馬 麗， 吳曉梁, 王學莉， 伏 添， 王成立

(1漢中市3201醫(yī)院重癥醫(yī)學科， 陜西 漢中 723000； 2浙江大學第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科， 浙江 杭州 310015)

急性胰腺炎是一種常見的臨床危重疾病，是較為復雜的瀑布樣級聯(lián)反應，其起始于胰腺腺泡細胞內(nèi)相關酶的激活，炎性介質(zhì)釋放和氧自由基等都可以降低胰腺細胞的抗氧化能力，引起胰腺損傷[1-2]。胰腺腺泡細胞作為胰腺的外分泌單位，是胰腺組織的重要組成部分，參與胰腺炎病理過程[3]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是Toll樣受體蛋白家族成員之一，在中性粒細胞和巨噬細胞等多種細胞表面表達，參與細胞的生長、分化、炎癥和氧化應激等過程；另外，TLR4還參與調(diào)控腫瘤和動脈粥樣硬化等多種疾病發(fā)生[4-6]。在胰腺炎患者中TLR4普遍高表達，TLR4參與胰腺腺泡細胞損傷發(fā)生[7]。脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，在重癥胰腺炎病人發(fā)病早期，血漿中存在大量的LPS，急性胰腺炎時，LPS可以通過多種途徑誘導組織炎癥，促進急性胰腺炎的發(fā)生[8]。本實驗用LPS處理胰腺腺泡AR42J細胞，探討TLR4對LPS誘導的胰腺腺泡AR42J細胞炎癥因子分泌和細胞損傷的作用，為明確胰腺炎的發(fā)病機制提供參考。

材 料 和 方 法

1 材料

大鼠胰腺腺泡AR42J細胞購自成都正能生物技術有限責任公司。SYBR Green Realtime PCR試劑盒購自成都福際生物技術有限公司；cDNA合成第一鏈試劑盒購自Biomiga；丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量檢測試劑盒和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)含量檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)含量檢測試劑盒、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)含量檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性檢測試劑盒和過氧化氫酶(catalase，CAT)活性檢測試劑盒購自南京建成生物研究所；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)含量檢測試劑盒購自南京信帆生物技術有限公司；抗TLR4抗體購自BioVision；攜帶TLR4小干擾RNA(small interfering RNA， siRNA)的慢病毒購自吉滿生物科技(上海)有限公司。

2 方法

2.1細胞模型構建 大鼠胰腺腺泡AR42J細胞用含有雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中添加10%的胎牛血清，細胞放在CO2濃度為5%、溫度為37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。用LPS刺激構建胰腺腺泡構建細胞損傷模型。將AR42J細胞接種到6孔板中，每個孔中加2 mL細胞培養(yǎng)液，106個細胞，培養(yǎng)24 h以后，添加LPS，使LPS的終濃度為10 mg/L[9]，繼續(xù)培養(yǎng)24 h以后，用real-time PCR和Western blot測定細胞中TLR4表達的變化。

2.2Real-time PCR和Western blot檢測LPS對胰腺腺泡AR42J細胞中TLR4表達的影響 取AR42J細胞，在細胞中添加TRIzol裂解液，提取總RNA，將RNA溶解在DEPC水中。取RNA，用cDNA合成第一鏈試劑盒合成cDNA，步驟同試劑盒標準流程。再用SYBR Green Realtime PCR試劑盒對TLR4進行定量，內(nèi)參照為GAPDH，引物由上海生工生物合成。TLR4 的正向引物序列為5’-GAAATGGAGGCACCCCTTC-3’，反向引物序列為5’-TGGATACGTTTCCTTATAAG-3’；GAPDH 的正向引物序列為5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，反向引物序列為5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’。實驗結束后，讀取每個反應的Ct值，以GAPDH為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt法計算TLR4水平。取內(nèi)參照和目的基因Ct值的均值，ΔCt=Ct目的-Ct內(nèi)參照，ΔΔCt=(實驗組目的基因Ct值-實驗組內(nèi)參照基因Ct值)-(對照組目的基因Ct值-對照組內(nèi)參照基因Ct值)。Real-time PCR程序為： 95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。

取AR42J細胞用PBS洗滌細胞3次以后，在細胞中添加含有RIPA的裂解液，冰上裂解20 min。4 ℃高速離心，用BCA法對蛋白定量以后，將蛋白同上樣緩沖液混合煮沸5 min，保存在-80 ℃。配制10%的分離膠和5%的濃縮膠，每個泳道中加入50 μg的蛋白樣品，用90 V的固定電壓進行電泳，等到溴酚藍將要進入分離膠時，調(diào)大電壓到120 V。在100 V固定電壓條件下將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜，轉(zhuǎn)膜2 h。將NC膜用5%的脫脂奶粉封閉以后，孵育抗體，I 抗以1∶200稀釋，II 抗以1∶3 000稀釋，ECL法發(fā)光后，用ImageJ分析條帶的吸光度(A)值，內(nèi)參照為GAPDH。

2.3慢病毒感染及沉默效果的檢測 AR42J細胞接種到6孔板中，每個孔中加入4×105個細胞，細胞培養(yǎng)24 h后換液，按照每孔添加40 μL的RNA干擾病毒(5×1011TU/L)進行感染，12 h后觀察細胞生長狀態(tài)，更換細胞培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)72 h，在顯微鏡下隨機選取10個視野，觀察感染效果，感染效率高于90%，用于后續(xù)實驗。將穩(wěn)定感染TLR4 siRNA慢病毒和陰性對照慢病毒的AR42J細胞用10 mg/L LPS培養(yǎng),分別記為LPS+si-TLR4組和LPS+si-NC組;把0 mg/L LPS培養(yǎng)的未經(jīng)感染的AR42J細胞記為control組;把用10 mg/L LPS培養(yǎng)的未經(jīng)感染的AR42J細胞記為LPS組。用real-time PCR和Western blot檢測TLR4 siRNA慢病毒沉默效果，步驟同上。

2.4MTT法檢測細胞活力 各組AR42J細胞分別按照上述處理方法接種到96孔板內(nèi)，細胞培養(yǎng)24 h以后，在每個孔中加入20 μL的MTT溶液，孵育4 h以后，把上清溶液吸棄，加入DMSO將結晶溶解，檢測490 nm的A值，用空白孔調(diào)零。把control組細胞的存活率定義為100%，檢測其它各組細胞的活力。

2.5二硝基苯肼法測定LDH的漏出率 各組AR42J細胞按照上述方法培養(yǎng)24 h以后，收集培養(yǎng)液上清和細胞懸浮液，分別用二硝基苯肼法檢測細胞懸浮液和培養(yǎng)液上清中的LDH含量，步驟同LDH含量檢測試劑盒標準流程。用培養(yǎng)液上清中LDH含量與細胞懸浮液中LDH含量的比值表示LDH漏出率。

2.6ELISA法檢測細胞分泌IL-1β和TNF-α的水平 各組AR42J細胞按照上述方法培養(yǎng)24 h以后，收集細胞培養(yǎng)液上清，用ELISA方法測定細胞培養(yǎng)液上清中的IL-1β和TNF-α含量，步驟同試劑盒標準檢測流程。

2.7細胞培養(yǎng)液上清中MDA含量及SOD、GSH-Px和CAT活性的檢測 各組AR42J細胞按照上述方法培養(yǎng)24 h以后，收集細胞培養(yǎng)液上清，用硫代巴比妥酸法測定上清中MDA含量，用黃嘌呤氧化法測定上清中SOD活性，比色法檢測GSH-Px活性和CAT活性，步驟均按照試劑盒標準流程進行。

3 統(tǒng)計學分析

用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較經(jīng)SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 LPS處理誘導胰腺腺泡AR42J細胞中TLR4的表達

經(jīng)過10 mg/L LPS處理后，胰腺腺泡AR42J細胞中TLR4 mRNA和蛋白的水平均升高(P<0.05),見圖1，說明LPS可以誘導胰腺腺泡細胞中TLR4的表達。

Figure 1.The changes of TLR4 expression in the pancreatic acinar AR42J cells after LPS treatment. A: the mRNA expression level of TLR4 in the pancreatic acinar AR42J cells after LPS treatment; B: the results of Western blot for detecting the protein expression of TLR4 in the pancreatic acinar AR42J cells after LPS treatment. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖1LPS處理后胰腺腺泡AR42J細胞中TLR4表達水平的變化

2 攜帶TLR4 siRNA的慢病毒感染能有效沉默LPS刺激下的胰腺腺泡AR42J細胞中TLR4的表達

胰腺腺泡AR42J細胞感染攜帶TLR4 siRNA的慢病毒后，經(jīng)10 mg/L LPS處理，細胞中TLR4的mRNA和蛋白水平均降低(P<0.05)，見圖2，說明攜帶TLR4 siRNA的慢病毒可以成功下調(diào)LPS刺激下胰腺腺泡細胞中TLR4的表達水平。

Figure 2.Silencing effect of lentivirus infection on the expression ofTLR4 in the pancreatic acinar AR42J cells stimulated with LPS. A: the effect of lentivirus infection on the mRNA expression of TLR4 in the pancreatic acinar AR42J cells stimulated with LPS; B: the results of Western blot for detecting the effect of lentivirus infection on the protein level of TLR4 in the pancreatic acinar AR42J cells with LPS stimulation. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsLPS group and LPS+si-NC group.

圖2慢病毒感染對LPS刺激條件下胰腺腺泡AR42J細胞TLR4的沉默效果

3 下調(diào)TLR4提高LPS處理后的胰腺腺泡AR42J細胞活力并降低LDH漏出率

下調(diào)TLR4的胰腺腺泡AR42J細胞經(jīng)10 mg/L LPS處理，細胞LDH漏出率降低，細胞活力升高(P<0.05),見表1，說明下調(diào)TLR4可以減輕LPS處理后的胰腺腺泡細胞損傷。

表1各組AR42J細胞LDH漏出率和細胞活力的比較

Table 1.The changes of LDH leakage rate and cell viability in each group (Mean±SD.n=6)

GroupLDH leakage rate (%)Cell viability (%)Control25.46±2.14100.00 LPS65.34±4.17?54.25±4.13?LPS+si-NC64.79±5.1256.14±7.46LPS+si-TLR448.69±4.28&72.46±6.23&

*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsLPS group.

4 下調(diào)TLR4減少LPS誘導的胰腺腺泡AR42J細胞分泌IL-1β和TNF-α

下調(diào)TLR4的胰腺腺泡AR42J細胞經(jīng)10 mg/L LPS處理，細胞培養(yǎng)液上清中的IL-1β和TNF-α水平降低(P<0.05)，見表2,說明下調(diào)TLR4可以減少LPS處理后的胰腺腺泡細胞分泌IL-1β和TNF-α。

5 敲減TLR4表達降低LPS刺激下胰腺腺泡AR42J細胞培養(yǎng)液上清中MDA水平并提高SOD、GSH-Px和CAT活性

敲減TLR4表達的胰腺腺泡細胞經(jīng)10 mg/L LPS處理，細胞培養(yǎng)液上清中的MDA水平降低，SOD、GSH-Px和CAT活性升高(P<0.05),見表2。這說明下調(diào)TLR4可以減輕LPS處理后的胰腺腺泡細胞氧化損傷。

討 論

急性胰腺炎是一種明顯的全身炎癥反應，可以引起全身多個器官功能損傷。炎癥反應、微循環(huán)障礙等都與急性胰腺炎的發(fā)生有關。胰腺腺泡細胞是胰腺組織的功能單位，其占胰腺組織的80%，參與胰酶分泌、蛋白質(zhì)消化等過程。在受到外界因素和內(nèi)部因子刺激以后，腺泡細胞釋放高水平的炎癥因子。這些炎癥因子不僅可以引起炎癥細胞過度浸潤、血管出血和誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應，還可以反過來刺激腺泡細胞，引起腺泡細胞損傷[10-11]。LPS參與胰腺炎發(fā)生，其可以激活巨噬細胞等釋放大量的炎癥因子，誘導組織炎癥和組織損傷，LPS是常見體外構建胰腺腺泡細胞損傷模型的誘導因子，可以誘導腺泡細胞釋放炎癥因子，誘導炎性損傷[12-15]。本實驗表明，LPS刺激后的胰腺腺泡細胞活力降低，細胞釋放的LDH水平增多，同時細胞釋放的TNF-α等炎癥因子水平升高，說明成功構建了LPS胰腺腺泡細胞損傷模型。

表2各組AR42J細胞分泌IL-1β和TNF-α水平及MDA、SOD、GSH-Px和CAT水平的比較

Table 2.The releases of IL-1β and TNF-α, the content of MDA and the activity of SOD， GSH-Px and CAT in the AR42J cells of each group (Mean±SD.n=6)

GroupIL-1β (ng/L)TNF-α (ng/L)MDA (μmol/L)SOD (U/L)GSH-Px (U/L)CAT (U/L)Control112.4±9.4284.63±29.565.30±0.51175.67±19.42195.26±11.47128.14±12.25LPS1 345.3±30.6?7 956.47±414.93?8.63±0.84?96.43±11.52?116.54±9.41?78.20±9.13?LPS+si-NC1 347.3±31.77 682.46±383.968.35±0.9398.46±10.20115.46±10.9780.15±9.57LPS+si-TLR4864.2±22.4&2 454.36±216.32&6.23±0.47&143.69±11.86&147.65±12.89&102.58±11.64&

*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsLPS group.

TLR4是TLRs家族中最為重要的成員之一，是天然免疫過程識別病原體的關鍵受體，在幾乎人類的所有細胞中均有表達，其可以分為跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)和胞外區(qū)，參與調(diào)控細胞的多種生理功能[16-17]。TLR4參與炎癥和細胞生長等過程，在腫瘤、肺損傷和心肌損傷等疾病中具有調(diào)控作用，TLR4表達上調(diào)可以促進炎癥反應、抑制細胞生長[18-20]。目前的研究顯示，TLR4在急性胰腺炎腺泡細胞中表達水平升高，并且可能參與胰腺腺泡細胞損傷和炎癥因子分泌過程[21]。本實驗表明，LPS處理后的胰腺腺泡AR42J細胞中的TLR4的表達水平升高，敲低TLR4后的胰腺腺泡AR42J細胞活力升高，細胞分泌的TNF-α等炎癥因子水平降低，提示TLR4具有抗LPS誘導的胰腺腺泡細胞炎性損傷的作用。

胰腺腺泡細胞氧化應激是急性胰腺炎發(fā)生的重要原因之一。急性胰腺炎發(fā)生時，細胞產(chǎn)生大量的氧自由基，同時還伴隨有抗氧化酶如SOD過度消耗，而胰腺腺泡細胞氧化損傷的發(fā)生與過度炎癥反應有關[22]。細胞內(nèi)過量的氧自由基可以靶向作用于細胞膜脂質(zhì)中不飽和脂肪酸，生成MDA，細胞膜脂質(zhì)被過氧化導致細胞膜完整結構被破壞，細胞內(nèi)的MDA和LDH等被釋放到細胞外，因此，檢測細胞外LDH水平可以間接反應細胞損傷程度，檢測細胞外MDA水平可以間接反應細胞氧化損傷程度[23-25]。有研究表明，TLR4不僅參與天然免疫反應，還具有促進細胞氧化應激作用，目前在急性肺損傷、大鼠脊髓損傷等中已經(jīng)證實TLR4的作用[26-27]。本實驗的結果表明，敲減TLR4表達的大鼠胰腺腺泡AR42J細胞經(jīng)LPS誘導后，細胞培養(yǎng)液中SOD活性升高，MDA含量降低，提示敲減TLR4表達具有減輕LPS誘導的胰腺腺泡細胞氧化損傷作用。

綜上所述，TLR4參與急性胰腺炎腺泡細胞損傷，其在LPS誘導的胰腺腺泡AR42J細胞損傷中高表達，敲減其表達一方面可能通過減少胰腺腺泡AR42J細胞分泌炎癥因子，從而降低炎癥因子對胰腺腺泡細胞炎性損傷，另一方面敲減TLR4可能通過降低胰腺腺泡細胞氧化應激水平發(fā)揮抗LPS損傷作用。這對于研究急性胰腺炎發(fā)病機制具有重要意義。TLR4的具體調(diào)控機制尚未明確，還需要在以后的實驗中進行驗證。本實驗存在一定的局限性，比如沒有在原代胰腺腺泡細胞中進行驗證，后續(xù)實驗將對上述部分進行探討。