裴曉東，孫占勇，陳世軍

（鄭州市第一人民醫(yī)院普外科，河南 鄭州 450000）

乳腺癌是女性發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅女性的生命健康，目前乳腺癌發(fā)病率逐年升高且呈低齡化趨勢(shì)［1-2］。據(jù)全球流行病統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2012年全球約有170萬乳腺癌新發(fā)病例，并有521 900例患者病死［3］。雖然近年來針對(duì)乳腺癌的篩查及放射治療、化學(xué)治療等手段有了長(zhǎng)足進(jìn)步，但乳腺癌的具體發(fā)病機(jī)制和侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制仍不十分清楚，因腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移造成的治療失敗也屢見不鮮。因此，抑制腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移已成為乳腺癌等腫瘤防治研究的焦點(diǎn)之一。黃芩素是一種從唇形科植物黃芩的根莖中提取的有效成分［4］。研究表明，黃芩素具有抗腫瘤、抗炎和抗細(xì)菌感染等生物學(xué)活性，對(duì)心血管疾病也表現(xiàn)出一定的防治作用［5］。ZHAO等［6］研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素可通過調(diào)控腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞極化來抑制乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。YU等［7］研究表明，黃芩素可通過激活長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）PAX8-AS1-N來抑制乳腺癌的生長(zhǎng)。lncRNA是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸且不能編碼蛋白質(zhì)的RNA，可參與調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1（metastasisassociated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）是一種在腫瘤組織中高表達(dá)的lncRNA［8］；有研究證實(shí)，MALAT1可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥［8-9］?；诖?，本研究通過檢測(cè)黃芩素處理后人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力和侵襲能力的變化，進(jìn)一步探討黃芩素對(duì)乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的作用；并通過觀察黃芩素處理后人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）標(biāo)志物上皮型鈣黏蛋白（cadherin 1，CDH1）、蝸牛家族轉(zhuǎn)錄抑制因子1（snail family transcriptional repressor，SNAIL）、波形蛋白（vimentin）表達(dá)水平以及MALAT1 mRNA表達(dá)變化，探討其分子生物學(xué)機(jī)制；旨在為臨床應(yīng)用黃芩素治療乳腺癌提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器人乳腺癌細(xì)胞株MDAMB-231購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。實(shí)驗(yàn)用黃芩素（CAS 491-67-8，貨號(hào)465119-100MG）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、結(jié)晶紫染色液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，甲醇（分析純）購(gòu)自北京國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司，CDH1、SNAIL、vimentin一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G二抗和內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）一抗購(gòu)自北京中杉金橋公司，pcDNA3.1載體為本實(shí)驗(yàn)室保存，聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Life公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒、增強(qiáng)型電化學(xué)發(fā)光液（enhanced chemical luminescence，ECL）、TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Master Mix染料購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司；熒光倒置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Zeiss公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱、7500型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司，蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)電泳裝置購(gòu)自北京六一儀器廠，天能化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將MDA-MB-231細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1×105U·L－1青霉素和100 mg·L－1鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中穩(wěn)定培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞，按每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，隨機(jī)分為對(duì)照組和20、40、80、160μmol·L－1黃芩素處理組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別加入終濃度0、20、40、80、160μmol·L－1黃芩素溶液，置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿培養(yǎng)皿底部時(shí)，使用10μL的無菌吸頭劃過細(xì)胞表面，使用預(yù)熱的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2遍，將殘余的細(xì)胞碎片洗去，繼續(xù)置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別于0、24 h時(shí)使用倒置顯微鏡拍照，應(yīng)用Image J軟件測(cè)量劃痕寬度，并計(jì)算細(xì)胞轉(zhuǎn)移率。細(xì)胞轉(zhuǎn)移率＝（0 h劃痕寬度－24 h劃痕寬度）／0 h劃痕寬度×100%。

1.2.3 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組和20、40、80、160μmol·L－1黃芩素處理組，分別加入終濃度0、20、40、80、160μmol·L－1黃芩素溶液干預(yù)12 h，隨后進(jìn)行Transwell小室實(shí)驗(yàn)。取干預(yù)12 h的各組細(xì)胞，每孔2.5×105個(gè)細(xì)胞接種于預(yù)鋪基質(zhì)膠的小室中，將小室置于24孔板中，上室使用含體積分?jǐn)?shù)1%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，下室使用含體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h，隨后取出小室并使用PBS清洗3次，甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min。染色結(jié)束后使用細(xì)胞刮刀將上室中的細(xì)胞輕輕刮下，PBS潤(rùn)洗2次，將刮下的上室細(xì)胞收集于干凈的1.5 mL離心管中。PBS清洗后的小室置于顯微鏡下拍照，然后使用冰醋酸洗脫黏附在下室的細(xì)胞，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm處下室洗脫細(xì)胞的吸光度值，將洗脫的上室細(xì)胞合并至下室細(xì)胞中再次測(cè)量吸光度值，并計(jì)算侵襲率。侵襲率＝下室洗脫細(xì)胞的吸光度值／上室細(xì)胞合并至下室細(xì)胞后的吸光度值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中CDH1、vimentin和SNAIL蛋白表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞，按每孔8×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，隨機(jī)分為對(duì)照組和20、40、80、160μmol·L－1黃芩素處理組，分別加入終濃度0、20、40、80、160μmol·L－1黃芩素溶液，置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，使用50μL RIPA裂解液裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白，取2μL裂解液上清蛋白樣品使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取30 mg樣品蛋白，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳、PVDF轉(zhuǎn)膜后，使用50 g·L－1的脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入β-actin、CDH1、SNAIL和vimentin一抗（稀釋比例均為1∶1 000），于4℃下孵育過夜，使用1×TBST洗膜3次，每次10 min，洗去一抗后，加入辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗（稀釋比例1∶5 000），于37℃下孵育30 min，1×TBST洗膜3次，每次10 min，使用ECL發(fā)光液顯影，天能化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，Image J圖像分析軟件測(cè)定蛋白質(zhì)條帶灰度值，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白（β-actin）灰度值比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中MALAT1 mRNA表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，隨機(jī)分為對(duì)照組和20、40、80、160μmol·L－1黃芩素處理組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別加入終濃度0、20、40、80、160μmol·L－1黃芩素溶液，培養(yǎng)48 h后棄掉培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞2遍，隨后各組細(xì)胞中加入1 mL TRIzol試劑，根據(jù)試劑盒說明提取總RNA。取1μg總RNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板，反轉(zhuǎn)錄條件為42℃維持30 min，95℃維持2 min，cDNA模板保存于－20℃冰箱。采用qRT-PCR法檢測(cè)MALAT1 mRNA表達(dá)。MALAT1上游引物序列為5′-GGATCCTAGACCAGCATGCC-3′，下游引物序列為5′-AAAGGTTACCATAAGTAAGTTCCAGAAAA-3′；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）上游引物序列為5′-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′，下游引物序列為5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′。根據(jù)SYBR GREEN染料試劑盒說明書以cDNA模板為底物進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系總體積為15μL，其中上下游引物共1μL（10μmol·L－1），cDNA模板1μL（200 ng），SYBR GREEN染料5.5μL和水7.5μL。擴(kuò)增循環(huán)條件為95℃變性5 min，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，循環(huán)45次；以GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)2－ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 MALAT1過表達(dá)載體的構(gòu)建在PubMed數(shù)據(jù)庫中獲得MALAT1基因mRNA序列，以此為模板設(shè)計(jì)PCR引物，并在引物兩端引入限制性酶切位點(diǎn)Bam H1和HindⅢ。PCR擴(kuò)增獲得MALAT1 mRNA產(chǎn)物。過表達(dá)載體構(gòu)建使用的MALAT1 mRNA-序列的上游引物序列為5′-CTAGCTAGCGCTTACAATCTTAGAGTGGTAGGCA-3′，下游引物序列為5′-CCGCTCGAGTCTAACATAGTTCAACCCACCAAAG-3′。雙酶切pcDNA3.1載體和MALAT1 PCR產(chǎn)物，根據(jù)限制性內(nèi)切酶說明書配制反應(yīng)體系，酶切過夜，獲得其線性片斷，使用T4 DNA連接酶將MALAT1 mRNA序列與酶切后的載體相連，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增。利用載體的氨芐青霉素抗性篩選出轉(zhuǎn)化大腸桿菌陽性克隆并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確的克隆用于提取過表達(dá)載體并保存菌種。

1.2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及過表達(dá)MALAT1細(xì)胞中CDH1、vimentin、SNAIL蛋白和SNAIL mRNA表達(dá)檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞，按每孔5×105的密度接種于6孔板中，隨機(jī)分為對(duì)照組和20、40、80、160μmol·L－1黃芩素處理組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別加入終濃度0、20、40、80、160μmol·L－1黃芩素溶液，待細(xì)胞匯合度約為65%時(shí)，更換為不含血清和抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h。按Lipofectamine 2000說明書配制轉(zhuǎn)染試劑和pcDNA3.1-MALAT1過表達(dá)質(zhì)粒（2μg）混合液，其中轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒體積比為2∶1，室溫靜置20 min后滴加至6孔板中，每孔500μL，將6孔板置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞中CDH1、vimentin和SNAIL蛋白表達(dá)，方法同“1.2.4”；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)MALAT1 mRNA表達(dá)量，方法同“1.2.5”。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls（SNK）法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5組MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)移率比較對(duì)照組和20、40、80、160μmol·L－1黃芩素處理組MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)移率分別為（91.23±2.12）%、（75.34±1.30）%、（66.42±5.03）%、（42.01±2.37）%、（29.38±6.01）%。20μmol·L－1黃芩素處理組和40μmol·L－1黃芩素處理組與對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)移率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；80μmol·L－1黃芩素處理組和160μmol·L－1黃芩素處理組細(xì)胞轉(zhuǎn)移率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。80μmol·L－1黃芩素處理組和160μmol·L－1黃芩素處理組細(xì)胞轉(zhuǎn)移率低于20μmol·L－1黃芩素處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；160μmol·L－1黃芩素處理組細(xì)胞轉(zhuǎn)移率低于80μmol·L－1黃芩素處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其余各劑量黃芩素處理組之間細(xì)胞轉(zhuǎn)移率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 5組MDA-MB-231細(xì)胞侵襲率的比較結(jié)果見圖1。對(duì)照組和20、40、80、160μmol·L－1黃芩素處組MDA-MB-231細(xì)胞侵襲率分別為（102.19±1.35）%、（81.34±2.08）%、（76.41±4.21）%、（52.42±4.02）%、（35.33±2.11）%。20μmol·L－1黃芩素處理組和40μmol·L－1黃芩素處理組細(xì)胞侵襲率與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；80μmol·L－1黃芩素處理組和160μmol·L－1黃芩素處理組細(xì)胞侵襲率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；160μmol·L－1黃芩素處理組細(xì)胞侵襲率低于20μmol·L－1黃芩素處理組和40μmol·L－1黃芩素處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其余各劑量黃芩素處理組之間細(xì)胞侵襲率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 5組MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力（結(jié)晶紫染色，×200）Fig.1 Migration of MDA-MB-231 cells in the five groups（crystal violet staining，×200）

2.3 5組MDA-MB-231細(xì)胞中CDH1、SNAIL和vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見圖2和表1。20μmol·L－1黃芩素處理組細(xì)胞中CDH1、vimentin和SNAIL蛋白相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。40μmol·L－1黃芩素處理組細(xì)胞中SNAIL蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CDH1和vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。80μmol·L－1黃芩素處理組和160μmol·L－1黃芩素處理組細(xì)胞中CDH1蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組和20μmol·L－1黃芩素處理組，vimentin和SNAIL蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組和20μmol·L－1黃芩素處理組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。160μmol·L－1黃芩素處理組細(xì)胞中CDH1蛋白相對(duì)表達(dá)量高于40μmol·L－1黃芩素處理組，vimentin和SNAIL蛋白相對(duì)表達(dá)量低于40μmol·L－1黃芩素處理組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其余各劑量黃芩素處理組細(xì)胞中CDH1、vimentin和SNAIL蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 5組MDA-MB-231細(xì)胞中CDH1、SNAIL和vimentin蛋白的表達(dá)Fig.2 Expression of CDH1，SNAIL and vimentin protein in MDA-MB-231 cells in the five groups

表1 5組MDA-MB-231細(xì)胞中CDH1、SNAIL和vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較Tab.1 Comparison of relative expression of CDH1，SNAIL and vimentin protein in MDA-MB-231 cells among the five groups（±s）

表1 5組MDA-MB-231細(xì)胞中CDH1、SNAIL和vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較Tab.1 Comparison of relative expression of CDH1，SNAIL and vimentin protein in MDA-MB-231 cells among the five groups（±s）

注：與對(duì)照組比較a P＜0.05；與20μmol·L－1黃芩素處理組比較b P＜0.05；與40μmol·L－1黃芩素處理組比較c P＜0.05。

組別n CDH1 vimentin SNAIL對(duì)照組0.12±0.11 0.87±0.03 0.92±0.06 20μmol·L－1黃芩素處理組3 0.22±0.02 0.72±0.12 0.81±0.05 40μmol·L－1黃芩素處理組3 0.36±0.05 0.64±0.13 0.69±0.10a 80μmol·L－1黃芩素處理組3 0.45±0.02ab 0.42±0.05ab 0.51±0.03ab 160μmol·L－1黃芩素處理組3 0.59±0.03abc 0.28±0.08abc 0.38±0.04 abc

2.4 5組MDA-MB-231細(xì)胞中MALAT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較對(duì)照組和20、40、80、160μmol·L－1黃芩素處理組細(xì)胞中MALAT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.01±0.02、0.81±0.03、0.72±0.05、0.48±0.05和0.39±0.04。20、40、80、160μmol·L－1黃芩素處理組細(xì)胞中MALAT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。80μmol·L－1黃芩素處理組和160μmol·L－1黃芩素處理組細(xì)胞中MALAT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于20μmol·L－1黃芩素處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；160μmol·L－1黃芩素處理組細(xì)胞中MALAT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于40μmol·L－1黃芩素處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其余各劑量黃芩素處理組細(xì)胞中MALAT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 5組過表達(dá)pcDNA 3.1-MALAT1 MDA-MB-231細(xì)胞中MALAT1 mRNA及CDH1、SNAIL、vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見圖3和表2。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MALAT1過表達(dá)載體MDA-MB-231細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體MDA-MB-231細(xì)胞中MALAT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為13.93±0.02、0.98±0.02，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MALAT1過表達(dá)載體MDA-MB-231細(xì)胞中MALAT mRNA相對(duì)表達(dá)量高于轉(zhuǎn)染空載體MDA-MB-231細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明過表達(dá)載體構(gòu)建成功并在MDA-MB-231細(xì)胞中表達(dá)。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MALAT1過表達(dá)載體后，20、40、80、160μmol·L－1黃芩素處理組細(xì)胞中CDH1、vimentin和SNAIL蛋白相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同劑量黃芩素處理組細(xì)胞中CDH1、vimentin和SNAIL蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 5組過表達(dá)pcDNA3.1-MALAT1 MDA-MB-231細(xì)胞中CDH1、SNAIL和vimentin蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of CDH1，SNAIL and vimentin protein in overexpressing pcDNA3.1-MALAT1 MDA-MB-231 cells in the five groups

表2 5組過表達(dá)載體pcDNA3.1-MALAT1 MDA-MB-231細(xì)胞中CDH1、SNAIL和vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較Tab.2 Comparison of relative expression of CDH1，SNAIL and vimentin protein in overexpressing pcDNA3.1-MALAT1 MDA-MB-231 cells among the five groups（±s）

表2 5組過表達(dá)載體pcDNA3.1-MALAT1 MDA-MB-231細(xì)胞中CDH1、SNAIL和vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較Tab.2 Comparison of relative expression of CDH1，SNAIL and vimentin protein in overexpressing pcDNA3.1-MALAT1 MDA-MB-231 cells among the five groups（±s）

組別n CDH1 vimentin SNAIL對(duì)照組0.18±0.12 0.82±0.04 0.89±0.04 20μmol·L－1黃芩素處理組3 0.21±0.05 0.78±0.10 0.81±0.03 40μmol·L－1黃芩素處理組3 0.28±0.04 0.84±0.11 0.79±0.12 80μmol·L－1黃芩素處理組3 0.23±0.01 0.72±0.04 0.81±0.05 160μmol·L－1黃芩素處理組3 0.24±0.02 0.76±0.09 0.83±0.03

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，全球每年約210萬女性確診罹患乳腺癌［1］。雖然目前對(duì)于乳腺癌的診斷和治療手段有了明顯進(jìn)步，但是乳腺癌患者的預(yù)后一直不太理想。有研究報(bào)道，我國(guó)3%～10%的乳腺癌患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，5 a生存率約為20%［10］。乳腺癌細(xì)胞的惡性侵襲、轉(zhuǎn)移是影響乳腺癌患者預(yù)后的一個(gè)重要原因［11］。關(guān)于腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的研究已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域重點(diǎn)關(guān)注的課題之一。研究證實(shí)，lncRNA等分子能夠通過調(diào)控多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與調(diào)控多種癌癥包括乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲和轉(zhuǎn)移過程［12-14］，這為乳腺癌的診斷和治療提供了新的思路或靶點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，一些天然產(chǎn)物可抑制乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，例如補(bǔ)骨脂異黃酮、假白欖酮和黨參內(nèi)酯等均表現(xiàn)出抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的作用［15-17］。但天然產(chǎn)物發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制，尤其是其與lncRNA調(diào)控有關(guān)的分子機(jī)制仍不明確，需要進(jìn)一步研究。

黃芩素為一種從植物中提取的活性物質(zhì)，具有良好的抗腫瘤活性［7，18-19］。研究表明，黃芩素可通過不同的分子生物學(xué)機(jī)制對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移發(fā)揮抑制作用［7-9］。KOH等［20］研究表明，黃芩素可以上調(diào)干擾素誘導(dǎo)的三角形四肽重復(fù)蛋白2并抑制MDA-MB-231細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞特征，從而發(fā)揮提高化學(xué)治療敏感性的作用。YAN等［21］研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素能夠抑制乳腺癌細(xì)胞中磷脂酰肌醇3激酶／蛋白激酶B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡和自噬。EMT被認(rèn)為是驅(qū)動(dòng)腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的第1步。EMT直接受轉(zhuǎn)錄因子例如SNAIL的驅(qū)動(dòng)［22］，而CDH1和vimentin則充當(dāng)EMT效應(yīng)器的角色，調(diào)控細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的變化。CDH1蛋白水平下降，SNAIL蛋白和vimentin蛋白水平升高被認(rèn)為是細(xì)胞發(fā)生EMT的標(biāo)志［23］。JADALIHA等［9］研究表明，黃芩素可通過抑制Wnt／β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制乳腺癌細(xì)胞的EMT過程。NGUYEN等［24］研究表明，黃芩素可通過下調(diào)富含半胱氨酸蛋白61和賴氨酰氧化酶樣蛋白2的表達(dá)抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的EMT過程。以上研究說明黃芩素具有潛在的抑癌生物活性，可對(duì)乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移起抑制作用。MALAT1是一種促癌非編碼RNA，參與多種腫瘤的生成、代謝及血管生成等［25］。MALAT1能夠通過競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與調(diào)控多種促癌基因的表達(dá)，如MALAT1可競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合miR-26a，使靶向轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2（transforming growth factor beta 2，TGF-β2）的內(nèi)源miR-26a減少，從而上調(diào)TGF-β2的表達(dá)水平并促進(jìn)細(xì)胞的EMT過程［26］。因此，以MALAT1為靶標(biāo)尋找潛在的抑制劑具有較完善的理論支持和廣闊前景。

雖然目前對(duì)黃芩素抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移及EMT的作用的報(bào)道較多，但其具體涉及的分子生物學(xué)機(jī)制并不明確?；诖?，本研究使用梯度濃度的黃芩素處理乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，結(jié)果顯示，黃芩素可抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，降低EMT過程中間充質(zhì)標(biāo)志物vimentin和SNAIL蛋白水平，上調(diào)CDH1蛋白表達(dá)；高濃度的黃芩素抑制MDA-MB-231細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的效果強(qiáng)于低濃度黃芩素，對(duì)EMT標(biāo)志物蛋白水平的影響更顯著。此外，本研究結(jié)果還顯示，黃芩素可顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞中MALAT1 mRNA的表達(dá)水平，過表達(dá)MALAT1后可逆轉(zhuǎn)黃芩素對(duì)EMT過程的抑制作用。以上結(jié)果證實(shí)，黃芩素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移具有顯著的抑制作用，且該作用與黃芩素的濃度有關(guān)，即高濃度黃芩素對(duì)侵襲、轉(zhuǎn)移的抑制效果更明顯；黃芩素通過影響MDA-MB-231細(xì)胞中間充質(zhì)標(biāo)志物vimentin和SNAIL蛋白以及上皮標(biāo)志物CDH1蛋白表達(dá)水平，參與調(diào)控EMT過程，進(jìn)而發(fā)揮抑制MDA-MB-231細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的作用，而MALAT1可逆轉(zhuǎn)黃芩素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞EMT過程的抑制作用。

綜上所述，黃芩素可通過抑制lncRNA MALAT1發(fā)揮抑制MDA-MB-231細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的作用，這為探索黃芩素生物學(xué)功能潛在的分子生物學(xué)機(jī)制提供了新思路。根據(jù)MALAT1及其他lncRNA的作用特點(diǎn)，推測(cè)黃芩素抑制MALAT1表達(dá)后可通過競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)促進(jìn)其相關(guān)靶向的微RNA表達(dá)，進(jìn)而抑制潛在的下游促癌靶基因并抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，但需要后續(xù)研究進(jìn)行驗(yàn)證。