陳平 丁燕飛 忻笑容 謝玲 周郁芬 吳云林

脂質(zhì)運(yùn)載蛋白-2(lipocalin 2，Lcn-2)，又稱中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白或噬鐵蛋白，是一種新型的分泌性蛋白，與炎癥、免疫反應(yīng)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和組織重構(gòu)密切相關(guān)[1]。Lcn-2作為細(xì)胞化學(xué)趨化物N-甲酰硫亮氨酰苯丙氨酸的受體之一，可誘導(dǎo)白細(xì)胞內(nèi)顆粒釋放，趨化炎癥細(xì)胞聚集，消滅病原微生物。泌尿系感染、胃腸道炎癥、慢性阻塞性肺病、哮喘等疾病時(shí)Lcn-2呈高表達(dá)[2]，但其在急性胰腺炎(AP)時(shí)的表達(dá)狀況鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究檢側(cè)急性壞死性胰腺炎(acute necrosis pancreatitis，ANP)大鼠Lcn-2的表達(dá)，分析Lcn-2表達(dá)與血淀粉酶、C反應(yīng)蛋白(c reactive protein, CRP)水平及繼發(fā)的急性肺損傷的關(guān)系，為AP發(fā)生、發(fā)展的預(yù)判及治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

一、材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：健康SD雄性大鼠，體重(150±30)g，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。術(shù)前禁食24 h、不禁水。按隨機(jī)表法將大鼠分為對(duì)照組(8只)和ANP組(24只)。采用胰膽管內(nèi)逆行注射3.5%?；悄懰徕c(1 ml/kg，Sigma公司)方法制備大鼠ANP模型。對(duì)照組注射等容積生理鹽水。ANP組分別在造模后6 、24、48 h分批處死，對(duì)照組于術(shù)后48 h處死。腹主動(dòng)脈取血，離心分離血清，置-80℃保存。取胰腺、肺組織分別置4%多聚甲醛溶液固定和液氮中保存。

2．檢測(cè)指標(biāo)：(1)血清CRP、淀粉酶水平，采用Beckman X7型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)；(2)胰腺、肺組織常規(guī)病理檢查，并參考文獻(xiàn)[3]的方法進(jìn)行病理評(píng)分；(3)取支氣管肺泡灌洗液，應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)板于光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞總數(shù)；(4)取適量新鮮肺組織稱濕重，再置72℃干燥箱內(nèi)烘烤24 h后稱干重，計(jì)算肺濕/干重系數(shù)，即(濕重-干重)/干重×100%。

3．肺組織Lcn-2蛋白表達(dá)檢測(cè)：取固定的組織，常規(guī)石蠟包埋、切片，采用S-P法行免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)Lcn-2蛋白表達(dá)。兔抗鼠Lcn-2多克隆抗體購(gòu)自Cell signaling公司，工作濃度1∶100。胞質(zhì)和(或)胞膜呈棕黃色為L(zhǎng)cn-2表達(dá)陽(yáng)性。

取冷凍肺組織，應(yīng)用蛋白裂解液裂解獲取組織總蛋白，BCA法定量后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Lcn-2蛋白表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。兔抗鼠Lcn-2多克隆抗體工作濃度1∶100，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自上?？党晒?，工作濃度1∶1 000。采用ECL液(Pierce公司)顯影。應(yīng)用Image J軟件獲取條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

二、結(jié)果

1．血清CRP、淀粉酶水平及胰腺病理改變：ANP組大鼠胰腺組織可見(jiàn)間質(zhì)腫脹，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，微血管壁結(jié)構(gòu)破壞，紅細(xì)胞滲出，腺泡細(xì)胞和脂肪細(xì)胞壞死，且隨時(shí)間延長(zhǎng)而加重。對(duì)照組大鼠胰腺組織未見(jiàn)明顯病理學(xué)改變。ANP組各時(shí)間點(diǎn)血清CRP、淀粉酶水平及胰腺病理學(xué)評(píng)分均較對(duì)照組顯著升高，且呈時(shí)間依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2．肺支氣管肺泡灌洗液炎癥細(xì)胞數(shù)、肺濕/干重系數(shù)及肺組織病理評(píng)分：ANP大鼠肺組織在造模后6 h可見(jiàn)肺泡間質(zhì)充血水腫，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；24 h可見(jiàn)肺泡間質(zhì)腫脹，肺泡壁破壞，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，微血管壁結(jié)構(gòu)破壞，肺泡內(nèi)出血；48 h可見(jiàn)明顯的微血管壁結(jié)構(gòu)破壞，肺泡內(nèi)出血；對(duì)照組肺組織未見(jiàn)明顯病理學(xué)改變。ANP組肺泡灌洗液炎癥細(xì)胞數(shù)、肺濕/干重系數(shù)和肺組織病理學(xué)評(píng)分均較對(duì)照組顯著升高，并呈時(shí)間依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表1 大鼠血清CRP、淀粉酶水平及胰腺組織病理評(píng)分在對(duì)照組和ANP組的比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01；與ANP 6 h組比較，bP<0.01；與ANP 24 h組比較，cP<0.01

表2 大鼠肺泡灌洗液炎癥細(xì)胞數(shù)、肺濕/干重系數(shù)及肺組織病理評(píng)分在對(duì)照組和ANP組的比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01；與ANP 6 h組比較，bP<0.01；與ANP 24 h組比較，cP<0.01

3．肺組織Lcn-2蛋白表達(dá)：對(duì)照組肺泡細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有少量棕色顆粒；ANP 6 h組胞質(zhì)內(nèi)有少量棕色顆粒，24、48 h組胞質(zhì)內(nèi)有密集的棕色顆粒(圖1)。對(duì)照組及ANP 6、24、48 h組肺組織Lcn-2表達(dá)量分別為0.13±0.03、0.22±0.03、0.32±0.03、0.42±0.03，ANP組較對(duì)照組顯著升高，且呈時(shí)間依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01，圖2)。

圖1 對(duì)照組(1A)及ANP 6、24、48 h組(1B、1C、1D)肺組織Lcn-2蛋白表達(dá)(免疫組化染色 ×400)

圖2 對(duì)照組(1)及ANP 6、24、48 h組(2、3、4)肺組織Lcn-2蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)

肺組織中的Lcn-2表達(dá)水平與肺組織損傷病理學(xué)評(píng)分、肺濕/干重系數(shù)和肺支氣管肺泡灌洗液炎癥細(xì)胞數(shù)均呈正相關(guān)(r值分別為0.862、0.866、0.875，P值均<0.01)。

討論AP繼發(fā)急性肺損傷的發(fā)生率可達(dá)35%，其機(jī)制可能與病程中胰酶自身消化和單核巨噬細(xì)胞活化激活中性粒細(xì)胞，釋放促炎遞質(zhì)，并通過(guò)炎癥遞質(zhì)級(jí)聯(lián)放大，誘導(dǎo)肺組織內(nèi)炎癥細(xì)胞積聚、活化，導(dǎo)致急性肺損傷，故急性肺損傷的實(shí)質(zhì)就是由多種炎癥細(xì)胞參與的肺臟組織過(guò)度炎癥反應(yīng)[4]。

Lcn-2屬載脂蛋白家族成員之一，在人體內(nèi)分布廣泛，如腎臟、支氣管、胃、小腸、胰腺、前列腺及胸腺等處[5]。有研究認(rèn)為，Lcn-2參與鐵轉(zhuǎn)運(yùn)、抗菌、腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等過(guò)程；Lcn-2作為一種新型的細(xì)胞因子，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)分化調(diào)節(jié)及組織內(nèi)蛋白水解、膠原降解過(guò)程；Lcn-2具有調(diào)節(jié)胰島素敏感度的作用，在2型糖尿病的進(jìn)展過(guò)程中扮演重要角色[6]。有研究認(rèn)為，Lcn-2水平在炎癥反應(yīng)時(shí)表達(dá)上調(diào)，并與多種炎癥遞質(zhì)(IL-1、IL-2、IL-8和腫瘤壞死因子α)相互作用；Lcn-2參與運(yùn)輸炎癥反應(yīng)的一些親脂因子(血小板活化因子、白三烯B4和脂多糖等)與MMP-9結(jié)合，促進(jìn)MMP-9參與炎癥反應(yīng)，可作為評(píng)價(jià)炎癥導(dǎo)致的內(nèi)皮損傷嚴(yán)重程度指標(biāo)之一[7-8]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，小鼠肺炎時(shí)呼吸道上皮細(xì)胞通過(guò)激活Toll樣受體4通路增加Lcn-2表達(dá)[9]，Lcn-2又促進(jìn)呼吸道上皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-8，參與介導(dǎo)中性粒細(xì)胞趨化活動(dòng)，導(dǎo)致肺損傷[10]。AP并發(fā)腎損傷后18、24 h，尿中Lcn-2水平明顯升高，可作為急性腎損傷的早期標(biāo)記物[11]，推測(cè)Lcn-2可能是一種類似于CRP的新型急性時(shí)相蛋白。 本研究結(jié)果顯示，ANP大鼠血清CRP、淀粉酶水平及胰腺病理評(píng)分均增加，同時(shí)肺組織損傷呈時(shí)間依賴性加重，肺組織Lcn-2蛋白表達(dá)也呈時(shí)間依賴性上調(diào)，提示Lcn-2可作為監(jiān)測(cè)肺損傷嚴(yán)重程度的指標(biāo)，為開(kāi)展以Lcn-2為靶點(diǎn)的治療提供理論基礎(chǔ)。