陳 超，樊海麗，蔡志威，張傳杰

(1.浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 310052； 2.復(fù)納科學(xué)儀器(上海)有限公司，上海 201100； 3.蘭波(蘇州)智能科技有限公司，江蘇 蘇州 215100)

微球是可降解高分子材料與藥物均勻混合后制備的粒徑范圍在幾微米到幾百微米的球狀聚合物，通過高分子材料的降解作用，同步釋放藥效[1-4].因微球制劑具有藥效作用期長、給藥次數(shù)少、不良反應(yīng)低等特點，已成為緩控釋制劑的主要劑型之一.

緩釋微球的發(fā)展方向有釋放穩(wěn)定性及超長效釋放.釋放穩(wěn)定性是通過有效的藥物釋放控制，避免血藥濃度出現(xiàn)“峰谷現(xiàn)象”，以維持患者的血藥濃度保持在一個穩(wěn)定的狀態(tài).另外，已上市超長效釋放微球可以實現(xiàn)一次注射即可獲得幾個月的穩(wěn)定釋放，相比于普通制劑，大幅減少了給藥次數(shù)，進(jìn)一步提高患者依從性[5-8].

掃描電子顯微鏡(SEM)是一種強(qiáng)大的成像工具，具有高分辨、高放大倍數(shù)、大景深的特點，成像性能遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于光學(xué)顯微鏡.SEM利用聚焦后的高能電子束在樣品上作光柵狀掃描，電子束與樣品相互作用產(chǎn)生二次電子、背散射電子、特征X射線等信號，通過不同的檢測器對這些信號進(jìn)行收集、放大、再成像，從而對樣品表面微觀形貌進(jìn)行表征.

近年來，掃描電子顯微鏡與能譜分析技術(shù)越來受到大家重視，臺式掃描電子顯微鏡能譜一體機(jī)的出現(xiàn)，增加了操作便利性，使得掃描電子顯微鏡在醫(yī)藥行業(yè)得到越來越廣泛的使用[9-19].不局限于固體藥物，通過冷凍樣品臺，甚至可以對半固態(tài)和液態(tài)樣品進(jìn)行表征[20-23].

1 SEM在微球制劑表征中的應(yīng)用

微球的釋放行為與其微觀結(jié)構(gòu)特征，如粒度分布、表面致密度、包封率、孔隙率等參數(shù)直接相關(guān).微球結(jié)構(gòu)受到生產(chǎn)過程中各類工藝參數(shù)的影響，如乳化參數(shù)、乳化劑濃度、溫度、固化時間等[24-25].而在產(chǎn)業(yè)化線性放大生產(chǎn)時，微球結(jié)構(gòu)的一致性控制難度較大.

微觀結(jié)構(gòu)是連接微球釋放行為與工藝參數(shù)的橋梁.工藝控制的效果可以通過微球結(jié)構(gòu)而獲得，而微球的釋放行為可以通過其微觀結(jié)構(gòu)而預(yù)測.同時放大生產(chǎn)時微球粒度一致性評價也可以通過尺寸測量而獲得.

微球結(jié)構(gòu)表征的常見方法為光學(xué)顯微法，但光學(xué)顯微鏡分辨率較低，無法看清微米級的孔結(jié)構(gòu)，而SEM可提供更為清晰的圖像信息.

因此，本文從三個角度，對SEM在微球開發(fā)與放大生產(chǎn)的相關(guān)文獻(xiàn)中的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)，并通過SEM以及圖像分析軟件上機(jī)試驗進(jìn)行方法驗證.試驗中使用的儀器及軟件：臺式掃描電子顯微鏡Phenom XL (荷蘭，Phenom-World B.V.),顆粒分析軟件Phenom ParticleMetric(荷蘭，Phenom-World B.V.).

1.1 微球粒度分析

微球粒度是藥物釋放動力學(xué)的主要決定因素[26-31].微球粒徑大小及粒度分布對緩釋微球的包封率、釋放行為模式、降解速率都有很大影響，因此微球粒度分析是微球研發(fā)與生產(chǎn)工藝控制中的一個重要指標(biāo).同等條件下，微球粒度越小，則比表面相對較大，也就是說微球與體液接觸比表面更大，藥物釋放則越快.而對于放大過程，微球批間粒度分布的一致性是生產(chǎn)質(zhì)量控制的重中之重.

Klose等[31]以利多卡因作為模型藥物，制備一系列的PLGA載藥微球，并采用SEM對微球粒度進(jìn)行表征，如圖1所示.SEM圖像結(jié)合釋放行為研究表明，隨著微球粒徑的增大，微球的體外釋放行為變慢.

圖1 不同粒度微球的SEM圖像[31]

Berkland等[29]通過SEM對微球粒度進(jìn)行表征，不同粒度微球SEM圖像如圖2所示.結(jié)果表明，隨著微球直徑在10～100 μm范圍內(nèi)的增大，模型小分子藥物的釋放曲線逐漸變?yōu)檩^緩慢的S形曲線.同時作者提出，粒度分布均勻的微球，其總體釋放行為與微球個體的藥物釋放的加權(quán)平均值是相對應(yīng)的.但也可通過設(shè)計不同粒度的微球制備具有特殊粒度分布的混合物，以設(shè)計出所需的特定釋放曲線，如超長效恒定釋放等.因此，對微球混合物進(jìn)行粒度分布設(shè)計，可以提供一種有效控制藥物釋放速率的方法.

圖2 不同粒度微球的SEM圖像(標(biāo)尺尺寸 100 μm)[29]

在歐洲藥典十部(2.9.52.Scanning electron microscopy)章節(jié)中提出：“可通過圖像分析進(jìn)行粒度分布統(tǒng)計”.而近年來，基于SEM的全自動顆粒粒形、粒徑分析系統(tǒng)有了廣泛的應(yīng)用，可以對SEM圖像中的顆粒進(jìn)行自動識別，并可對粒徑進(jìn)行自動化統(tǒng)計，給出粒度柱狀分布圖、平均值、D10/D50/D90等統(tǒng)計結(jié)果.相比于光學(xué)顯微鏡，基于SEM的自動化分析軟件具有更高分辨率，結(jié)果更準(zhǔn)確，定量化的結(jié)果更具科學(xué)意義[32-33].

本文使用上述自動化顆粒識別與統(tǒng)計系統(tǒng)，對一組微球顆粒進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示.軟件分析了圖像中包含的459顆顆粒，結(jié)果表明微球粒度分布范圍為21～80 μm，呈正態(tài)分布，其粒徑D50為55.8 μm.

圖3 SEM圖像分析結(jié)果：微球粒度分布分析

1.2 微球表面結(jié)構(gòu)表征

微球表面結(jié)構(gòu)對藥物釋放有著重要影響，微球表面微孔越多，孔徑越大，釋放也就越快.SEM可以通過觀察微球表面微孔的變化，研究微球制備工藝，也可以通過圖像間接預(yù)測藥物的釋放行為[34-39].

KIM等[39]采用乳化揮發(fā)法制備人生長激素微球，制得表面多孔微球.然后利用流化床設(shè)備制得無孔微球，SEM結(jié)果如圖4所示.結(jié)果表明，不同方法制備的微球具有明顯不同的表面孔隙形貌.而釋放研究表明，無孔微球釋藥速度明顯減慢，24 h累積釋放量僅(6.2±1.1)%，可以獲得1個月的長效釋放.而多孔微球24 h累積釋放量達(dá)到(85.6±1.0)%，前期突釋明顯.

圖4 微球孔結(jié)構(gòu)SEM表征[39]

為了降低前期突釋，可以通過包覆的形式，獲得具有核殼結(jié)構(gòu)的雙層微球.其內(nèi)核為可生物降解聚合物材料與藥物混合而成的多孔微球，然后通過另一種可降解的聚合物材料為外殼進(jìn)行包覆[40-41].與多孔微球不同，雙層微球的釋放主要取決于核殼結(jié)構(gòu).因外殼的封閉效果較好，核殼微球的載藥量和包封率都很高，但采取這種工藝時需要注意其工藝重現(xiàn)性與一致性.SEM可對核殼結(jié)構(gòu)的包覆情況進(jìn)行有效表征.圖5為SEM表征的包覆前后的微觀結(jié)構(gòu)對比，圖5(a)為多孔微球，包覆后的核殼微球如圖5(b)所示，SEM結(jié)果表明，包覆工藝有效封堵了微球表面的微孔結(jié)構(gòu).

圖5 多孔微球(a)及包覆后的核殼微球(b)

1.3 微球內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及致密性評價

對于微球的中后期釋放，其釋放機(jī)理為溶液通過微球表面孔隙進(jìn)入內(nèi)部，沿著內(nèi)部孔道逐漸溶解聚合物，隨著微球骨架的溶蝕，藥物逐漸釋放.因此，微球內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征直接影響藥物的中后期釋放，微球內(nèi)部孔尺寸越小，越致密，則微球中后期釋放速度越緩慢.反之，微球內(nèi)部孔尺寸越大，越疏松，則微球中后期釋放越快[42-43].通過制樣，獲得微球內(nèi)部的斷面，然后通過SEM進(jìn)行表征，就可以得到微球內(nèi)部的結(jié)構(gòu)形貌，如圖6所示.不同工藝條件下，獲得的微球具有明顯不同的內(nèi)部結(jié)構(gòu).相對于圖6(a)，圖6(b)中的微球具有更小的內(nèi)部孔徑，結(jié)構(gòu)更為致密.結(jié)果表明，SEM對這種工藝的研發(fā)以及產(chǎn)線質(zhì)量控制具有重要意義.

圖6 不同工藝條件下的微球斷面表征

2 總結(jié)

由于高分辨率、高景深、高放大倍數(shù)的特點，SEM在微球制劑研發(fā)及放大生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制方面有著廣泛的應(yīng)用潛力.通過文獻(xiàn)綜述以及上機(jī)試驗的結(jié)果，充分驗證了SEM對微球制劑表征中的重要作用.SEM可實現(xiàn)微球粒度分析.高分辨的成像使得微球表面以及內(nèi)部的微孔結(jié)構(gòu)清晰可見，還可用來評估核殼結(jié)構(gòu)的包覆效果.在進(jìn)行粒徑分析時，可借助圖像分析工具，將顆粒分析數(shù)量擴(kuò)展到百顆甚至千顆量級，其結(jié)果更有科學(xué)統(tǒng)計意義.