任錕 李彥杰 邢若星 趙晶 張志鑫

缺血性腦血管病是嚴(yán)重危害人類生命健康的常見(jiàn)病和多發(fā)病。研究表明內(nèi)皮功能障礙是缺血性腦血管病發(fā)病的早期事件[1]。非對(duì)稱性二甲基精氨酸 (asymmetric dimethylarginine,ADMA)是一種一氧化氮合成酶的內(nèi)源性抑制劑，血清中ADMA水平升高可降低一氧化氮的生物利用度，誘發(fā)內(nèi)皮功能障礙。有研究結(jié)果顯示，ADMA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)具有促進(jìn)作用[2]，血清ADMA水平升高可誘導(dǎo)血管發(fā)生炎性反應(yīng)[3]，加速腦血管疾病的進(jìn)程。因此，抑制ADMA誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷和氧化應(yīng)激可能是缺血性腦血管病的一個(gè)有效治療靶點(diǎn)。

槲皮素是一種天然的黃酮類化合物，存在于多種植物的花、葉、果實(shí)中，具有抗氧化、抗炎、抑制新生血管生成等作用[4]。研究表明，槲皮素能抑制牙齦上皮細(xì)胞內(nèi)多種炎性因子的表達(dá)，增加小鼠視網(wǎng)膜中的抗氧化物質(zhì)以減輕糖尿病視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激狀態(tài)，通過(guò)抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、抗凋亡的機(jī)制發(fā)揮心血管保護(hù)作用[5-8]。但是，槲皮素對(duì)腦缺血性損傷是否也具有保護(hù)作用及其作用機(jī)制相關(guān)報(bào)道較少。

筆者通過(guò)建立ADMA誘導(dǎo)人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞(human brain microvascular endothelial cells，HBMECs)氧化應(yīng)激損傷模型，模擬缺血性腦血管病發(fā)生后血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，分析槲皮素對(duì)損傷后腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，從而為缺血性腦血管病的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

HBMEC細(xì)胞株(上海中喬新舟生物科技有限公司)；RPMI 1640培養(yǎng)液(批號(hào)：8116492，GIBCO公司，美國(guó))；胎牛血清(批號(hào)：111005，杭州四季青公司)；3-(4,5-二里基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT；Sigma公司，美國(guó)]；兔抗人Bcl-2、Bax、p38、磷酸化p38(phosphorylated p38，p-p38)、c-Jun氨基末端激酶 (c-Jun N-terminal kinase,JNK)、磷酸化JNK(phosphorylated JNK，p-JNK)、β-actin抗體(Abcam 公司，美國(guó))；茴香霉素(anisomycin,ANISO)和 P79350(Calbiochem公司，美國(guó))；槲皮素(批號(hào)：008129304，中國(guó)藥品生物制品檢定所)； ADMA和caspase-3檢測(cè)試劑盒(Sigma公司，美國(guó))；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH；批號(hào)：201706002)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD；批號(hào)：165857049)、活性氧(批號(hào)：146994049)、丙二醛(批號(hào)：20170117)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 (brain derived neurotrophic factor,BDNF；批號(hào)：20170817)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組:RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、1%雙抗)在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HBMECs接種于96孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每孔200 μl，約含2×104個(gè)細(xì)胞。第一部分實(shí)驗(yàn)分組如下：對(duì)照組(不加任何干預(yù)因素)，ADMA組(在細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入終濃度為30 μmol/L的ADMA作用24 h)，ADMA+槲皮素處理組(加入終濃度分別為0.1、1、10、100 μmol/L的槲皮素預(yù)處理2 h后再加入終濃度為30 μmol/L 的ADMA作用24 h)，100 μmol/L槲皮素處理組(100 μmol/l的槲皮素預(yù)處理2 h后換常規(guī)培養(yǎng)液)，每組6個(gè)樣本；第二部分實(shí)驗(yàn)分組如下：對(duì)照組(不加任何干預(yù)因素)，ADMA組(在細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入終濃度為30 μmol/L的ADMA作用24 h)，ADMA+槲皮素處理組(加入終濃度為10 μmol/L的槲皮素預(yù)處理2 h后再加入終濃度為30 μmol/L的ADMA作用24 h)，10 μmol/L槲皮素處理組(10 μmol/L的槲皮素預(yù)處理2 h后換常規(guī)培養(yǎng)液)，ANISO/P79350+ADMA+槲皮素處理組(加入終濃度為10 μmol/L的槲皮素預(yù)處理2 h后再加入終濃度為30 μmol/L的ADMA作用24 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 h加入10 μmol/L的ANISO或50 μmol/L的P79350)，ANISO/P79350處理組(常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 h加入10 μmol/L的NAISO或50 μmol/L的P79350)，每組6個(gè)樣本。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活情況：所有組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后加入MTT溶液(5 g/L)10 μl，孵育4 h后吸出上清液，加入二甲基亞砜，震蕩后，酶標(biāo)儀490 nm處檢測(cè)吸光度(A值)。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

1.2.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)LDH、SOD、活性氧、丙二醛、BDNF水平：將所有組細(xì)胞接種于24孔板(5×104個(gè)/孔)，相應(yīng)藥物處理后，收集上清液，ELISA法檢測(cè)LDH、SOD、活性氧、丙二醛、BDNF的濃度。具體操作依據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

1.2.4Western blotting分析：采用0.05%胰蛋白酶消化第二部分實(shí)驗(yàn)分組各組細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液洗滌3次；常規(guī)方法裂解細(xì)胞，二喹啉甲酸法蛋白定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳；轉(zhuǎn)膜后，用5%脫脂奶粉封閉，洗膜3次，加入兔抗人Bcl-2、Bax、p38、p-p38、JNK、p-JNK、β-actin抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，電化學(xué)發(fā)光法顯色，Scion Image圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)條帶，蛋白相對(duì)表達(dá)量以目的蛋白與β-actin條帶灰度比值表示。以JNK和p38蛋白磷酸化水平來(lái)衡量JNK/p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases,p38 MAPK)信號(hào)通路活性。每個(gè)蛋白重復(fù)檢測(cè)3次。

1.2.5逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測(cè)Bax、Bcl-2和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)基因表達(dá)水平： 對(duì)于第二部分實(shí)驗(yàn)分組各組，PCR擴(kuò)增引物應(yīng)用在線軟件設(shè)計(jì)后交由上海生物工程有限公司合成，實(shí)驗(yàn)過(guò)程依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，Bax上游引物為5′- TCATGGGCTGGACATTGGAC-3′，下游引物為5′- GAGACAGGGACATCAGTCGC-3′；Bcl-2上游引物為5′-TTCTTTGAGTTCGGTGGGGTC-3′，下游引物為5′-TGCATATTTGTTTGGGGCAGG-3′；eNOS上游引物為5′-CTTCAAGTTGCCCAT-3′，下游引物為5′-ATGGGCAACTTGAAG-3′；β-actin上游引物為5′-ACTCGTCATACTCCTGCT-3′，下游引物為5′-GAAACTACCTTCAACTCC-3′。每個(gè)基因重復(fù)檢測(cè)3次。

1.2.6caspase-3活性檢測(cè)(分光光度法)：常規(guī)方法胰酶消化第二部分實(shí)驗(yàn)分組各組貼壁細(xì)胞，收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液洗滌，棄上清，以每2×106細(xì)胞50 μl裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解30 min。12 000 r/min(離心半徑10 cm)，4 ℃離心10～15 min，小心吸取上清，放置冰上待用，檢測(cè)方法依據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對(duì)ADMA誘導(dǎo)的細(xì)胞活性及功能的影響

細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，ADMA組HBMECs活性明顯降低，LDH水平明顯升高，HBMECs上清液中BDNF濃度明顯減低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05) ，而100 μmol/L槲皮素處理組HBMECs活性和LDH、BDNF濃度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；與ADMA組比較，ADMA+1 μmol/L槲皮素處理組、ADMA+10 μmol/L槲皮素處理組和ADMA+100 μmol/L槲皮素處理組細(xì)胞LDH水平均明顯降低，BDNF水平均明顯增高，ADMA+10 μmol/L槲皮素處理組和ADMA+100 μmol/L槲皮素處理組HBMECs活性均明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；與ADMA+0.1 μmol/L槲皮素處理組比較，ADMA+10 μmol/L槲皮素處理組和ADMA+100 μmol/L槲皮素處理組細(xì)胞活性和BDNF水平均明顯升高，LDH水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；與ADMA+1 μmol/L槲皮素處理組比較，ADMA+10 μmol/L槲皮素處理組和ADMA+100 μmol/L槲皮素處理組LDH水平均明顯降低，BDNF水平明顯增高，ADMA+100 μmol/L槲皮素處理組HBMECs活性明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 槲皮素對(duì)ADMA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組比較，ADMA組HBMEC中Bcl-2 mRNA水平明顯降低，Bax mRNA表達(dá)水平和caspase-3活性明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與ADMA組比較，ADMA+槲皮素處理組和10 μmol/L槲皮素處理組的Bcl-2 mRNA水平均明顯升高，Bax mRNA表達(dá)水平和caspase-3活性均明顯減低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05，表2，圖1)。

表1 槲皮素對(duì)ADMA誘導(dǎo)的HBMECs細(xì)胞活性 及LDH、BDNF水平的影響以對(duì)照組為參照)

注：ADMA為非對(duì)稱性二甲基精氨酸，HBMECs為人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，LDH為乳酸脫氫酶，BDNF為腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與ADMA組比較，bP<0.05；與ADMA+0.1 μmol/L槲皮素處理組比較，cP<0.05；與ADMA+1 μmol/L槲皮素處理組比較，dP<0.05；與ADMA+10 μmol/L槲皮素處理組比較，eP<0.05；與ADMA+100 μmol/L槲皮素處理組比較，fP<0.05

表2 槲皮素對(duì)ADMA誘導(dǎo)的HBMECs細(xì)胞凋亡 相關(guān)基因/蛋白的影響以對(duì)照組為參照)

注：ADMA為非對(duì)稱性二甲基精氨酸，HBMECs為人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞；A組為ADMA+槲皮素處理組，B組為10 μmol/L槲皮素處理組；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與ADMA組比較，bP<0.05

2.3 槲皮素對(duì)ADMA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響

與對(duì)照組比較，ADMA組HBMECs的活性氧、丙二醛水平明顯升高，SOD和eNOS mRNA表達(dá)明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；與ADMA組比較，ADMA+槲皮素處理組和10 μmol/L槲皮素處理組活性氧、丙二醛水平明顯降低，SOD和eNOSmRNA明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05，表3)。

表3 槲皮素對(duì)ADMA誘導(dǎo)的HBMECs細(xì)胞氧化/ 抗氧化因子水平的影響以對(duì)照組為參照)

注：ADMA為非對(duì)稱性二甲基精氨酸，HBMECs為人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，SOD為超氧化物歧化酶，eNOS為內(nèi)皮型一氧化氮合酶；A組為ADMA+槲皮素處理組，B組為10 μmol/L槲皮素處理組；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與ADMA組比較，bP<0.05

2.4 槲皮素抑制JNK/p38 MAPK 信號(hào)通路活性

與對(duì)照組比較，ADMA組JNK和p38磷酸化水平明顯增高(均P<0.05)；與ADMA組比較，ADMA+槲皮素處理組JNK和p38磷酸化水平明顯降低(均P<0.05)；與ADMA+槲皮素處理組比較，ANISO+ADMA+槲皮素處理組JNK磷酸化水平和P79350+ADMA+槲皮素處理組p38磷酸化水平均明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05，圖2，表4)。

進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞活性及功能，結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，ADMA組細(xì)胞活性和BDNF水平明顯降低，LDH水平明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表4 槲皮素對(duì)JNK/p38 MAPK信號(hào)通路磷酸化 水平的影響以對(duì)照組為參照)

注： JNK/p38 MAPK為c-Jun氨基末端激酶/p38絲裂原活化蛋白激酶，ADMA為非對(duì)稱性二甲基精氨酸；ANISO為茴香霉素,ANISO和P79350均為JNK激動(dòng)劑；p-JNK為磷酸化JNK，p-p38為磷酸化p38；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與ADMA組比較，bP<0.05；與ADMA+槲皮素處理組比較，cP<0.05；“-”表示無(wú)相關(guān)數(shù)據(jù)

與ADMA組比較，ADMA+槲皮素處理組細(xì)胞活性和BDNF水平明顯增加，LDH水平明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與ADMA+槲皮素處理組比較，ANISO+ADMA+槲皮素處理組和P79350+ADMA+槲皮素處理組細(xì)胞活性和BDNF水平明顯降低，LDH水平明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05，表5)。

3 討論

缺血性腦血管疾病發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，內(nèi)皮功能障礙在疾病的發(fā)生中起重要作用。有研究表明，某些心血管疾病的內(nèi)皮功能障礙與血漿ADMA水平升高有關(guān)[9]。因此，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受ADMA誘導(dǎo)的損傷可能是防止缺血性腦血管損傷的有效治療靶點(diǎn)。本研究中，在30 μmol/L ADMA預(yù)處理HBMECs 24 h后，細(xì)胞損傷明顯，LDH釋放增加，細(xì)胞活性降低，BDNF濃度降低，槲皮素能夠以劑量依賴的方式顯著降低ADMA誘導(dǎo)的LDH升高，促進(jìn)細(xì)胞活力，改善細(xì)胞功能。

表5 槲皮素對(duì)ADMA誘導(dǎo)的HBMECs細(xì)胞活性的 影響以對(duì)照組為參照)

注：ADMA為非對(duì)稱性二甲基精氨酸，HBMECs為人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞；ANISO為茴香霉素，ANISO和P79350均為JNK激動(dòng)劑；LDH為乳酸脫氫酶，BDNF為腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與ADMA組比較，bP<0.05；與ADMA+槲皮素處理組比較，cP<0.05

氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的重要刺激因子之一，在內(nèi)皮功能障礙的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[10]?；钚匝醯倪^(guò)度生成是氧化應(yīng)激開始的標(biāo)志之一[11]。有研究表明，ADMA可濃度依賴性地增加內(nèi)皮細(xì)胞活性氧產(chǎn)生[12]。本研究中，ADMA能顯著促進(jìn)HBMEC活性氧的產(chǎn)生，下調(diào)eNOS的表達(dá)和SOD的濃度。槲皮素預(yù)處理可顯著降低活性氧的產(chǎn)生，增強(qiáng)eNOS mRNA的表達(dá)水平，促進(jìn)SOD的釋放，減輕ADMA所引起的氧化應(yīng)激。同時(shí)，槲皮素預(yù)處理還可以有效降低ADMA誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化，下調(diào)細(xì)胞上清液中丙二醛水平[13]。進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3的檢測(cè)結(jié)果顯示，ADMA可顯著抑制細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)，促進(jìn)Bax mRNA表達(dá)，上調(diào)caspase-3活性，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而槲皮素可明顯抑制這一作用。該結(jié)果提示槲皮素可通過(guò)抗氧化機(jī)制，發(fā)揮對(duì)ADMA誘導(dǎo)下?lián)p傷的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。

MAPKs家族可同時(shí)對(duì)絲氨酸和酪氨酸殘基進(jìn)行磷酸化，其經(jīng)典的信號(hào)通路包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶、JNK和p38 MAPK。MAPKs可對(duì)多種刺激作出反應(yīng)并參與細(xì)胞的凋亡[14]。研究結(jié)果表明，氧化應(yīng)激/活性氧水平的增加可激活JNK/p38 MAPK信號(hào)，進(jìn)而誘導(dǎo)缺血-再灌注損傷和糖尿病的發(fā)生[15-16]。本研究中，ADMA刺激可促進(jìn)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中JNK和p38 MAPK的磷酸化，而槲皮素預(yù)處理可抑制JNK和p38 MAPK信號(hào)的激活，應(yīng)用JNK激動(dòng)劑ANISO或p38 MAPK激動(dòng)劑P79350預(yù)處理可顯著抵消槲皮素的抗氧化作用。這些結(jié)果提示槲皮素可能是通過(guò)調(diào)節(jié)JNK/p38 MAPK信號(hào)通路來(lái)對(duì)ADMA刺激下的HBMECs起保護(hù)作用。

綜上所述，槲皮素能夠緩解氧化應(yīng)激條件下腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，其抗氧化作用機(jī)制可能與JNK/p38 MAPK信號(hào)通路的抑制有關(guān)。