（圖 5）。表明成胰誘導后MDSCs-IPCs可表達C-peptide和Insulin蛋白，且表達量較β細胞差異無統(tǒng)計學意義。

圖5 C-peptide和Insulin在成胰誘導后MDSCs-IPCs中的表達

胰島素釋放實驗：β細胞和MDSCs-IPCs在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后，分別用5.6 mmol/ L葡萄糖條件培養(yǎng)和16.7 nmlol/L葡萄糖的條件培養(yǎng)基刺激培養(yǎng)2 h后β 細胞和MDSCs- IPCs胰島素分泌量分別為 [（21.3±4.1）mU/L]和 [（16.1±3.7） mU/ L]，差異具有統(tǒng)計學意義（t=1.63，P＜ 0.05），[（60.5±9.3） mU/ L]和 [（40.9±7.3）mU/L]，差異具有統(tǒng)計學意義（t=1.77，P＜ 0.01）。

討 論

研究表明，糖尿病是全世界人類死亡的第三大原因。胰島素替代療法是目前已經(jīng)被認可的一種治療糖尿病的方法。然而，這種治療方法有許多缺點，前景并不樂觀。因此，尋找β細胞替代物或不同來源的β細胞成為未來治療糖尿病的必然趨勢。干細胞是具有多向分化潛能的一類細胞，它們來源豐富、增殖能力強，易于從供體中獲取，具有免疫赦免性，是胰島β細胞的理想來源。近年來，越來越多的研究表明，MDSCs可以被誘導為形態(tài)和結(jié)構(gòu)與胰島形態(tài)非常相似的胰島β型細胞[6,9]，但未對其功能進行進一步說明。在研究中，對照組細胞也能形成細胞簇，但這些細胞形狀不規(guī)則、發(fā)散，雙硫腙染色陰性；誘導組細胞雙硫腙染色陽性，說明細胞中存在胰島素，與前人的研究結(jié)果相似。在生理條件下，胰腺中的胰島素產(chǎn)量逐漸增加，這是因為胰腺中的胰腺干細胞補充了β細胞進一步增加了胰島素的產(chǎn)量[10]。

Peck等[11]研究團隊報道在成胰誘導培養(yǎng)基中加入12 mmoL尼克酰胺可以提高骨骼肌衛(wèi)星細胞體外誘導形成胰島素生成細胞的效率。同時，在誘導培養(yǎng)液中添加細胞活性素A、肝細胞生長因子以及β細胞素，他們能夠不同程度促進胰島β細胞的分化。在體外培養(yǎng)的胰島β細胞中添加血管內(nèi)皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子能夠促進其增殖，添加β細胞素或胰島素樣生長因子而不添加血管內(nèi)皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子，卻促使單個胰島細胞發(fā)生聚集成為胰島樣細胞團。Pdxl在這一變化過程中起到關(guān)鍵性的作用。研究結(jié)果表明，在體外培養(yǎng)液中添加胰島素樣生長因子1能夠誘導MDSCs充分表達Pdxl，從而促進MDSCs分化為有功能的β細胞[12]。Chien等[13]的研究結(jié)果同樣表明在體外一定條件下血管內(nèi)皮生長因子能夠促進骨骼肌衛(wèi)星細胞分化為胰島β細胞，同時高糖環(huán)境可以促進胰島β細胞增殖。另外，無血清或低血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)液同樣可以誘導骨骼肌衛(wèi)星細胞分化成為類胰島β細胞[14]，但就其體外分泌胰島素的能力有待深入探究。

劉富強等[15]研究結(jié)果證實在胰腺β細胞受損部位會聚集表達綠色熒光蛋白的肌源性內(nèi)皮細胞，該研究組推測移植后的綠色熒光蛋白標記MDSCs很有可能通過分化為血管上皮細胞從而促進胰腺再生，這一研究結(jié)果表明移植MDSCs治療糖尿病具有一定的可行性。Fujimaki等[16]在移植MDSCs治療糖尿病大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，通過將正常大鼠胰腺的β細胞與MDSCs間接共培養(yǎng)能夠促使MDSCs定向分化為胰島樣β細胞，結(jié)果證明體外間接共培養(yǎng)法可以使MDSCs定向誘導分化為胰島樣β細胞，將誘導后的MDSCs移植到糖尿病大鼠體內(nèi)能夠緩解糖尿病大鼠的癥狀。但是在這一共培養(yǎng)過程中，細胞微環(huán)境復雜，細胞變化難以監(jiān)控，作用機制不清楚，難以應(yīng)用于臨床。本研究中，利用不同的誘導因子在體外直接將MDSCs誘導分化為IPCs，并對MDSCs-IPCs形態(tài)、蛋白表達及功能進行了全方位的評價。在離體培養(yǎng)的條件下，MDSCs-IPCs依然存在對葡萄糖刺激的反應(yīng)，說明在無神經(jīng)支配的條件下葡萄糖仍可調(diào)節(jié)胰島素的分泌。本研究結(jié)果不但證實MDSCs可以在體外分化為有功能胰島素生成細胞，而且也為糖尿病的臨床治療提供了新的研究思路和實驗依據(jù)。