張雪良 徐子琴 熊建華

自噬在急性胰腺炎(AP)發(fā)生發(fā)展中作用的研究是當(dāng)前AP基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的主要熱點之一。自噬是導(dǎo)致長壽命蛋白質(zhì)或細(xì)胞器降解的主要生物學(xué)過程。自噬小體將底物與溶酶體融合形成自噬溶酶體，進(jìn)而將底物進(jìn)行降解[1-3]。有研究發(fā)現(xiàn)，大量自噬體在壞死的胰腺炎組織區(qū)域積聚[4]。楊淑麗[5]報道，3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine3-MA，3-MA)可抑制AP大鼠引發(fā)的細(xì)胞自噬，進(jìn)而減輕胰腺病理損傷，其中caspase-3表達(dá)升高，Bcl-2表達(dá)下降，提示胰腺病理損傷減輕可能與3-MA誘發(fā)胰腺細(xì)胞自噬，促進(jìn)腺泡細(xì)胞凋亡有關(guān)。另有研究報道，自噬抑制劑渥曼青霉素可阻止雨蛙素誘導(dǎo)的胰蛋白酶原激活，在一定程度上改善AP的損傷[6]。spautin-1是一個高效的自噬抑制劑，本研究應(yīng)用spautin-1干預(yù)雨蛙素誘導(dǎo)的胰腺腺泡細(xì)胞，觀察細(xì)胞凋亡及自噬的改變，為AP診治提供實驗依據(jù)。

材料與方法

一、細(xì)胞株與試劑

AR42J細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，雨蛙素購自上海翊圣生物科技有限公司，spautin-1購自MCE公司，BGAM和乳酸脫氫酶(LDH)-細(xì)胞毒性測定試劑盒購自Sigma公司，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自BD公司，兔抗人LC3 p62、Beclin1、β-actin抗體均購自CST公司。

二、方法

1．雨蛙素誘導(dǎo)AR42J細(xì)胞的AP模型建立及分組：AR42J細(xì)胞株在含有20%胎牛血清的F-12K培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，以0.8×106個/孔密度接種于96孔板，分為對照組、100 nmol/L雨蛙素處理組(雨蛙素組)、100 nmol/L雨蛙素聯(lián)合10 μmol/L spautin-1處理組(雨蛙素+spautin-1組)，每組設(shè)3個復(fù)孔。雨蛙素干預(yù)AR42J細(xì)胞的劑量參考文獻(xiàn)[7]。

2．AR42J細(xì)胞LC3、p62、Beclin1蛋白檢測：分別取雨蛙素組培養(yǎng)0、6、12、24 h的細(xì)胞以及對照組、雨蛙素組、雨蛙素+spautin-1組培養(yǎng)24 h的細(xì)胞，用裂解液提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用ABC法定量蛋白后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞LC3、p62、Beclin1蛋白表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參。兔抗人LC3抗體1∶50稀釋，兔抗人p62、Beclin1抗體1∶100稀釋，辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG 1∶100稀釋。最后ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影，用圖像掃描軟件測定各條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比表示蛋白相對表達(dá)量。

3．胰蛋白酶活性測定：采用BGAM試劑檢測細(xì)胞胰蛋白酶活性。分別取上述各組細(xì)胞，應(yīng)用裂解液裂解細(xì)胞，與含BGAM的胰蛋白酶反應(yīng)緩沖液(10 mmol/L Tris、20 mmol/L CaCl2、pH7.4)混合后置37℃孵育30 min，上熒光儀用380 nm激發(fā)光，測定450 nm處的熒光值(A410值)。

4．AR42J細(xì)胞凋亡檢測：應(yīng)用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測。取對照組、雨蛙素組、雨蛙素+ spautin-1組培養(yǎng)24 h的細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌兩次后用250 μl的結(jié)合緩沖液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/ml。取1 ml細(xì)胞懸液，分別加入5 μl PE-Annexin V和7-AAD，輕輕渦旋混勻，室溫避光孵育15 min，上FACScan流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

5．細(xì)胞壞死檢測：取對照組、雨蛙素組、雨蛙素+spautin-1組培養(yǎng)24 h的培養(yǎng)上清，應(yīng)用LDH-細(xì)胞毒性測定試劑盒測定上清液中LDH活性，嚴(yán)格按說明書操作。以釋放到培養(yǎng)液中LDH的含量變化反應(yīng)AR42J細(xì)胞壞死情況，根據(jù)公式計算細(xì)胞壞死率。細(xì)胞壞死率(%)=培養(yǎng)液的LDH活力(培養(yǎng)液的LDH活力-存在于活細(xì)胞內(nèi)LDH活力)×100%。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、雨蛙素誘導(dǎo)AR42J細(xì)胞自噬

雨蛙素組AR42J細(xì)胞的自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62表達(dá)量以及胰蛋白酶活性均隨雨蛙素作用時間的延長逐漸增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而Beclin1表達(dá)量無顯著變化(表1，圖1)。

表1 雨蛙素處理AR42J細(xì)胞不同時間后自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量及胰蛋白酶活性的變化

注：與0 h組比較，aP<0.05

圖1 雨蛙素處理AR42J細(xì)胞0(1)、6(2)、12(3)、24(4)h時自噬相關(guān)蛋白表達(dá)變化

二、spautin-1抑制雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞自噬

對照組、雨蛙素組、雨蛙素+spautin-1組細(xì)胞LC3Ⅰ表達(dá)量分別為0.68±0.05、0.65±0.06、0.24±0.01；LC3Ⅱ為0.41±0.03、1.26±0.15、0.71±0.08；p62為0.53±0.04、1.06±0.09、0.56±0.06，雨蛙素+spautin-1組表達(dá)量較雨蛙素組顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05，圖2)，各組Beclin1表達(dá)量分別為0.42±0.05、0.55±0.08、0.48±0.06，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示spautin-1可抑制雨蛙素誘導(dǎo)AR42J細(xì)胞的自噬。

三、spautin-1抑制雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞胰蛋白酶活性

對照組、雨蛙素組、雨蛙素+spautin-1組胰蛋白酶活性分別為1.01±0.05、1.65±0.18、1.13±0.14，雨蛙素+spautin-1組較雨蛙素組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示spautin-1可抑制雨蛙素誘導(dǎo)AR42J細(xì)胞自噬障礙導(dǎo)致的胰蛋白酶原激活。

四、spautin-1促進(jìn)雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞凋亡

對照組、雨蛙素組、雨蛙素+spautin1組的細(xì)胞凋亡率分別為(3.42±0.53)%、(6.58±4.01)%、(23.64±2.12)%，雨蛙素組的細(xì)胞凋亡率較對照組顯著增加，雨蛙素+spautin-1組又較雨蛙素組顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。提示spautin-1可促進(jìn)雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞凋亡。

圖2 對照組(1)、雨蛙素組(2)、雨蛙素+spautin-1組(3)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

五、spautin-1抑制雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞壞死

對照組、雨蛙素組、雨蛙素+spautin1組的細(xì)胞壞死率分別為(1.42±0.33)%、(27.58±3.46)%、(7.64±2.12)%，雨蛙素組細(xì)胞壞死率較對照組明顯增加，而雨蛙素+spautin-1組較雨蛙素組顯著下降(P值均<0.05)。提示spautin-1可抑制雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞壞死。

討 論

早期AP發(fā)生主要包括受損的腺泡細(xì)胞和炎癥反應(yīng)誘發(fā)的胰腺實質(zhì)壞死等關(guān)鍵病理反應(yīng)過程[8]。在AP早期階段，通常在分泌后起作用的消化酶則在胰腺腺泡細(xì)胞中呈預(yù)活化狀態(tài)[9]，腺泡細(xì)胞自我消化直接導(dǎo)致胰腺損傷。然而，目前關(guān)于消化酶特別是胰蛋白酶原激活的機制仍不清楚。此外，胰腺腺泡細(xì)胞死亡方式主要有細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死，細(xì)胞凋亡被認(rèn)為主要起保護(hù)性作用[10]，而壞死則可引起全身性炎癥，導(dǎo)致遠(yuǎn)端器官損傷甚至死亡[11]。

最近研究證實，自噬阻塞引起的自噬小體聚積可能是導(dǎo)致酶原激活的關(guān)鍵因素。在乙醇與脂多糖誘導(dǎo)的AP模型中，由于炎癥組織中的局部溶酶體相關(guān)膜蛋白2(LAMP2)缺失，自噬小體和溶酶體之間的融合降低[12]，導(dǎo)致自噬小體積聚，進(jìn)而導(dǎo)致酶原激活。此外，抑制自噬流可導(dǎo)致組織蛋白酶B和組織蛋白酶C之間表達(dá)失衡，進(jìn)而刺激了雨蛙素誘導(dǎo)的AP中胰蛋白酶原激活[13]。上述研究均證實了在AP過程中自噬流會被阻斷。由此，有學(xué)者提出了AP發(fā)病機制中自噬障礙的概念[14]。自噬囊泡積聚是AP早期重要事件[15]，其中LC3Ⅱ位于自噬溶酶體內(nèi)膜上，可用于指示自噬的發(fā)生。自噬流升高導(dǎo)致LC3Ⅱ表達(dá)增加，自噬障礙導(dǎo)致LC3Ⅱ和溶酶體之間的融合降低也可上調(diào)LC3Ⅱ表達(dá)水平。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雨蛙素處理細(xì)胞后，自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62均隨著雨蛙素作用時間延長表達(dá)逐漸增加，LC3Ⅱ表達(dá)增加表明細(xì)胞發(fā)生自噬，同時p62表達(dá)也增加，說明細(xì)胞自噬起始正常，但下游不通，吞噬體與溶酶體不能融合，表明胰腺腺泡細(xì)胞AR42J中LC3Ⅱ的水平升高主要是由于雨蛙素誘導(dǎo)自噬障礙導(dǎo)致的，同時，胰腺炎自噬受損的另一個證據(jù)是自噬流正調(diào)節(jié)因子Beclin1的變化很小。本研究中雨蛙素處理后細(xì)胞LC3Ⅰ與LC3Ⅱ表達(dá)具有類似的趨勢。LC3Ⅰ在自噬障礙時被誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)[16]，因而其具有與LC3Ⅱ相似的變化趨勢。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著雨蛙素作用時間增加，細(xì)胞中胰蛋白酶活性逐漸升高。由此可知，雨蛙素誘導(dǎo)AP導(dǎo)致自噬障礙，進(jìn)而誘發(fā)胞內(nèi)胰蛋白酶原激活。本研究通過spautin-1對雨蛙素誘導(dǎo)APAR42J細(xì)胞模型的作用發(fā)現(xiàn)，spautin-1可通過阻止AP細(xì)胞的自噬障礙，進(jìn)而抑制胰腺細(xì)胞免受胰蛋白酶損傷、促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制壞死，提示spautin-1在體內(nèi)可能起到緩解胰腺炎的效果。