孫俊, 徐偉, 陸榮柱, 朱孝仁, 徐新明, 蔣一全, 陳健

(1. 江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院肝膽外科,江蘇 蘇州 215300； 2. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 3. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬鹽城市中醫(yī)院病理科,江蘇 鹽城 224001； 4. 江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院中心實驗室,江蘇 蘇州 215300)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白折疊及翻譯后加工、脂質(zhì)合成等重要場所,對維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)極為重要；當(dāng)發(fā)生缺氧、pH變化等情況時,大量錯誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì)蓄積于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi),破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài),誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)[1-2]。ERS主要有如下3種類型:未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的超負(fù)荷反應(yīng)、調(diào)節(jié)固醇元件的結(jié)合蛋白激活的固醇級聯(lián)反應(yīng)；其中,未折疊蛋白反應(yīng)最為多見,故一般情況下ERS指代的就是未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上有3種重要的跨膜傳感器蛋白,分別為需肌醇酶1(inositol requiring enzyme1,IRE1)、蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase RNA-like ER kinase,PERK)和激活轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)。當(dāng)發(fā)生ERS時,3種蛋白分別與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78, GRP78)解離,識別并結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累的未折疊或錯誤折疊蛋白,以對抗應(yīng)激,維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)[2]。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)無法維持時,ERS則會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

原發(fā)性肝癌的發(fā)病率及死亡率高[3],目前化療藥物的治療效果不理想,且不良反應(yīng)較大。姜黃素是一種從姜黃的根莖中提取出的天然植物活性成分,能夠明顯抑制乳腺癌[4]、前列腺癌[5]、人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[6]和胰腺癌[7]等腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。本課題組前期實驗表明,姜黃素在體外可以通過激活ERS通路,抑制肝癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡[8]。但是,姜黃素對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞裸鼠移植瘤的效應(yīng)及其潛在機(jī)制仍不明確。因此,本研究擬建立裸鼠皮下肝癌移植瘤模型,檢測瘤體組織中ERS相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,并評價姜黃素在體內(nèi)對肝癌的抑制效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 動物、細(xì)胞及主要試劑

SPF級BALB/c雌性裸鼠,4周齡,20只,購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司,許可證號為SCXK(滬)2017-0005；人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株購自湖南豐暉生物科技有限公司；優(yōu)質(zhì)胎牛血清購自上海雙洳科技生物有限公司；胰蛋白酶購自美國Gibco公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；姜黃素購自美國Sigma公司；兔抗鼠GRP78、IRE1和β-微管蛋白抗體購自美國Abcam公司；兔抗鼠磷酸化PERK(p-PERK)抗體購自北京博奧森生物公司；兔抗鼠磷酸化真核細(xì)胞起始因子2α(phospho-eukaryotic initiation factor 2α,p-eIF2α)、Bcl-2、Cleaved Caspase-3抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗鼠C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)抗體購自杭州華安生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購于美國Santa Cruz公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、分離膠配制試劑盒均為上海碧云天生物公司產(chǎn)品；DAB染色液、蘇木素染色劑、免疫組化抗原修復(fù)試劑盒均為上海桂浦生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

將人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株用含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清及1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的RPMI 1640培養(yǎng)基,培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。傳代次數(shù)在10代以內(nèi)。

1.3 裸鼠皮下肝癌移植瘤模型的建立

取傳代后處于對數(shù)生長期的人肝癌SMMC-7721細(xì)胞,胰蛋白酶消化后離心,用PBS重懸,定量細(xì)胞密度至2×107個/mL。取100 μL肝癌細(xì)胞(約2×106個)接種于裸鼠右側(cè)腋下,繼續(xù)在SPF環(huán)境中飼養(yǎng)至實驗結(jié)束。接種第5天,所有受試裸鼠皮下均可見一個明顯、清晰的結(jié)節(jié),其邊界清晰,質(zhì)地較硬,可推動。由此可證實人肝癌SMMC-7721細(xì)胞裸鼠移植瘤模型構(gòu)建成功。

1.4 動物分組及處理

待裸鼠皮下腫瘤組織最長徑均大于5 mm后,將20只成瘤裸鼠隨機(jī)均分為4組,即對照組、10 mg/kg姜黃素組、50 mg/kg姜黃素組、100 mg/kg姜黃素組,每組5只。均采用腹腔注射給藥,分別給予生理鹽水及對應(yīng)劑量姜黃素,每日給藥1次,每次200 μL,連續(xù)16 d。

1.5 指標(biāo)測量

自給藥當(dāng)天起,每隔一日測量各組裸鼠體重及裸鼠皮下移植瘤的最長徑a(mm)和最短徑b(mm),采用公式V(mm3)=ab2/2計算皮下移植瘤體積。同時觀察各裸鼠的神經(jīng)行為及營養(yǎng)狀況。給藥結(jié)束后第2天,給予所有裸鼠2%水合氯醛麻醉,完整剝離腫瘤組織,PBS清洗,濾紙吸干水分后測量瘤體重量,并計算抑瘤率。抑瘤率(%)=(對照組平均瘤重-姜黃素組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測瘤體組織中ERS通路相關(guān)蛋白及凋亡蛋白表達(dá)

稱取各組瘤體組織,每20 mg組織加入150 μL RIPA裂解液,研磨、離心后提取總蛋白。用BCA法測定蛋白濃度。配制8% SDS-PAGE分離膠,80 V電泳分離蛋白90 min；300 mA轉(zhuǎn)膜90 min至PVDF膜；5%奶粉室溫封閉2 h；將PVDF膜加入對應(yīng)的一抗稀釋液中(GRP78、IRE1、p-PERK、p-eIF2α、CHOP、Cleaved Caspase-3及Bcl-2抗體稀釋比均為1 ∶1 000；內(nèi)參為GAPDH或β-微管蛋白,稀釋比為1 ∶1 000)；TBST洗滌3次；加入二抗稀釋液(1 ∶10 000),室溫孵育1 h；TBST洗滌；膜上滴加熒光試劑ECL,經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)顯影。取目的條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.7 免疫組織化學(xué)法檢測瘤體組織中GRP78和IRE1蛋白表達(dá)

取出液氮中瘤體組織,切取部分組織標(biāo)本,用10%甲醛液固定脫水,常規(guī)石蠟包埋,制備4 μm連續(xù)切片。60 ℃烘烤1 h；經(jīng)二甲苯脫蠟3次,每次10 min；再經(jīng)從高到低濃度梯度的乙醇浸泡、水化,每次5 min；將pH=6.0抗原修復(fù)試劑置于微波爐中高火加熱5～6 min,放入載玻片后轉(zhuǎn)中高火修復(fù)15 min；將配好的3%過氧化氫滴加于切片,室溫孵育15 min；PBS清洗3次；滴加山羊血清后室溫封閉30 min棄去上清液；分別加入GRP78和IRE1一抗稀釋液(1 ∶500),4 ℃孵育過夜；加二抗稀釋液(1 ∶200),孵育30 min；清洗5 min,甩干；加入DAB溶液顯色,雙蒸水沖洗,蘇木素染色液復(fù)染10 s；脫水、透明后中性樹脂封片。

在普通光學(xué)顯微鏡(×400)下,隨機(jī)選取5個不同視野,計數(shù)細(xì)胞總數(shù)及陽性細(xì)胞數(shù),按陽性細(xì)胞所占的百分比計分。評分方法如下:① 按陽性細(xì)胞率計分:陽性率≤10%計1分,10%～50%計2分,50%～75%計3分,≥75%計4分；② 按染色程度評分:陰性1分,弱染色2分,中等強(qiáng)度染色3分,強(qiáng)染色4分。由兩位病理科醫(yī)師在雙盲情況下觀察記分；將兩種方法計得分?jǐn)?shù)的乘積用來判斷結(jié)果,即:陰性(-)為≤4分,弱陽性(+)為5～8分,陽性(++)為9～12分,強(qiáng)陽性(+++)為>12分[9]。

1.8 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 姜黃素處理對荷瘤裸鼠行為及體重的影響

在整個給藥期間,不同劑量姜黃素組受試裸鼠行為未發(fā)現(xiàn)異常,營養(yǎng)狀態(tài)良好；4組裸鼠體重均呈逐漸增長趨勢。對照組裸鼠體重增加略高于各姜黃素處理組,但各組裸鼠體重增長并沒有明顯差異(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組裸鼠體重變化比較

2.2 姜黃素對裸鼠移植瘤體積的影響

由圖2可見,隨著給藥時間延長,各組裸鼠瘤體體積均呈增大趨勢。但第10天,100 mg/kg姜黃素組瘤體體積明顯小于對照組及10 mg/kg姜黃素組(P均<0.05)；自第12天起,50 mg/kg和100 mg/kg姜黃素組瘤體體積均明顯小于對照組及10 mg/kg姜黃素組(P均<0.05),且100 mg/kg姜黃素組明顯小于50 mg/kg姜黃素組(P均<0.05)。

a:P<0.05,與對照組比較；b:P<0.05,與10 mg/kg姜黃素組比較；c:P<0.05,與50 mg/kg姜黃素組比較

2.3 姜黃素對瘤體重量及抑瘤率的影響

隨著姜黃素劑量增加,各組中瘤重逐漸降低,100 mg/kg姜黃素組瘤重較50、10 mg/kg姜黃素組分別降低35.4%、16.5%。與對照組相比,10、50和100 mg/kg姜黃素組裸鼠移植瘤瘤重明顯降低(q=4.067、5.258、6.289,P均<0.05)。10、50和100 mg/kg姜黃素組抑瘤率分別為35.3%、45.7%、54.7%。見圖3。

a:P<0.05,與對照組比較

2.4 姜黃素對移植瘤中ERS通路相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.4.1 姜黃素對移植瘤中ERS通路標(biāo)志性蛋白GRP78表達(dá)的影響 與對照組相比,姜黃素組GRP78蛋白表達(dá)均出現(xiàn)增加趨勢,且50和100 mg/kg姜黃素組GRP78表達(dá)量明顯高于對照組(q=6.426、11.190,P均<0.05)；100 mg/kg姜黃素組GRP78表達(dá)量顯著高于10和50 mg/kg姜黃素組(q=7.799、6.769,P均<0.05)。見圖4。

a:P<0.05,與對照組比較；b:P<0.05,與10 mg/kg姜黃素組比較；c:P<0.05,與50 mg/kg姜黃素組比較

2.4.2 姜黃素對移植瘤中未折疊蛋白反應(yīng)下游通路蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比,姜黃素組中p-PERK和p-eIF2α表達(dá)量均顯著增加(P均<0.05),且各劑量組間p-PERK蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),呈一定的劑量依賴性。與對照組及10 mg/kg姜黃素組相比,IRE1在50、100 mg/kg姜黃素組中表達(dá)明顯增加(P均<0.05),且100 mg/kg姜黃素組明顯高于50 mg/kg姜黃素組(q=6.713,P<0.05)。CHOP在50、100 mg/kg姜黃素組中表達(dá)水平較對照組明顯增加(q=5.473、10.160,P均<0.05),且100 mg/kg姜黃素處組明顯高于10、50 mg/kg姜黃素組(q=6.822、4.688,P均<0.05),10、50 mg/kg姜黃素組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。

a:P<0.05,與對照組比較；b:P<0.05,與10 mg/kg姜黃素組比較；c:P<0.05,與50 mg/kg姜黃素組比較

2.4.3 姜黃素對移植瘤凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 免疫印跡結(jié)果顯示,與對照組比較,10、50和100 mg/kg姜黃素組中抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯減少(P均<0.05),50和100 mg/kg姜黃素組凋亡蛋白Cleaved Caspase-3表達(dá)明顯增加(q=5.631、10.160,P均<0.05)；與10 mg/kg姜黃素組比較,50和100 mg/kg姜黃素組中Cleaved Caspase-3表達(dá)亦明顯增加(q=4.850、9.375,P均<0.05)。見圖6。

a:P<0.05,與對照組比較；b:P<0.05,與10 mg/kg姜黃素組比較

2.5 姜黃素對瘤體組織中GRP78和IRE1表達(dá)的影響

免疫組化染色結(jié)果顯示,與對照組比較,10、50、100 mg/kg姜黃素組中GRP78和IRE1蛋白陽性表達(dá)評分明顯增加(P均<0.05),且各劑量組間GRP78和IRE1陽性表達(dá)評分差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05),呈一定的劑量依賴性。見圖7。

a:P<0.05,與對照組比較；b:P<0.05,與10 mg/kg姜黃素組比較；c:P<0.05,與50 mg/kg姜黃素組比較

3 討論

本研究采用人肝癌SMMC-7721細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤作為研究模型,實驗中所有裸鼠均植瘤成功,成瘤率為100%。此外,隨著用藥時間延長,所有組別裸鼠體重都呈緩慢上升趨勢,其體重增加無明顯差異；未發(fā)現(xiàn)各組裸鼠有消瘦或生長活動異常情況。由此表明,在一定時間內(nèi)姜黃素用藥對裸鼠自身生長無明顯影響,可能是一種相對安全的藥物。

本研究發(fā)現(xiàn),10、50、100 mg/kg姜黃素組移植瘤體積和瘤重均明顯小于對照組,表明姜黃素能有效抑制裸鼠肝癌皮下移植瘤生長。10 mg/kg姜黃素組移植瘤體積與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,可能是姜黃素劑量過低,導(dǎo)致其對腫瘤抑制作用不如50、100 mg/kg姜黃素組,但10 mg/kg姜黃素組移植瘤體積增長幅度仍小于對照組。本研究結(jié)果與戴莉等[10]相一致,由此表明,就瘤重而言,所用姜黃素劑量越高,抑瘤效果越明顯。

ERS激活是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一[11-12]。大量研究表明姜黃素可能是通過激活ERS通路進(jìn)而破壞腫瘤細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)達(dá)到抗癌目的[13-15]。Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)姜黃素通過破壞細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)來激發(fā)ERS誘導(dǎo)人乳頭狀甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞凋亡。本課題組前期研究也證實姜黃素能在體外通過激活ERS來誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡[8]。本研究發(fā)現(xiàn),50和100 mg/kg姜黃素處理組ERS標(biāo)志性蛋白GRP78蛋白表達(dá)明顯上調(diào),而在10 mg/kg姜黃素組中該蛋白表達(dá)較對照組有升高趨勢,但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義,可能提示藥物劑量較低,導(dǎo)致ERS雖已激活,但作用不強(qiáng)烈,從而對腫瘤抑制效果不明顯。Yang等[17]研究表明,雖然25 mg/kg姜黃素抗前列腺腫瘤效果與對照組相比有差異,但是其抗癌效果不如50、100 mg/kg姜黃素組,究其原因可能是較低劑量的姜黃素不足以刺激腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生過于持續(xù)而強(qiáng)烈的ERS。

當(dāng)發(fā)生ERS時,PERK與GRP78解離后迅速自磷酸化,磷酸化的PERK具有更強(qiáng)的活性。本實驗中p-PERK在3個姜黃素組中表達(dá)均較對照組明顯上調(diào),且呈一定的劑量依賴性。p-PERK介導(dǎo)eIF2α磷酸化,p-eIF2α活性遠(yuǎn)大于eIF2α且相對更容易檢測。在劉沙等[18]研究中,重組新城疫病毒在抑制肺癌移植瘤增長的同時,致瘤體組織內(nèi)p-eIF2α表達(dá)明顯增加,證實裸鼠腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)生ERS。本實驗中p-eIF2α在各姜黃素組中表達(dá)均較對照組明顯增加,其中50 mg/kg姜黃素組表達(dá)高于10 mg/kg姜黃素組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義,可能由于50 mg/kg姜黃素對活性更強(qiáng)的p-eIF2α蛋白激活效應(yīng)仍不夠強(qiáng)烈。未折疊蛋白反應(yīng)另一感受器蛋白IRE1在10 mg/kg姜黃素組中的表達(dá)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,表明該劑量無法刺激細(xì)胞產(chǎn)生過強(qiáng)的ERS。相對IRE1通路而言,PERK通路可能對低劑量的姜黃素更敏感。在郭立達(dá)等[19]研究中,單獨(dú)使用50 mg/kg姜黃素能較好地抑制結(jié)腸癌裸鼠移植瘤生長；同時還發(fā)現(xiàn),姜黃素和奧沙利鉑聯(lián)用可協(xié)同抗癌,抑瘤效果更好。在本實驗中,ERS通路相關(guān)蛋白在50 mg/kg姜黃素組中表達(dá)量明顯高于對照組,提示50 mg/kg可能為姜黃素有效抗癌劑量。最后免疫組化結(jié)果輔助證實ERS相關(guān)蛋白GRP78和IRE1陽性表達(dá)隨著姜黃素劑量增大而增加,與蛋白免疫印跡結(jié)果基本一致,提示ERS抑制腫瘤生長。

Caspase-3是Caspase級聯(lián)反應(yīng)中最關(guān)鍵的細(xì)胞凋亡執(zhí)行因子,而Bcl-2作為Caspase-3上游的調(diào)控因子,在細(xì)胞中具有明顯的抗凋亡作用[20-22]。本實驗結(jié)果顯示,經(jīng)過姜黃素作用后Bcl-2表達(dá)較對照組明顯降低,雖然3個姜黃素組間表達(dá)并無明顯差異,但是隨著姜黃素劑量增大,Bcl-2表達(dá)量呈下降趨勢。后續(xù)實驗中可測定Bax表達(dá)水平,計算Bcl-2與Bax表達(dá)水平的比值,以便更好地闡釋在姜黃素作用下Bcl-2對細(xì)胞凋亡的調(diào)控[19]。此外,本研究結(jié)果顯示,50、100 mg/kg姜黃素組中Cleaved Caspase-3表達(dá)明顯高于對照組和10 mg/kg姜黃素組,提示在50、100 mg/kg劑量時,姜黃素促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用明顯,且呈一定的劑量依賴性。CHOP是未折疊蛋白反應(yīng)中介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白,且其與未折疊蛋白反應(yīng)的3個通路均有關(guān)[23]。在姜黃素作用下,CHOP信號通路被激活,同時Bcl-2表達(dá)下調(diào)引發(fā)線粒體外膜通透性改變,繼而釋放細(xì)胞色素C,進(jìn)而釋放凋亡小體,活化Caspase-9,產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng),最終活化Caspase-3,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[24-26]。本實驗發(fā)現(xiàn),50、100 mg/kg姜黃素組中CHOP表達(dá)明顯高于對照組及10 mg/kg姜黃素組,而10 mg/kg姜黃素組CHOP表達(dá)雖較對照組有上升趨勢,但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義；由此提示,當(dāng)姜黃素劑量大于50 mg/kg時,可激活ERS的關(guān)鍵蛋白CHOP,進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡,這也印證了前文所述的推測,即50 mg/kg可能是姜黃素的最低抗癌有效劑量。此外,敲除或過表達(dá)ERS相關(guān)基因后姜黃素在體內(nèi)抗肝癌的效果有待進(jìn)一步探索。同時,姜黃素與臨床上常用的其他與ERS相關(guān)抗肝癌化療藥物聯(lián)合應(yīng)用的抗癌效果亦有待研究。

綜上所述,本研究結(jié)果表明,姜黃素可抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞裸鼠移植瘤生長,其機(jī)制可能與激活ERS通路有關(guān),進(jìn)而通過共同的CHOP途徑抑制下游的抗凋亡蛋白Bcl-2、增強(qiáng)凋亡蛋白Cleaved Caspase-3表達(dá)來抑制肝癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡。