王域玲 安薇 李桂香 朱建偉 蔣斐

慢性胰腺炎(CP)是一種慢性不可逆性疾病，主要病理特征為胰腺纖維化、胰管擴(kuò)張扭曲，探討胰腺纖維化相關(guān)因素有助于了解其發(fā)病機(jī)制并提供新的治療策略[1]。骨橋蛋白(osteopontin, OPN)是一種分泌性的酸性蛋白，與細(xì)胞外基質(zhì)形成、血管增生及組織損傷修復(fù)密切相關(guān)[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)OPN在纖維化的肝、腎及心臟組織中大量表達(dá)，與心肌纖維化、腎間質(zhì)纖維化及肝硬化密切相關(guān)[4-6]。在肝纖維化的研究中發(fā)現(xiàn)，OPN可激活肝星形細(xì)胞[7]，促進(jìn)其表達(dá)過(guò)多的細(xì)胞外基質(zhì)如α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)及Ⅰ型膠原蛋白(collagen Ⅰ, ColⅠ)，抑制OPN的表達(dá)可減輕肝纖維化[6,8]。目前尚無(wú)有關(guān)OPN與CP及胰腺纖維化的報(bào)道，本研究通過(guò)構(gòu)建大鼠CP模型，探討OPN在CP大鼠胰腺中的表達(dá)及其與胰腺纖維化的關(guān)系。

材料與方法

一、動(dòng)物分組與模型建立

健康雄性Wistar大鼠，體重180～200 g，由海軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，清潔級(jí)。按數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組和CP組，每組10只。采用單次尾靜脈注射二氯二丁基錫(DBTC，8 mg/kg體重)構(gòu)建CP模型[9-10]，以等容積無(wú)水乙醇及甘油尾靜脈注射為對(duì)照組。分別在造模前及造模后1、2、4、6周測(cè)量大鼠體重，造模6周處死大鼠，觀察胰腺大體形態(tài)，并取部分胰腺組織于-80℃保存，部分胰腺組織用4%多聚甲醛固定。

二、胰腺組織病理學(xué)檢查

取固定胰腺組織標(biāo)本，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察胰腺組織病理改變。應(yīng)用Sirius Red染色評(píng)估胰腺纖維化程度，試劑盒購(gòu)自Abcam公司，按說(shuō)明書操作。每張切片取5個(gè)不連續(xù)低倍視野(×100)拍片，使用Image J軟件計(jì)算染色面積百分比，取均值[11]。

三、胰腺組織OPN、α-SMA及ColⅠ表達(dá)檢測(cè)

采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠胰腺組織OPN、α-SMA表達(dá)。OPN、α-SMA一抗均購(gòu)于Abcam公司，工作濃度分別為1∶100、1∶200。酶標(biāo)二抗購(gòu)于上海長(zhǎng)島生物試劑有限公司，應(yīng)用DAB染色。每張染色切片取5個(gè)不連續(xù)高倍視野(×200)進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分包括著色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞比例，著色強(qiáng)度以無(wú)染色、淺黃色、棕黃色、棕褐色為0～3分，陽(yáng)性細(xì)胞比例以0、1%～24%、25%～49%、50%～74%、≥75%為0～4分，兩評(píng)分相乘(0～12分)，取平均值為最終評(píng)分。0～2分為陰性，3～5分為弱陽(yáng)性，6～8分為陽(yáng)性，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性。

取冷凍的胰腺組織，應(yīng)用蛋白裂解液裂解，獲取組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量(試劑盒購(gòu)于碧云天公司)。取50 μg蛋白行常規(guī)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)OPN、α-SMA及ColⅠ蛋白的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。OPN、α-SMA、ColⅠ抗體及HRP標(biāo)記二抗均購(gòu)于Abcam公司，工作濃度分別為1∶1 000、1∶300、1∶5 000、1∶5 000，GAPDH抗體購(gòu)于上?？党巧锟萍加邢薰荆ぷ鳚舛葹?∶5 000。最后用ECL(Millipore公司)化學(xué)發(fā)光法顯影。采用Image J軟件獲取條帶灰度值， 以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、大鼠體重變化及胰腺組織病理學(xué)改變

CP組大鼠存活率為70%(7/10)，對(duì)照組大鼠存活率為100%。造模2、4、6周CP組大鼠體重均顯著低于對(duì)照組[(221.89±2.51)g 比(237.36±7.80)g，P<0.05；(223.29±3.09)g比(266.05±6.26)g，P<0.01；(223.26±3.57)g比(276.93±6.82)g，P<0.01]。6周處死大鼠，肉眼見CP組胰腺組織呈暗黃色，與周圍組織粘連，可見囊性病灶，未見出血、壞死。對(duì)照組無(wú)明顯改變。鏡下見CP組胰腺小葉間大量纖維組織增生，腺泡細(xì)胞空泡樣變性壞死，小葉間大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，胰管擴(kuò)張。對(duì)照組僅有細(xì)胞水腫、脈管周圍少許纖維組織(圖1)。

圖1 對(duì)照組(1A)及CP組(1B)胰腺組織病理改變(HE ×400)

二、 胰腺組織纖維化程度

Sirius-Red染色后CP組胰腺組織有大量鮮紅色條索狀及網(wǎng)狀膠原纖維沉積于小葉間隙和腺泡間，而對(duì)照組僅在血管及胰管周圍有少許纖維沉積(圖2)。CP組染色面積顯著大于對(duì)照組[(51±11)%比(9±4)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

三、胰腺組織OPN、α-SMA及ColⅠ的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，CP組OPN主要表達(dá)在腺管上皮、腺泡細(xì)胞胞質(zhì)及纖維結(jié)締組織內(nèi)，對(duì)照組僅有少量表達(dá)在血管及胰管周圍的纖維結(jié)締組織內(nèi)，腺泡細(xì)胞低表達(dá)(圖3)。CP組7只大鼠中3只胰腺組織OPN強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，4只陽(yáng)性表達(dá)；對(duì)照組10只大鼠中3只胰腺組織OPN弱陽(yáng)性表達(dá)，7只陰性表達(dá)，CP組OPN的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(Z=-5.170，P<0.01)，且OPN表達(dá)與Sirius-Red染色面積呈正相關(guān)(r=0.790，P<0.01)。

圖2 對(duì)照組(2A)及CP組(2B)胰腺組織膠原沉積(Sirius-Red染色 ×100)

圖3 對(duì)照組(3A)及CP組(3B)胰腺組織OPN表達(dá)(免疫組織化學(xué) ×200)

CP組大鼠胰腺組織α-SMA表達(dá)在纖維結(jié)締組織聚集處，腺管上皮及腺泡細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)，而對(duì)照組大鼠胰腺組織α-SMA陰性表達(dá)(圖4)。

圖4 對(duì)照組(4A)及CP組(4B)胰腺組織α-SMA表達(dá)(免疫組織化學(xué) ×200)

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，CP組OPN、α-SMA及ColⅠ的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(0.70±0.22比0.24±0.11，P<0.05；0.71±0.10比0.06±0.01，P<0.01；2.83±1.42比0.39±0.07，P<0.05；圖5)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 對(duì)照組(1)及CP組(2)胰腺組織OPN、α-SMA及ColⅠ蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)

討 論

目前建立CP大鼠模型有多種方法，如飲食誘導(dǎo)、腹腔內(nèi)注射雨蛙素、胰腺導(dǎo)管結(jié)扎、胰管內(nèi)注射牛黃膽酸鈉、靜脈注射DBTC或內(nèi)毒素以及轉(zhuǎn)基因模型等方法[12]，其中單次靜脈注射DBTC較為安全、簡(jiǎn)單，成模率達(dá)80%左右[10]。該模型制模后1周就可觀察到胰腺實(shí)質(zhì)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及膠原纖維沉積，其機(jī)制可能是DBTC破壞腺泡細(xì)胞及導(dǎo)管上皮細(xì)胞誘導(dǎo)胰腺發(fā)生炎性改變，壞死細(xì)胞阻塞胰管導(dǎo)致胰管擴(kuò)張、小葉結(jié)構(gòu)破壞最終造成了間質(zhì)纖維化。該模型以外分泌實(shí)質(zhì)破壞和纖維化為特征，后期出現(xiàn)內(nèi)分泌實(shí)質(zhì)的破壞[13]，無(wú)胰腺實(shí)質(zhì)萎縮，廣泛用于CP纖維化機(jī)制的研究[14-16]。本研究采用單次尾靜脈注射DBTC成功建立了CP纖維化大鼠模型，除麻醉意外死去1只，注射藥物24 h內(nèi)死亡2只外，成活的7只大鼠均建模成功，鏡下觀察到小葉間大量纖維組織及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腺泡細(xì)胞出現(xiàn)變性及壞死，胰管擴(kuò)張；Sirius-Red染色面積顯著增加；α-SMA及ColⅠ表達(dá)明顯上調(diào)，提示胰腺纖維化程度較重。

OPN是一種細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞因子，也被稱為分泌型磷酸蛋白 1，主要表達(dá)在結(jié)締組織及纖維組織中[17]。研究顯示，下調(diào)OPN可減輕甚至消除小鼠肝纖維化[8]，也可以減少擴(kuò)張性心肌病中左心室的重建[18]。OPN參與纖維化的機(jī)制可能通過(guò)激活TGF-β[19]、PI3K/Akt[20]或FAK/Akt[18]等信號(hào)通路誘導(dǎo)纖維化的發(fā)生。Chen等[6]體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OPN通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制肝星形細(xì)胞的miR-129-5p在ColⅠ RNA上的結(jié)合位點(diǎn)，解除miR-129-5p對(duì)ColⅠ表達(dá)的抑制作用從而上調(diào)ColⅠ的表達(dá)。Rychlikova[21]等檢測(cè)了CP及正常人外周血OPN水平，發(fā)現(xiàn)CP患者的水平顯著高于對(duì)照組，特別是伴有鈣化或結(jié)石的患者。本研究結(jié)果顯示，CP大鼠胰腺組織OPN的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組，且其表達(dá)水平與胰腺纖維化程度呈正相關(guān)，說(shuō)明OPN表達(dá)與胰腺纖維化有關(guān)。OPN如何引起胰腺發(fā)生纖維化、OPN與胰腺星形細(xì)胞活化有何聯(lián)系、以O(shè)PN為靶點(diǎn)進(jìn)行治療對(duì)胰腺纖維化有何影響是今后需要進(jìn)一步研究探討的方向。