竇晶莉 ，白 力，龐春艷，張文蘭，張 偉，王永福△

(1. 包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科, 內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭 014010； 2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)自體免疫學(xué)重點實驗室，內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭 014010)

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·論著·

脂肪間充質(zhì)干細胞對博來霉素誘導(dǎo)的硬皮病小鼠模型的治療作用

竇晶莉1,2，白 力2，龐春艷2，張文蘭2，張 偉2，王永福1,2△

(1. 包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科, 內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭 014010； 2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)自體免疫學(xué)重點實驗室，內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭 014010)

目的：研究脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose tissue-derived stem cells，ADSCs)對博來霉素(bleomycin,BLM)誘導(dǎo)的硬皮病小鼠的治療效果及其可能的作用機制。方法： 選取 C57BL/6J 雌性小鼠 24 只，采用皮下注射 BLM [2 mg/(kg·d)]建立硬皮病小鼠模型，隨機分為正常對照組、BLM 組、ADSCs(皮下)組 和 ADSCs(靜脈)組，每組6只，正常對照組給予生理鹽水2 mL/(kg·d)皮下注射，其余3組分別給予BLM皮下注射，連續(xù)3周，然后，ADSCs皮下和尾靜脈注射組分別給予皮下和尾靜脈注射 ADSCs(2×105個細胞)治療，每4天1次，共3次。流式細胞術(shù)檢測小鼠脾細胞中的輔助T細胞17(T-helper 17,TH17)及 調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell ，Treg)，實時熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)( polymerase chain reaction,PCR)法檢測小鼠肺組織中相關(guān)細胞因子的表達水平，酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA) 檢測小鼠血清中白介素(interleukin,IL)-6、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β) 的含量， 蘇木精-伊紅染色(hematoxylin eosin staining，HE )觀察小鼠的皮膚和肺組織病理學(xué)改變。結(jié)果： 流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，BLM 組較正常對照組小鼠脾細胞中 TH17 和 Treg所占比例升高(15.30%±1.29 %vs. 4.32%±0.79%；9.90%±1.95%vs. 5.18%±1.35%，P均<0.05)，經(jīng) ADSCs 治療后，TH17 所占比例降低(5.02%±0.83%,6.00%±0.82%vs.15.30%±1.29%，P均<0.05)，而 Treg所占比例升高(14.32%±1.59%,11.09%±4.31%vs. 9.90%±1.95%，P均<0.05)。與正常對照組相比，BLM 組小鼠肺組織中 IL-17、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的 mRNA 表達水平及血清中 IL-6 的含量均升高[3.54±0.30,10.65±0.66, 5.37±0.52vs. 1.00±0.00; (21.2±1.74) ng/Lvs. (16.87±1.09) ng/L，P均<0.05]，ADSCs 治療后，其表達量下降[1.63±0.45,1.50±0.29vs.3.54±0.30;3.11±0.85,2.98±0.76vs.10.65±0.66;1.45±0.47,1.59±0.41vs. 5.37±0.52; (17.87±1.45) ng/L, (17.61±1.16) ng/Lvs. (21.2±1.74) ng/L，P均<0.05]，ADSCs(皮下)組和ADSCs(靜脈)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。BLM 組小鼠血清中 TGF-β 的含量較正常對照組升高[(33.95±2.49) ng/Lvs. (28.8±2.29) ng/L，P<0.05]，但小鼠肺組織中 TGF-β mRNA 的表達水平與正常對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義( 1.17±0.11vs.1.00±0.00，P>0.05)，經(jīng) ADSCs 治療后 TGF-β基因和蛋白的表達無明顯變化[1.25±0.11,1.26±0.12vs.1.17±0.11; (31.84±2.04) ng/L, (31.25±2.36) ng/Lvs. (33.95±2.49) ng/L，P>0.05]。HE 染色結(jié)果顯示，BLM組與正常對照組相比，肺組織有大量炎性細胞浸潤，肺泡間隔斷裂或消失；皮膚真皮層增厚,有大量的膠原纖維積聚，經(jīng)ADSCs治療后小鼠肺組織炎癥有所改善，皮膚的真皮層變薄，膠原纖維積聚減少。結(jié)論： ADSCs 可以有效緩解硬皮病小鼠肺的炎癥和皮膚的纖維化癥狀，其抗炎和抗纖維化作用與其免疫調(diào)節(jié)功能有關(guān)。

干細胞, 間充質(zhì)；硬皮??；免疫調(diào)節(jié)；細胞因子類

硬皮病是一種以皮膚增厚和局限或彌漫性纖維化為特點的自身免疫性疾病，可累及肺、腎、 肝、心臟等器官，發(fā)病機制未明。目前研究發(fā)現(xiàn)，疾病主要涉及小血管病變、細胞外基質(zhì)過量積聚所致的纖維化和免疫異常等三方面。炎性細胞浸潤為硬皮病早期階段的主要特征，以T淋巴細胞浸潤為主，研究顯示，T淋巴細胞可以釋放多種細胞因子，引起炎癥及血管病變，激活成纖維細胞及促進膠原纖維的合成[1]。目前，對于硬皮病主要以免疫抑制劑和對癥治療為主，但治療效果并不理想，而且不良反應(yīng)較多，需要尋找更為有效的治療方法。

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell,MSCs)是來源于中胚層具有自我更新能力和多項分化潛能的成體干細胞，除了被應(yīng)用于組織修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域外，由于其低免疫原性和強有力的免疫調(diào)節(jié)性，在自身免疫性疾病的治療方面也備受青睞。研究顯示，靜脈注射 MSCs 可以降低關(guān)節(jié)炎小鼠的發(fā)病率及緩解其關(guān)節(jié)炎癥狀[2]；此外，MSCs 還可以減少狼瘡小鼠血清中抗雙鏈 DNA 抗體和蛋白尿的生成[3]，這為 MSCs 治療硬皮病提供了可能。在MSCs眾多來源中，脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose tissue-derived stem cells，ADSCs)由于其易于獲得、提取和擴增，被廣泛應(yīng)用于自身免疫疾病的研究和治療中，因此本實驗采用 ADSCs 治療博來霉素(bleomycin,BLM) 誘導(dǎo)的硬皮病小鼠，觀察其治療效果，探討 ADSCs 可能的免疫調(diào)節(jié)機制。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物：SPF 級6～8 周齡雌性 C57BL/6J 小鼠，購于上海軒研生物科技有限公司。

試劑及儀器：達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco’s modified eagle medium nutrient medium F-12，DMEM/F12 )購自美國Gibco公司，澳洲源優(yōu)級胎牛血清(fetal bovine serum,FBS )購自美國Gibco公司，磷酸緩沖液(phosphate buffer saline,PBS )購自美國Gibco公司， 反轉(zhuǎn)錄試劑盒 RR037A、裂解液(Trizol )試劑、熒光定量試劑盒 DR041A購自日本Takara公司，白介素(interleukin,IL)-6 和 轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)、酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA) 試劑盒購自中國新啟迪公司，六孔板購自丹麥Nunc公司，細胞培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司，熒光定量PCR 儀購自中國BIOER公司，倒置相差顯微鏡購自日本OLYMPUS公司，流式細胞儀購自美國BD公司，離心機購自美國Thermo Fisher SCIENTIFIC公司。

1.2 方法

1.2.1 C57BL/6J 小鼠ADSCs的分離純化

取 6～8 周齡雌性 C57BL/6J 小鼠 10只，脫頸處死，75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇消毒 5 min，取腹股溝部 1 g 脂肪組織，PBS緩沖液沖洗 3 次，剪成 1 mm3小塊，置于 0.4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Ⅰ型膠原酶中，在 37 ℃恒溫?fù)u床中，200 r/min、消化 40 min；用 100 mm 細胞篩過濾，1 600 r/min 離心 5min，棄上清；分離的間充質(zhì)干細胞在5 mL DMEM/F12+ 10% FBS+雙抗的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，將細胞置37 ℃、 5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2培養(yǎng)箱中孵育，24 h后換液，待細胞匯合度達 90%時傳代，傳至第3代后進行儲存，對第3代ADSCs進行表面標(biāo)志物和多項分化能力的鑒定。

1.2.2 硬皮病小鼠模型建立及 ADSCs治療

本實驗選用 6～8 周齡 C57BL/6J 雌性小鼠24只， 將小鼠隨機分為正常對照組、BLM 組、ADSCs(皮下)、ADSCs(靜脈)，每組6只。正常對照組給予生理鹽水 2 mL /(kg·d)皮下注射，其余3組給予博來霉素 2 mg/(kg·d)皮下注射，連續(xù)3周。3周造模成功后，分別采用皮下注射和尾靜脈注射ADSCs(2×105個細胞)治療，每4天1次，共3次。

1.2.3 標(biāo)本的采集

小鼠治療后1周內(nèi)將各組小鼠脫頸處死，心臟取血并分離血清，血清保存于-20 ℃冰箱以備后用。取各組小鼠背部注射部位皮膚及肺組織，儲存于-80 ℃冰箱，進行組織的冰凍切片HE染色。

1.2.4 小鼠脾淋巴細胞的提取及流式細胞術(shù)檢測脾細胞中 TH17 和 Treg的 比率

將剛?cè)〕龅男∈笃⒃?100 nm 的細胞篩上用注射器內(nèi)芯研磨，PBS緩沖液進行沖洗，收集細胞懸液，1 600 r/min 離心 5 min 棄上清，3 mL DMEM/F12+10% (體積分?jǐn)?shù))FBS 重懸細胞，加入 3 μL豆蔻酰佛波醇乙酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)和 3 μL離子霉素(ionomycin) 刺激脾淋巴細胞，37 ℃、 5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 16 h，上機進行流式檢測。

1.2.5 小鼠肺組織總RNA的提取及cDNA的反轉(zhuǎn)錄

用 Trizol 法提取小鼠肺組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實時熒光定量PCR法檢測相關(guān)細胞因子mRNA的相對表達量，引物由上海生工生物有限公司合成。IL-6上游引物：5′-TGATGGATGCTACCAAACTGG-3′，下游引物：5′-TGGTCTTGGTCCTTAGCCACT-3′；TNF-α 上游引物： 5′-TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC-3′ ，下游引物：5′-CATCTTCTCAAAATTCGAGTG ACAA-3′；IL-17 上游引物：5′-GGAAAGCTGGACCACCACA-3′，下游引物： 5′-CACACCCACCAG CATCTTCTC-3′ ；TGF-β上游引物: 5′-CAACACATCAGAGCTCCGAGAA-3′，下游引物: 5′-AAGGC GAAAGCCCTCAATTT-3′；內(nèi)參對照β-actin 上游引物： 5′-ACCGTGAAAAGATGACCCAG-3′，下游引物:5′-AGCCTGGATGGCTACGTACA-3′。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為 65 ℃ 5 min, 42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min。 PCR 的反應(yīng)條件: 95 ℃ 30 s,60 ℃ 1min, 72 ℃ 30 s, 40 個循環(huán)，以小鼠β-actin 作為內(nèi)參對照，根據(jù)Ct值用2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。

1.2.6 ELISA檢測小鼠血清中 IL-6 和 TGF-β的含量

取小鼠血清進行以下操作：(1)取已平衡至室溫的板條，預(yù)留空白孔；(2)分別將標(biāo)本或不同濃度小鼠標(biāo)準(zhǔn)品加入相應(yīng)孔中，給酶標(biāo)板覆膜，37 ℃孵育90 min；(3)洗板后加入生物素小鼠抗體工作液，封板，37 ℃孵育 60 min；(4)洗板后除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液，封板，37 ℃ 避光孵育30 min；(5)洗板后加入TMB 顯色工作液，37 ℃避光孵育10 min；(6)加入終止液，混勻后即刻測量450 nm處的光密度值(optical density，D)。

1.2.7 組織病理形態(tài)分析

從-80 ℃冰箱中取出小鼠皮膚和肺組織，進行冰凍切片，切片厚5 mm，HE 染色觀察肺組織炎性細胞浸潤程度和肺泡結(jié)構(gòu)的完整性，以及皮膚真皮層厚度、炎性細胞浸潤及纖維化情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ADSCs 形態(tài)觀察

ADSCs 在接種后 12 h 左右便有部分貼壁生長，48～72 h 匯合度達 80%，第3代細胞生長速度較快，細胞形態(tài)相對均一，以梭形為主，集落呈漩渦狀(圖 1)。

A, primary generation of ADSCs; B, first generation of ADSCs; C, second generation of ADSCs; D, third generation of ADSCs.

圖1 脂肪間充質(zhì)干細胞形態(tài)觀察(×20)

Figure1 Morphological observation of ADSCs(×20)

2.2 ADSCs 對小鼠脾細胞中 TH17 及 Treg 所占比例的影響

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示：相比于正常對照組，BLM組 TH17及 Treg所占比例升高(P<0.05)，經(jīng)ADSCs治療后，TH17 細胞所占比例降低(P<0.05)，而 Treg 所占比例升高(P<0.05)，ADSCs(皮膚)組和 ADSCs(靜脈)組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖2)

A, TH17 control group； B, TH17 BLM group； C, TH17 ADSCs(hypodermic injection)group； D, TH17 ADSCs(intravenous injection)group； E, Treg control group； F, Treg BLM group； G, Treg ADSCs(hypodermic injection)group； H, Treg ADSCs(intravenous injection)group.

圖2 流式細胞術(shù)檢測 TH17 和Treg 細胞所占比例

Figure2 Proportion of TH17 and Treg cell was analysis by flow cytometry

2.3 ADSCs 對 BLM 誘導(dǎo)的硬皮病小鼠肺組織中細胞因子基因表達的影響

實時熒光定量PCR 結(jié)果顯示: BLM 組中 IL-17、IL-6、TNF-α的 mRNA 表達量較正常對照組升高(P<0.05)，而 TGF-β 的 mRNA 表達量較對照組無明顯變化(P>0.05)；ADSCs 治療后，IL-17、IL-6、TNF-α的 mRNA 表達量降低(P<0.05)，而 TGF-β 的表達量無明顯變化(P>0.05)，ADSCs(皮下)組和 ADSCs(靜脈)組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖 3)。

2.4 ADSCs 對 BLM 誘導(dǎo)的硬皮病小鼠血清中細胞因子的影響

ELISA 結(jié)果顯示：BLM組較對照組 TGF-β、IL-6 的含量升高(P<0.05)，經(jīng) ADSCs 治療后，IL-6 的含量降低(P<0.05)，TGF-β 的含量無明顯變化(P>0.05)，ADSCs(皮下)和 ADSCs(靜脈)組中 TGF-β、IL-6 的含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖 4)。

2.5 ADSCs 治療后小鼠皮膚組織病理學(xué)改變

HE染色結(jié)果顯示：對照組皮膚組織結(jié)構(gòu)正常，無炎性浸潤和纖維化(圖5A)；BLM 組皮膚真皮層增厚,有大量的膠原纖維積聚，皮膚附屬器減少，有少量的炎性細胞浸潤(圖5B)；經(jīng) ADSCs 治療后，皮膚真皮層明顯變薄，膠原纖維積聚減少,可見正常的皮膚附屬器(圖5C、D)。

2.6 ADSCs 治療后小鼠肺組織病理學(xué)改變

HE染色結(jié)果顯示：對照組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，有少量的炎性細胞浸潤(圖6A)；BLM 組有大量炎性細胞浸潤，肺泡間隔斷裂或消失(圖6B)；經(jīng)ADSCs 治療后，ADSCs(皮下)組和 ADSCs(靜脈)組的肺組織損傷情況有所改善，炎性細胞浸潤減少(圖6C、D)。

A, level of IL-17 in the lung tissue was detected by real-time PCR；B, level of TNF-α in the lung tissue was detected by real-time PCR；C, level of IL-6 in the lung tissue was detected by real-time PCR；D, level of TGF-β in the lung tissue was detected by real-time PCR.*P<0.05. ns, no statistical. H, hypodermic injection; I.V., intravenous injection.

圖3 細胞因子 mRNA 的表達量

Figure3 mRNA expression of cytokines

A， level of IL-6 in the serum was detected by ELISA ； B， level of TGF-β in the serum was detected by ELISA. *P<0.05. ns, no statistical. H, hypodermic injection; IV., intravenous injection.

圖4 血清中細胞因子的表示水平

Figure4 Cytokine expression in the serum

A,control group； B,BLM group； C, ADSCs(hypodermic injection)group；D, ADSCs(intravenous injection) group.

圖5 小鼠皮膚組織病理學(xué)變化 (×40)

Figure5 Pathological changes in the skin of mice (×40)

A,control group； B, BLM group；C,ADSCs (hypodermic injection) group；D, ADSCs (intravenous injection) group.

圖6 小鼠肺病理學(xué)變化 (×400)

Figure6 Pathological changes in the lung of mice (×400)

3 討論

MSCs由于其強有力的免疫抑制能力被應(yīng)用于自身免疫性疾病的治療。體內(nèi)外研究已經(jīng)證實， MSCs可以通過與淋巴細胞的直接接觸和分泌多種可溶性的細胞因子而發(fā)揮免疫抑制作用[4-5]；在移植物抗宿主病治療中，MSCs也顯示其免疫抑制能力[6]。ADSCs作為MSCs來源中的一種，同樣具有MSCs的生物學(xué)特性，本實驗旨在探討 ADSCs對BLM誘導(dǎo)的硬皮病小鼠的治療作用及其對T淋巴細胞亞群和多種細胞因子的免疫調(diào)節(jié)作用。

目前，MSCs免疫調(diào)節(jié)機制主要包括以下幾方面：一方面，MSCs可以抑制絲裂原誘導(dǎo)的 T 細胞的活化[7]；另一方面，MSCs可以通過抑制細胞周期蛋白 D2 的表達，使 T 細胞停留在 G0/G1 期，從而抑制 T細胞的增殖和分化[8]；更重要的是，MSCs可以通過旁分泌釋放多種可溶性的細胞因子和趨化因子，如TGF-β、吲哚胺 2，3 雙加氧酶、血紅素加氧酶-1、前列腺素 、趨化因子2等，這些細胞因子可以通過不同的途徑抑制 T 細胞的增殖、分化。此外，研究發(fā)現(xiàn)，MSCs還可以抑制 IL-17、IL-6、 IL-22、TNF-α等多種細胞因子的分泌[9]。

免疫系統(tǒng)紊亂是硬皮病主要特征之一，涉及多種免疫細胞的異常，其中 TH17和 Treg與 硬皮病之間具有密切相關(guān)性。大量數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，硬皮病患者血清及受累臟器(如皮膚)中 TH17 和其所分泌的 IL-17 的含量顯著升高，特別是在疾病的早期以及肺受累的情況下[10-11]；但對于調(diào)節(jié)性 T 細胞的含量增加與否還存在爭議，這主要是由于硬皮病特殊的發(fā)病機制所致，在疾病早期炎癥階段會出現(xiàn) Treg 細胞含量和功能的減低，隨著病程進展，大量免疫細胞被激活，會分泌多種細胞因子(IL-1、IL-13、IL-17、TGF-β 等)，TGF-β 作為 Treg 細胞增殖和分化的重要誘導(dǎo)物，常會引起 Treg 細胞含量的增加[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，BLM 誘導(dǎo)的硬皮病小鼠脾細胞中 TH17 和 Treg 細胞所占比例升高，血清中TGF-β的表達水平也明顯升高，但肺組織中 TGF-β 的表達水平無明顯變化；經(jīng) ADSC 治療后，TH17所占比例明顯降低，而 Treg 細胞所占比例升高，血清和肺組織中 TGF-β的表達水平無明顯變化。結(jié)果表明，ADSCs可以抑制 TH17 細胞的增殖和分化， 同時促進Treg細胞的增殖和分化，但 ADSC(皮下)組與 ADSC(靜脈)組之間無明顯差異，TGF-β含量治療后無明顯變化，可能是由于細胞治療時間較短導(dǎo)致。

在硬皮病發(fā)病和病程進展中有多種細胞因子參與，如IL-17、IL-6 、TNF-α、TGF-β 等，其中 IL-17、 IL-6 作為多效性細胞因子，不僅可以促進 T 細胞的增殖和分化，還與硬皮病的纖維化有關(guān)，近期研究發(fā)現(xiàn)[13]，TH7細胞所分泌的 IL-17A 可以激活成纖維細胞，促進膠原纖維的生成[14]，被動免疫注射抗 IL-6 受體的單克隆抗體可以改善硬皮病小鼠的纖維化癥狀[15]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng) BLM 誘導(dǎo)的硬皮病小鼠肺組織中 IL-17、 IL-6 、TNF-α及血清中 IL-6 的含量升高，經(jīng) ADSCs治療后，明顯降低，但 ADSCs(皮下)組與 ADSCs(靜脈)組之間無明顯差異。結(jié)果表明，ADSCs 可以抑制細胞因子 IL-17、IL-6、TNF-α的分泌，但不能表明皮下注射和靜脈注射 ADSCs 之間有差異。

為了進一步闡明 ADSCs的治療效果，本實驗觀察了BLM及ADSCs處理后小鼠肺和皮膚組織病理學(xué)改變，肺組織 HE 染色結(jié)果顯示，BLM處理后，肺泡間隔斷裂或消失，大量炎性細胞浸潤。經(jīng)ADSCs治療后，肺組織炎性浸潤明顯減輕，可見部分正常的肺泡，結(jié)果表明，ADSCs可以減輕硬皮病小鼠肺的炎癥，具有抗炎作用。皮膚組織HE染色結(jié)果顯示，BLM處理后，皮膚真皮層增厚，有大量的膠原纖維積聚，皮膚附屬器減少，皮下脂肪組織減少。經(jīng)ADSCs治療后，真皮層變薄，積聚的膠原纖維含量減少，可見為數(shù)較多的附屬器及脂肪組織，結(jié)果表明，ADSCs可以緩解皮膚纖維化癥狀，可能是通過抑制 IL-6、IL-17 等促纖維化細胞因子的分泌，而發(fā)揮抗纖維化的作用。

本研究基于 ADSCs 的免疫調(diào)節(jié)能力，采用ADSCs治療 BLM 誘導(dǎo)的硬皮病小鼠，觀察ADSCs 對T淋巴細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答過程中相關(guān)免疫細胞和細胞因子的影響及其治療的效果。實驗表明，ADSCs 不僅可以抑制 TH17 的增殖、分化,以及減少炎性細胞因子 IL-17、IL-6 、TNF-α的分泌，同時，ADSCs還可以促進 Treg細胞的增殖和分化，從而有效抑制 T 細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，有效抑制肺組織的炎性細胞浸潤；此外，ADSCs可能通過抑制 IL-17、IL-6 等促纖維化細胞因子的分泌，達到抗纖維化的效果，從而改善硬皮病小鼠的皮膚纖維化，ADSCs 潛在的抗炎及抗纖維化功能為治療硬皮病提供了有力的理論依據(jù)。

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(2016-08-11 收稿)

(本文編輯：劉淑萍)

Therapeutic effect of adipose tissue-derived stem cells on bleomycin-induced mice of scleroderma

DOU Jing-li1,2，BAI Li2，PANG Chun-yan2，ZHANG Wen-lan2，ZHANG Wei2，WANG Yong-fu1,2△

(1. Department of Rheumatology, the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Baotou 014010, Inner Mongolia, China; 2. Key Laboratory of Autoimmunity of Inner Mongolia, Baotou 014010, Inner Mongolia, China)

Objective： To investigate the effects and mechanisms of adipose-derived stem cells (ADSCs) on bleomycin-induced mice of scleroderma. Methods: In the study, 24 C57BL/6J female mice were randomly divided into control group, bleomycin(BLM)group, ADSCs (hypodermic injection) group and ADSCs (intravenous injection) group . BLM [2 mg/(kg·d)] was injected into the mice to establish the model of scleroderma. There were 6 mice in each group .The control group mice were injected with normal saline 2 mL/(kg·d) by subcutaneously. The rest of the three groups were injected with BLM. ADSCs groups were injected with ADSCs (2×105) subcutaneously and intravenously, respectively. T-helper 17 (Th17 ) and regulatory T cell (Treg cell) of spleen cells were detected by flow cytometry. The levels of cytokines in the lung tissue and in the serum were detected by real-time fluorescence quantification. Real-time polymerase chain reaction(PCR) and enzyme-linked immuno sorbent assay(ELISA). The pathology change of skin and lung tissue was observed by hematoxylin eosin (HE)staining. Results: The proportion of Th17 and Treg increased in BLM group than in control group(15.30%±1.29%vs.4.32%±0.79%; 9.90%±1.95%vs.5.18%±1.35%,P<0.05), the expression of Th17 significantly decreased (5.02%±0.83%, 6.00%±0.82%vs.15.30%±1.29%,P<0.05) and the expression of Treg increased after the ADSCs therapy (14.32%±1.59%, 11.09%±4.31%vs. 9.90%±1.95%,P<0.05). The expression levels of IL-17，IL-6，tumor necrosis factor -α (TNF-α)mRNA in the lung tissue and IL-6 in the serum increased in BLM group than in control group [3.54±0.30, 10.65±0.66, 5.37±0.52vs. 1.00±0.00; (21.2±1.74) ng/Lvs. (16.87±1.09) ng/L,P<0.05]. The expression of these cytokines significant decreased after the ADSCs therapy [1.63±0.45,1.50±0.29vs.3.54±0.30; 3.11±0.85, 2.98±0.76vs.10.65±0.66;1.45±0.47, 1.59±0.41vs. 5.37±0.52; (17.87±1.45) ng/L, (17.61±1.16) ng/Lvs. (21.2±1.74) ng/L,P<0.05]. But there was no obvious difference between ADSCs (hypodermic injection) group and ADSCs (intravenous injection) group(P>0.05). The expression of TGF-β in the serum increased in BLM group than in control group[(33.95±2.49) ng/Lvs. (28.8± 2.29) ng/L,P<0.05], however, the expression of TGF-β mRNA had no significant differences than that of control group (1.17±0.11vs.1.00±0.00,P>0.05). The expression of TGF-β mRNA and protein had no significant differences than that of BLM group [1.25±0.11,1.26±0.12vs.1.17±0.11; (31.84±2.04) ng/L, (31.25±2.36) ng/Lvs. (33.95±2.49) ng/L,P>0.05]. HE staining showed that the inflammation of lung tissue was relieved and the dermal thickness and collagen deposition were decreased after the ADSCs therapy. Conclusion: ADSCs could effectively alleviate inflammation of the lungs and fibrosis of skin; the effects of anti-inflammatory and anti-fibrosis were associated with immune regulating function.

Stem cells, mesenchymal; Scleroderma； Immune regulation； Cytokines

國家自然科學(xué)基金項目(81360464)和內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項目(2016MS08109)資助Supported by the National Natural Science Foundation of China(81360464) and the Inner Mongolia Autonomous Region Natural Science Foundation Projects(2016MS08109)

時間：2016-10-31 16：04：17

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20161031.1604.004.html

R593.25

A

1671-167X(2016)06-0970-07

10.3969/j.issn.1671-167X.2016.06.009

△ Corresponding author’s e-mail, wyf5168@ hotmail.com