李 箐，于 欣，周 鋼，毋育偉，胡洪成，王 彤，唐志輝△

(1. 北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院，口腔醫(yī)學(xué)數(shù)字化研究中心 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國家工程實驗室 口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點實驗室， 北京 100081； 2. 北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院， 北京 100191； 3. 北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院第二門診部， 北京 100101)

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·論著·

殼聚糖微球/小牛松質(zhì)骨支架復(fù)合緩釋體系的制備及體外生物活性評價

李 箐1，于 欣2，周 鋼2，毋育偉3，胡洪成3，王 彤3，唐志輝1△

(1. 北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院，口腔醫(yī)學(xué)數(shù)字化研究中心 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國家工程實驗室 口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點實驗室， 北京 100081； 2. 北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院， 北京 100191； 3. 北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院第二門診部， 北京 100101)

目的：通過乳液交聯(lián)法合成殼聚糖微球并負載骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)，再將其復(fù)合于脫細胞基質(zhì)的小牛松質(zhì)骨支架，制備殼聚糖微球/小牛松質(zhì)骨支架復(fù)合緩釋體系。方法： 使用紅外光譜儀、掃描電鏡對合成的復(fù)合緩釋系統(tǒng)進行結(jié)構(gòu)表征和形貌觀察，并對微球的包封率和載藥量進行檢測。用動態(tài)浸泡的方法來檢測BMP-2的體外釋放特征，通過體外檢測復(fù)合體系的細胞毒性和對細胞增殖的影響。結(jié)果： 殼聚糖發(fā)生了交聯(lián)并成功包載了BMP-2，微球平均直徑為5.982 μm，表面光滑，且成功負載于小牛松質(zhì)骨支架，形成了新型的微球/支架藥物緩釋體系。緩釋數(shù)據(jù)表明，5 mg微球在體外釋放21 d，BMP-2逐漸釋放，第21天時濃度仍達到(239.1±20.0) mg/L。體外測試表明，該緩釋體系有利于小鼠前成骨細胞MC3T3-E1的生長，促進向成骨方向分化。結(jié)論： 殼聚糖微球/小牛松質(zhì)骨支架復(fù)合緩釋體系實現(xiàn)了BMP-2的生物學(xué)功能及其在骨修復(fù)部位的持續(xù)、緩慢釋放，為骨組織缺損的修復(fù)治療及骨組織工程支架材料的選擇提供了依據(jù)。

殼聚糖；微球體；藥物釋放系統(tǒng)；小牛松質(zhì)骨

骨組織的損傷修復(fù)與重建一直是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)努力尋求解決方法以應(yīng)對的難題[1-2]。骨的形成、代謝及隨之發(fā)生的修復(fù)重建過程是由成骨細胞、破骨細胞以及多種生長因子共同參與的復(fù)雜過程，維持這一動態(tài)平衡需要生長因子的持續(xù)釋放[3]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP-2)已廣泛應(yīng)用于骨缺損疾病方面的治療[4-5]，但其單獨應(yīng)用時存在半衰期短、會擴散至全身等副作用，因此，如何有效維持BMP-2生長因子的局部持續(xù)釋放，成為臨床藥物領(lǐng)域的重要發(fā)展方向[6]。

在藥物控制釋放行為中，藥物載體材料起了非常重要的作用。理想的載藥材料應(yīng)該具有良好的生物相容性、生物可降解性、生物穩(wěn)定性和極低的毒性，并且有較高的載藥性[7-8]。殼聚糖(chitosan，CS)是一種天然聚陽離子堿性多糖，近年研究證實，CS具有生物黏附性和多種生物活性，能與活體組織相容，不會引起過敏反應(yīng)和排斥現(xiàn)象，其被體內(nèi)的溶菌酶、胃蛋白酶降解后，降解產(chǎn)物能完全地被人體吸收，無毒副作用，比較適于作為緩釋輔料[8]。CS制成微球包封藥物后，可使藥物釋放減慢、療效延長，毒副作用降低，利用CS制備緩釋、控釋制劑已成為近年來新劑型研究的熱點[9]。

為了更好地實現(xiàn)BMP-2的生物學(xué)功能及其在骨修復(fù)部位的持續(xù)緩慢釋放，本研究將CS作為緩釋載體材料，制備包裹BMP-2的CS微球(CS/BMP-2)，并將其復(fù)合高溫煅燒的小牛松質(zhì)骨(ceramic bovine bone，CBB)支架材料，制備CS微球/CBB支架復(fù)合緩釋體系(CS/BMP-2/CBB)，檢測該復(fù)合材料的理化性能、體外藥物釋放以及生物活性等特征。觀察骨髓基質(zhì)細胞在煅燒骨材料上的黏附、生長與增殖情況，從而進一步地研究對小鼠前成骨細胞MC3T3-E1的增殖和分化的影響，為骨組織缺損的修復(fù)治療及骨組織工程支架材料的選擇提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和設(shè)備

CS平均相對分子質(zhì)量25×104，脫乙酰度90%，購自濟南海得貝生物工程有限公司；牛骨購自中國農(nóng)機院；BMP-2由美國美敦力公司提供；Ⅰ型膠原、BMP-2酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒購自美國Sigma公司；香草醛購自北京瀛海精細化工廠。實驗中所用的其他試劑均為分析純。

實驗所用設(shè)備包括傅立葉變換紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR，日本島津-8900)和場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FEI 250，美國FEI公司)。

1.2 CBB支架的制備

選用新鮮牛肱骨骨垢端松質(zhì)骨，截取3 mm×3 mm×15 mm形狀規(guī)則的長方形骨條，氫氧化鈉、雙氧水溶液浸泡后，高壓蒸煮2 h，去除部分蛋白及膠原，去離子水洗凈、烘干。將干燥的骨條放入馬弗爐中煅燒，緩慢升至700 ℃，氧氣氛圍2 h煅燒，形成保留自然骨架結(jié)構(gòu)的骨磷灰石骨架，將煅燒后的骨條浸入0.09 mol/L焦磷酸鈉溶液中，70 ℃水浴浸泡72 h，干燥后將骨條再放入馬弗爐中煅燒，緩慢升溫至1 200 ℃，維持1 h，制備成經(jīng)2次煅燒的牛松質(zhì)骨塊。將煅燒骨塊研磨成顆粒，通過標(biāo)準(zhǔn)篩的標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)孔過濾，得到0.25～1.00 mm的煅燒骨顆粒。

1.3 CS/BMP-2微球緩釋體系制備

采用乳化交聯(lián)法制備CS/BMP-2藥物緩釋微球。稱取1.5 g CS溶于2.4%(體積分?jǐn)?shù))稀醋酸溶液60 mL中，待其完全溶解后，加入一定量的BMP-2，機械攪拌使二者混合均勻。將混合后的溶液緩慢加入含2.7%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的Tween 80和2.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的Span 80的液體石蠟溶液380 mL，室溫下機械攪拌3 h。向其中緩慢滴加香草醛乙醇溶液，使CS發(fā)生交聯(lián)。滴加完畢后繼續(xù)攪拌6 h，靜置，取出沉淀物，用石油醚、異丙醇反復(fù)漂洗，最后將沉淀物冷凍干燥至恒重，制備出負載BMP-2的CS微球，裝置示意圖如圖1所示。

圖1 乳化交聯(lián)法制備CS/BMP-2微球的裝置示意圖

Figure 1 Schematic of preparing CS/BMP-2 microspheres

1.4 CS/BMP-2/CBB復(fù)合緩釋體系的制備

室溫下用0.05 mol/L的乙酸溶液配制0.1 g/mLⅠ型膠原溶液，將CS/BMP-2微球配制成1%～2%的微球-膠原溶液，再將CBB骨粉支架均勻分散于上述微球-膠原溶液中，真空冷凍干燥8 h，得到的復(fù)合材料在4 ℃用50 mmol/L EDC和25 mmol/L NHS進行交聯(lián)12 h，得到的復(fù)合材料用蒸餾水洗滌30 min后在-80 ℃冷凍1 h，再冷凍干燥24 h，得到CS/BMP-2/CBB復(fù)合緩釋系統(tǒng)。

1.5 生物性能測試與表征

負載前后，材料通過FT-IR分析其化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化情況，再將干態(tài)微球及支架材料均勻散在樣品平臺上，用導(dǎo)電膠固定，場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察微球表面形態(tài)。

1.6 包封率和載藥量測定

為檢測CS/BMP-2微球的包封率和載藥量，本實驗采用具有較高靈敏度的ELISA試劑盒檢測法，使用ELISA試劑盒測試材料的離心上清液中剩余的BMP-2量來推斷材料的載藥率和包封率。按照ELISA試劑盒說明書操作，測定450 nm下的光密度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)方程計算樣品中BMP-2濃度，推算出上清液中BMP-2量，同等條件重復(fù)試驗3次。載藥率=(投入BMP-2總量-上清液中BMP-2總量)/微球總質(zhì)量×100%，包封率=(投入BMP-2總量-上清液中BMP-2總量)/投入BMP-2總量×100%。

1.7 CS/BMP-2微球的體外緩釋

將5 mg BMP-2微球浸泡于2 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS，pH 7.4)中，置于37 ℃孵箱中進行緩釋。在每個測試時間點(1、3、5、7、10、14、21 d)收集緩釋液并用等量的PBS更換，然后儲存于-20 ℃冰箱中。CS微球用800 μL醋酸溶液溶解，稀釋于3.5 mL PBS中，檢測微球中BMP-2的含量。BMP-2濃度的測定嚴(yán)格根據(jù)BMP-2 ELISA檢測試劑盒的操作方法進行，每組重復(fù)3次。

1.8 細胞培養(yǎng)

1.8.1 CCK-8法檢測細胞增殖 取P3代MC3T3-E1細胞，以1×106個/mL的密度接種于T25培養(yǎng)瓶中，用α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞共分為3組，CON組(不含生長因子)、BMP-2組(1 mg/L、1.25 mg/L)。實驗組實驗前，用70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇和8.3 g/L的生理鹽水對CS/BMP-2/CBB復(fù)合緩釋體系材料進行消毒，無菌PBS完全清洗后放置于紫外燈下照射消毒。將上述各組細胞接種細胞懸液于96孔板中(1×103個/孔)，隔天換培養(yǎng)基，分別于第1、3、5、7、14天每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h，酶標(biāo)儀(Bro-rad 680)測定450 nm處的光密度值。

1.8.2 Real-time PCR測定 通過real-time實時定量PCR的方法檢測堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、BMP-2、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)經(jīng)BMP-2(1.25 mg/L)處理后的mRNA水平表達的變化，具體如下：取P3代MC3T3-E1細胞，以密度1×106個/mL接種在T25培養(yǎng)瓶中，用α-MEM培養(yǎng)。接種第2天換成誘導(dǎo)培養(yǎng)基(在上述α-MEM基礎(chǔ)上加入10-7mol/L地塞米松、50 mg/L維生素C、10 mmol/L α-磷酸甘油)。細胞共分為2組，CON組(不含生長因子)和BMP-2組(1.25 mg/L)。隔天換培養(yǎng)基，MC3T3-E1細胞體外誘導(dǎo)基培養(yǎng)第3、7天收集細胞，提取總RNA(#55-11120，SinoGene Scientific)。分光光度計測定RNA濃度(Biophotometer，Eppendorf)，取1 μg總RNA行脫氧核糖核酸酶Ⅰ處理以去除殘留基因組DNA(EN0521，F(xiàn)ermentas)，然后反轉(zhuǎn)錄(Thermo First cDNA Synthesis Kit，#33-20102，Sinogene Scientific)。ALP、BMP-2、OCN、OPN序列參照GenBank數(shù)據(jù)庫(表1)，qPCR反應(yīng)體系按照10 μL 2×SG PCR MasterMix(#33-10201，SinoGene Scientific)，引物 0.4 μL(5 μmol/L)，1 μL cDNA和8.2 μL ddH2O進行配置，在定量PCR儀上進行反應(yīng)(Applied Biosystems ABI Step One PLUS)。反應(yīng)程序為預(yù)變性：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，61 ℃ 31 s，40個循環(huán)。按照儀器默認熔解程序(95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s)驗證反應(yīng)的特異性。內(nèi)參基因同時檢測，用2-ΔΔCt方法進行數(shù)據(jù)分析。

表1 引物信息

ALP, alkaline phosphatase;BMP-2, bone morphogenetic protein 2;OCN, osteocalcin;OPN,osteopontin.

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graph Pad Prism 4軟件進行統(tǒng)計分析，所有實驗均進行了3次獨立操作。采用ANOVA檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，兩兩比較采用雙尾t檢驗，3組或3組以上比較采用Turkey-Kramer 檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FT-IR分析

a,CS material; b, CS microspheres; c, BMP-2; d, CS/BMP-2 microspheres.

圖2 緩釋材料的紅外圖譜

Figure2 Fourier transform infrared of materials

2.2 材料形貌觀察

CS/BMP-2微球的形狀及表面形態(tài)如圖3所示，圖3A和B分別表示在不同放大倍數(shù)下觀察的CS/BMP-2微球。利用乳化交聯(lián)法制備的微球呈現(xiàn)出很好的球形，整個球體表面光滑，應(yīng)用掃描電鏡測量所制備微球的平均直徑為5.982 μm。

從圖4A中可以看出，采用掃描電鏡觀察所制備的CBB多孔支架材料的內(nèi)部具有明顯的多孔結(jié)構(gòu)，孔徑約為300 pm至500 μm，且具有一定的定向性。大孔之間通過小孔連接，具有較好的連通性。當(dāng)負載微球后，由于膠原包裹到微球并使其粘附在CBB多孔支架上，使得CBB的孔徑得以填充，從圖4B中可以看出復(fù)合緩釋體的孔隙率明顯減小，孔徑為50～70 μm，說明CBB支架成功負載了CS微球。

2.3 包載率和包封率測定

CS/BMP-2微球的包載率和包封率如表2所示，隨著BMP-2含量的增加，CS/BMP-2的包載率增加，但是包封率卻在下降，這說明BMP-2能被成功包載于微球中。

2.4 CS/BMP-2微球的體外緩釋實驗

合成的CS/BMP-2微球中，BMP-2的含量約為(1.80±0.17) mg/g。采用動態(tài)浸泡的方法檢測第1、3、5、7、10、14和21天緩釋液中BMP-2的含量，BMP-2的釋放速度隨著時間的延長逐漸下降，第1天測得的緩釋液中BMP-2的含量達15%，呈現(xiàn)突釋效應(yīng)，第21天測得的緩釋液中BMP-2的濃度為(239.1±20.0) mg/L。緩釋21天累積釋放的BMP-2含量約占54%，釋放的BMP-2總量中，最初7 d釋放的約占37%(圖5)。

圖3 微球的掃描電鏡圖片(A，×16 000；B，×40 000)

Figure 3 Scanning electron microscope of microspheres (A, ×16 000;B, ×40 000)

2.5 細胞增殖檢測結(jié)果

為了評價該緩釋系統(tǒng)的體外生物相容性，本實驗采用CCK-8法測量不同成骨細胞的增殖活性(圖6)?？傮w來說，隨著共培養(yǎng)的時間由1 d增加到14 d，實驗組和對照組中的成骨細胞總量都有所增加，可見3組中成骨細胞均處于增殖狀態(tài)，細胞-支架復(fù)合物培養(yǎng)14 d后，大量的細胞粘附于材料孔隙中增殖生長，細胞生長密集。隨著BMP-2濃度的增加，MC3T3-E1細胞增殖速度加快，細胞分界不清，細胞相互融合成片狀，細胞與材料結(jié)合較緊密，有大量膠原分泌，說明該緩釋體系有利于小鼠前成骨細胞MC3T3-E1的增殖。同樣，圖7數(shù)據(jù)也可以看出以上規(guī)律，在第14天，1.25 mg/L BMP-2組細胞數(shù)量明顯多于對照組和1 mg/L BMP-2組，但對照組和1 mg/L BMP-2組的數(shù)據(jù)卻沒有很明顯的優(yōu)劣趨勢。

A, unload microspheres; B, load microspheres.

圖4 小牛松質(zhì)骨支架的掃描電鏡圖片(×400)

Figure4 Scanning electron microscopeof ceramic bovine bone(×400)

圖5 CS/BMP-2微球中BMP-2體外累積釋放曲線 圖6 緩釋體系對MC3T3-E1細胞增殖影響 圖7 緩釋體系在第1、3、7和14天的細胞增殖數(shù)量

Figure5 Cumulative release profiles of BMP-2 from CS/BMP-2 Figure 6 The MC3T3-E1 cell proliferation of materials

Figure7 Adherent cell numbers on different mediums after culturing for 1st, 3rd, 7th and 14th day

表2 BMP-2劑量對CS/BMP-2微球的包載率和包封率的影響

2.6 Real-time PCR結(jié)果

Real-time PCR結(jié)果顯示，4種基因在BMP-2處理組出現(xiàn)上調(diào)趨勢,如圖8所示，經(jīng)1.25 mg/L BMP-2處理3 d的MC3T3-E1細胞的ALP表達明顯高于對照組，MC3T3-E1細胞在第7天OCN表達明顯高于對照組，此外，基因OPN和BMP-2的表達在第3、7天與對照組相比均顯著增加。試驗結(jié)果表明，共培養(yǎng)3 d后，MC3T3-E1細胞發(fā)生了明顯的形態(tài)變化，由梭形轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切危憩F(xiàn)出明顯的成骨分化趨勢。ALP活性檢測顯示，BMP-2誘導(dǎo)組ALP較非誘導(dǎo)組明顯增加，OCN、OPN檢測也提示BMP-2誘導(dǎo)組較對照組有明顯增加，進一步說明BMP-2在體外促進了MC3T3-E1細胞向成骨方向分化。

3 討論

羥基磷灰石-磷酸三鈣(hydroxyapatite-tricalcium phosphate，HA-TCP)雙相陶瓷是骨組織工程中廣泛應(yīng)用的鈣磷生物支架材料[10-13]，本研究采用經(jīng)高溫脫蛋白后的煅燒骨，其主要成分是精細的HA-TCP晶體，與化學(xué)合成的HA-TCP類骨材料相比，有效地保留了松質(zhì)骨的天然大孔和微孔結(jié)構(gòu)，孔隙率和內(nèi)表面積分別是HA類骨材料的1.8倍和133倍，具有良好的生物相容性和最接近天然骨的理化性能。CS是一種天然高分子，具有穩(wěn)定的可降解性、良好的成膜性，并且具有抗菌、止血和促進傷口愈合的功能[14-16]。生物因子借助CS包覆層的梯度設(shè)計可以實現(xiàn)一定的釋放速率[17]，因此，本研究采用CS/BMP-2/CBB系統(tǒng)緩釋生物因子，研究BMP-2對小鼠前成骨細胞的影響。

Con, control group. Other abbreviations as in Table 1. *P<0.05, #P<0.01, ▲P<0.001, vs. Con.

圖8 Real-time PCR檢測MC3T3-E1細胞ALP、OCN、OPN和BMP-2基因相對表達(2)

Figure8 Real-time PCR of MC3T3-E1 on ALP, OCN, OPN and BMP-2 (2)

BMP-2是一種可溶的、低分子跨膜糖蛋白，研究表明BMP-2可以誘導(dǎo)骨髓干細胞分化為成骨細胞，上調(diào)ALP活性，上調(diào)OCN和Ⅰ型膠原的表達，增加礦化基質(zhì)，在局部對膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨均有誘導(dǎo)作用。

本研究以煅燒骨作為支架材料，使其在成骨過程中起骨引導(dǎo)作用。煅燒骨首先形成一個物理支架，再吸附周圍的種子細胞，引導(dǎo)細胞順此支架爬行、增殖并形成新骨，而骨生長因子在骨修復(fù)過程中能誘導(dǎo)間充質(zhì)細胞分化為成骨細胞，刺激成骨細胞加速增殖。骨改建包括成骨細胞參與的骨形成和破骨細胞介入的骨吸收過程，二者共同構(gòu)成了一個精細的動態(tài)平衡過程。本研究采用乳化交聯(lián)法制備載藥微球，掃描電子顯微鏡結(jié)果表明CS和香草醛之間發(fā)生了很好的交聯(lián)作用，所以微球的球形良好，與紅外光譜分析結(jié)果一致。

此外，本研究結(jié)果顯示，各組基因在BMP-2處理后第3和7天均表現(xiàn)出明顯上調(diào)趨勢，ALP、OCN和OPN的基因表達水平在BMP-2組也出現(xiàn)明顯的上調(diào)趨勢，細胞增殖分析同樣證實了以上結(jié)果，說明BMP-2促進了多種成骨基因水平的表達。外源性BMP-2作為新型骨替代材料緩釋的生物因子，在前成骨細胞向成骨分化過程中促進了細胞的分化，說明經(jīng)高溫脫蛋白后的煅燒骨材料可作為骨髓基質(zhì)干細胞的良好載體，復(fù)合生長因子BMP-2后，植入體內(nèi)的緩釋體系能夠誘導(dǎo)新生骨組織形成，可作為骨缺損組織工程修復(fù)的支架材料。

總之，本研究制備的CS/BMP-2/CBB復(fù)合緩釋體系，成功負載了生物活性因子BMP-2，且具有很好的緩釋效果，體外測試表明該緩釋體系有利于小鼠前成骨細胞MC3T3-E1的增殖和分化。

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(2015-06-29 收稿)

(本文編輯：趙 波)

Synthesis and in vitro characterization of chitosan microspheres/ceramic bovine bone composite scaffold

LI Qing1, YU Xin2, ZHOU Gang2, WU Yu-wei3, HU Hong-cheng3, WANG Tong3, TANG Zhi-hui1△

(1. Center of Digital Dentistry,Peking University School and Hospital of Stomatology & National Engineering Laboratory for Digital and Material Technology of Stomatology & Beijing Key Laboratory of Digital Stomatology, Beijing 100081, China; 2. School of Biological Science and Medical Engineering,Beihang University, Beijing 100191, China; 3. The Second Dental Center, Peking University School and Hospital of Stomatology, Beijing 100101, China)

Objective：The chitosan microspheres encapsulated with bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) were prepared by the emulsion cross-linking method. Then the chitosan microspheres were loaded in the ceramic bovine bone (CBB) to achieve the drug delivery system. Methods: The chemical structure and surface morphology of the drug delivery system were investigated by Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) and scanning electron microscope (SEM) observation. Characterization preserved the loading capacity and encapsulation efficiency of the BMP-2. The dynamic immersion method was used to examine theinvitrorelease characteristic of BMP-2. Results: The chitosan microspheres were successfully encapsulated BMP-2 by cross-linking method. The microspheres were micron-sized (5.982 μm) and spherical in shape with smooth surface morphology. From the release experiments, it was found that 5 mg chitosan/BMP-2 soaked for 21 days with a gradual release of BMP-2. The concentration of BMP-2 was (239.1±20.0) mg/L on Day 21. Theinvitroexperiment showed that this novel drug delivery system could accelerate MC3T3-E1 cells proliferation and osteogenic differentiation. Conclusion: The drug delivery system achieves the biological function of BMP-2 and sustaining slow release in bone repair parts. Also it can provide the basis for repair of bone tissue defect treatment and the selection of bone tissue engineering scaffolds.

Chitosan; Microspheres; Drug delivery system; Ceramic bovine bone

首都市民健康項目(z2110005312001)資助Supported by the Capital Public Health Project(z2110005312001)

時間：2016-11-2 9:01:40

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20161102.0901.004.html

R737.25

A

1671-167X(2016)06-1043-06

10.3969/j.issn.1671-167X.2016.06.021

△Corresponding author’s e-mail, tang_zhihui@live.cn