李世平， 董 梅， 郭彥芳， 程樹(shù)彬， 張祥建， 李春巖

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NBP對(duì)器官型腦片糖氧剝奪模型中細(xì)胞凋亡的影響

李世平， 董 梅， 郭彥芳， 程樹(shù)彬， 張祥建， 李春巖

目的 觀察正丁基苯酞(NBP)對(duì)乳大鼠大腦皮質(zhì)器官型腦片的氧糖剝奪模型(OGD)中細(xì)胞凋亡和線(xiàn)粒體電位的影響。方法 建立SD乳鼠大腦皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)的器官型腦片，SMI-32染色觀察錐體細(xì)胞。2 w后，隨機(jī)分為對(duì)照組(C組)和實(shí)驗(yàn)組(T組)，T組在OGD干預(yù)30 min后給予不同劑量NBP，分為T(mén)0、T0.01、T0.1、T1、T10組，給NBP前和后1 h觀察PI染色；選擇T0組、T10組，觀察兩組在OGD 30 min、NBP 1 h、24 h、72 h、7 d等不同時(shí)間點(diǎn)PI染色變化。于NBP后1 h各T組進(jìn)行JC-1線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)。結(jié)果 器官型腦片OGD 30 min給予NBP 1 h后，C組和各T組PI染色可見(jiàn)不同亮度紅色熒光，各T組熒光強(qiáng)度均大于C組，熒光強(qiáng)度與NBP濃度(0～10 μmol/L范圍內(nèi))呈負(fù)相關(guān)，各T之間組及與C組相比差異有顯著性(P<0.05)；T0組和T10組在OGD 30 min均出現(xiàn)明顯細(xì)胞凋亡，兩組無(wú)顯著性差異。復(fù)氧復(fù)糖后隨時(shí)間延長(zhǎng)T0組細(xì)胞凋亡增加，T10組逐漸減少，差異顯著(P<0.05)；C組和各T組JC-1線(xiàn)粒體檢測(cè)試劑盒染色可見(jiàn)OGD 30 min，復(fù)氧復(fù)糖1 h后，紅色熒光/綠色熒光(R/G)的值明顯減小，R/G的值與NBP濃度呈正相關(guān)，各T組R/G值均小于C組，差異顯著(P<0.05)。結(jié)論 OGD模型可模擬缺血性腦損傷的病理變化，重復(fù)性良好；NBP對(duì)缺血性腦損傷導(dǎo)致的急性和遲發(fā)性細(xì)胞凋亡均具有保護(hù)作用；NBP對(duì)腦片損傷后線(xiàn)粒體電位的耗散有阻止作用，且與劑量相關(guān)。

器官型腦片； OGD； 正丁基苯酞； 細(xì)胞凋亡； PI染色

缺血性腦卒中的致死致殘作用嚴(yán)重威脅著患者的生活質(zhì)量。神經(jīng)元的缺血損傷和凋亡與患者神經(jīng)功能恢復(fù)關(guān)系密切，挽救神經(jīng)元損傷和凋亡對(duì)改善患者預(yù)后至關(guān)重要。

器官型腦片氧糖剝奪模型(oxygen and glucose deprivation，OGD)保存了與在體組織非常接近的細(xì)胞構(gòu)成和各種生理功能，培養(yǎng)條件和干預(yù)方式可準(zhǔn)確控制和便于操作[1]，避免了血腦屏障和動(dòng)物模型側(cè)枝循環(huán)的個(gè)體差異等因素影響，且一些性狀指標(biāo)可在活體狀態(tài)下連續(xù)觀察，因此應(yīng)用逐漸增多[2]。

正丁基苯酞(n-butyl phthalide，NBP)是芹菜甲素的人工合成消旋體，研究表明其具有改善腦缺血后能量代謝、保護(hù)線(xiàn)粒體、縮小梗死面積、改善腦缺血后神經(jīng)功能[3～5]等。本研究旨在建立乳鼠大腦皮質(zhì)體外培養(yǎng)的OGD模型，應(yīng)用SMI染色、PI染色和JC-1染色等方法，觀察NBP對(duì)OGD誘發(fā)的腦片急性損傷和遲發(fā)性細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和器材 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為出生后5～7 d的SD乳鼠(河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供)，雌雄不限。實(shí)驗(yàn)試劑包括正常培養(yǎng)液：50%MEM+25%馬血清+25%Hank’s平衡液(三種均購(gòu)自Gibco公司)+葡萄糖，無(wú)糖培養(yǎng)液同上述成分不加葡萄糖，Geys平衡鹽溶液，DMSO，Propidium iodide(Sigma)，單克隆小鼠抗非磷酸化神經(jīng)絲單克隆抗體(SMI-32，Stemberger Monoclonals)，線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒JC-1(碧云天生物技術(shù)研究所，C2006)，正丁基苯酞原料藥(NBP，石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司免費(fèi)提供)等。實(shí)驗(yàn)器材包括CO2培養(yǎng)箱(Sanyo，MCO-18AIC)，Mcilwain活組織切片機(jī)，插入式培養(yǎng)皿Millicell-CM insert(Millipore)，厭氧罐，空氣真空泵(天津奧特塞恩斯儀器有限公司，AP-01D)，倒置熒光顯微鏡(Olympus)等。

1.2 大腦皮質(zhì)器官型腦片的制備及SMI-32染色 根據(jù)參考文獻(xiàn)[6，7]，選用5～7 日齡SD乳鼠，快速剝離腦組織后留取頂葉皮質(zhì)并修整組織塊，用組織切片機(jī)連續(xù)切成350 μm厚冠狀切片，放置在insert培養(yǎng)皿內(nèi)，于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱孵育，箱內(nèi)持續(xù)通入5%CO2和95%空氣的混合氣體，每周換液兩次。分別在培養(yǎng)1 w、2 w、3 w、4 w時(shí)，對(duì)腦片進(jìn)行SMI-32染色，觀察錐體細(xì)胞生長(zhǎng)并計(jì)數(shù)。

1.3 腦片OGD建立及NBP干預(yù) 取培養(yǎng)2 w腦片，隨機(jī)分為對(duì)照組(C組)和實(shí)驗(yàn)組(T組，分為T(mén)0、T0.01、T0.1、T1、T10組)，每組9片。各T組更換無(wú)糖培養(yǎng)液(含PI 1 μg/ml)，置于密閉厭氧培養(yǎng)罐中，用真空泵抽出罐內(nèi)空氣，充入5%CO2+95%氮?dú)饣旌蠚怏w，制備腦片OGD模型，于培養(yǎng)箱孵育30 min后取出，添加不同劑量NBP(0、0.01、0.1、1.0、10 μmol/L)，正常條件孵育1 h。C組同時(shí)更換兩次正常培養(yǎng)液(含PI 1 μg/ml)，正常條件孵育。NBP為油狀液體，提前以二甲基亞砜(DMSO)溶解稀釋。

1.4 腦片PI染色 使用時(shí)將PI染料加入培養(yǎng)液稀釋為1 μg/ml終濃度，孵育C組和各T組腦片20 min，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，然后使用Image-Pro Plus 1.7軟件處理，計(jì)算照片熒光強(qiáng)度值。因腦片厚度不同可能導(dǎo)致背景熒光差異，需對(duì)熒光值進(jìn)行矯正。設(shè)定測(cè)得值為Gm，那么最終的值G=G/G0·G0cont-G cont，其中G0是實(shí)驗(yàn)?zāi)X片OGD之前所測(cè)值，G0cont是對(duì)照組在OGD之前所測(cè)得的平均值，G cont是對(duì)照組在處理的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)所測(cè)得的平均值[8]。

1.5 JC-1線(xiàn)粒體檢測(cè)試劑盒染色 配置染色工作液：取適量JC-1(200X)，按照每50 μl JC-1加入8 ml超純水的比例稀釋JC-1，充分溶解混勻，再加入2 ml JC-1緩沖液(5X)，混勻即可。吸除insert培養(yǎng)皿中舊培養(yǎng)液，加入1 ml預(yù)溫至37 ℃新培養(yǎng)液。加入1 ml JC-1染色工作液，充分混勻，放入培養(yǎng)箱37 ℃孵育20 min。孵育期間，將適量JC-1染色緩沖液(5X)稀釋為JC-1染色緩沖液(1X)，并放至冰浴。腦片孵育結(jié)束后，用JC-1染色緩沖液洗滌，加入1 ml培養(yǎng)液，分別在倒置熒光顯微鏡紅色熒光和綠色熒光設(shè)置下觀察、拍照，并使用Image-Pro Plus 5.1軟件處理圖片，計(jì)算紅綠熒光強(qiáng)度比值。陽(yáng)性對(duì)照的設(shè)置：采用試劑盒中提供的CCCP(10 μmol/L)按照1∶1000比例加入培養(yǎng)液，孵育腦片20 min，后按照上述方法加入JC-1，并在倒置熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 器官型腦片錐體細(xì)胞SMI-32免疫組化染色計(jì)數(shù) 腦片在體外培養(yǎng)存活良好，鏡下觀察可見(jiàn)腦片體積逐漸增大，變薄，透光度增加，皮質(zhì)和皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)分界清晰，培養(yǎng)4 w時(shí)仍健康存活。培養(yǎng)1 w、2 w、3 w、4 w腦片進(jìn)行SMI-32免疫組化染色，可見(jiàn)一層SMI-32陽(yáng)性的細(xì)胞排列整齊，與皮質(zhì)表面平行，每個(gè)細(xì)胞胞體呈橢圓形或錐形，每個(gè)細(xì)胞有一個(gè)長(zhǎng)的頂樹(shù)突伸向皮質(zhì)。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)層逐漸清晰，數(shù)目并無(wú)明顯改變(見(jiàn)表1、圖1)。

表1 腦片錐體細(xì)胞在不同培育時(shí)間點(diǎn)數(shù)量

各時(shí)間點(diǎn)錐體細(xì)胞數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P>0.05)

圖1 A、B、C、D分別為1 w、2 w、3 w、4 w不同時(shí)間點(diǎn)SMI-32陽(yáng)性錐體細(xì)胞

圖2 OGD后不同濃度NBP干預(yù)，PI染色(A：對(duì)照組；B：OGD 30 min；C：NBP 0.01 μmol/L；D：NBP 0.1 μmol/L；E：NBP 1 μmol/L；F：NBP10 μmol/L)

圖3 T0組熒光隨時(shí)間延長(zhǎng)亮度增加(A：對(duì)照組；B：OGD 30 min；C：T0 1 h；D：T0 24 h；E：T0 72 h；F：T0 7 d)

圖4 T10組熒光隨時(shí)間延長(zhǎng)亮度降低(A：對(duì)照組；B：OGD 30 min；C：T10 1 h；D：T10 24 h；E：T10 72 h；F：T10 7 d)

圖5 腦片OGD 30 min后，恢復(fù)正常氧糖含量并分別給予不同濃度NBP的PI染色值P<0.05

圖6 腦片OGD 30 min后，恢復(fù)正常氧糖含量，觀察T0、T10不同時(shí)間的PI染色值，T0染色值隨時(shí)間遞增，T10染色值隨時(shí)間遞減，P<0.05)

圖7 器官型腦片OGD 30 min后，加入不同濃度NBP，復(fù)氧復(fù)糖1 h后，進(jìn)行JC-1線(xiàn)粒體檢測(cè)試劑盒染色，可見(jiàn)T組R/G值小于C組，各T組比值有差異(P<0.05)

2.2 培養(yǎng)腦片OGD模型及藥物干預(yù)的PI染色

2.2.1 各T組PI染色 制備器官型腦片OGD 30 min后，恢復(fù)正常氧糖含量并分別給予不同濃度NBP 1 h，與C組相比，各T組均可見(jiàn)到不同強(qiáng)度的紅色熒光，與NBP濃度呈負(fù)相關(guān)，各組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖2、圖5)。

2.2.2 T0、T10組PI染色 器官型腦片OGD 30 min后，恢復(fù)正常氧糖含量分別加入NBP(0 μmol/L，10 μmol/L)，觀察不同的時(shí)間(OGD 30 min，NBP+再灌注1 h、24 h、72 h、7 d)PI染色，可見(jiàn)兩組在OGD 30 min后均出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞凋亡，差異無(wú)顯著性，T0組隨時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞凋亡明顯增加。T10組隨時(shí)間延長(zhǎng)，PI染色逐漸減少。兩組各時(shí)間點(diǎn)之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖3、圖4、圖6)。

2.3 JC-1線(xiàn)粒體檢測(cè)試劑盒染色 器官型腦片OGD 30 min后，恢復(fù)正常條件并加入不同濃度NBP，復(fù)氧復(fù)糖1 h后，進(jìn)行JC-1線(xiàn)粒體檢測(cè)試劑盒染色，可見(jiàn)各T組R/G值均小于C組，各T組隨NBP濃度增高，R/G值明顯增高，兩者呈正相關(guān)(見(jiàn)圖7)。

3 討 論

離體的腦片相對(duì)于在體實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，避免了血腦屏障、離子濃度變化、體溫、pH值等個(gè)體差異的影響，保持了神經(jīng)元與其他細(xì)胞的相互關(guān)系和神經(jīng)突觸回路等，能夠有效地研究缺血性腦損傷。本實(shí)驗(yàn)選擇了出生后5～7 d的SD乳鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)制備器官型腦片，采用Millicell膜插件的方式培養(yǎng)，保證營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的供應(yīng)，成功率高，操作簡(jiǎn)便。本實(shí)驗(yàn)選用體外培養(yǎng)2 w時(shí)進(jìn)行模型建立及藥物干預(yù)，更接近于成年鼠的神經(jīng)元對(duì)刺激損傷的變化。

本實(shí)驗(yàn)采用的OGD模型模擬了實(shí)際缺血過(guò)程中氧和葡萄糖的耗竭過(guò)程，使腦組織的病理改變盡可能接近在體情況下的實(shí)際變化。建立OGD模型時(shí)，本實(shí)驗(yàn)選用了厭氧培養(yǎng)罐作為密閉容器，該容器密閉性好，有單獨(dú)閥門(mén)，可控制氣體進(jìn)出，且?guī)в袣鈮罕恚芍苯佑^察抽出和充入氣體的量，使氮?dú)夂虲O2量相對(duì)穩(wěn)定，體積小可直接放進(jìn)培養(yǎng)箱孵育，最大限度維持實(shí)驗(yàn)過(guò)程中溫度恒定，試驗(yàn)后可盡快恢復(fù)至正常培養(yǎng)條件。

NBP是我國(guó)研發(fā)的國(guó)家一類(lèi)新藥，對(duì)局部缺血腦組織具有改善局部血液微循環(huán)，促進(jìn)局部毛細(xì)血管生長(zhǎng)，保護(hù)線(xiàn)粒體等功能。林劍鋒和馮亦璞在動(dòng)物大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型的研究中發(fā)現(xiàn)，MCAO術(shù)后2 h進(jìn)行不同劑量NBP灌胃，能明顯減少腦梗死的體積，改善神經(jīng)功能，并有很好的量效關(guān)系。表明NBP對(duì)遲發(fā)型細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[9]。

PI是一種穩(wěn)定的熒光染料，僅在細(xì)胞死亡或凋亡過(guò)程中，細(xì)胞膜遭到破壞時(shí)進(jìn)入細(xì)胞，PI對(duì)神經(jīng)細(xì)胞無(wú)毒性損傷，與脫氧核糖核酸(DNA)緊密結(jié)合后被激發(fā)出明亮紅色熒光。本研究中PI染色表明OGD/再灌注后，發(fā)生急性細(xì)胞凋亡及遲發(fā)損傷，PI染色明顯；應(yīng)用NBP后PI染色隨濃度的增加及應(yīng)用時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減弱，發(fā)生可逆性變化，提示NBP對(duì)損傷的細(xì)胞具有保護(hù)作用，可阻斷細(xì)胞凋亡過(guò)程的發(fā)生。

腦缺血的細(xì)胞損傷分為急性細(xì)胞壞死和遲發(fā)的細(xì)胞凋亡。近來(lái)報(bào)道，線(xiàn)粒體跨膜電位耗散發(fā)生于缺血早期，不能維持線(xiàn)粒體內(nèi)外膜之間的質(zhì)子H+梯度，呼吸鏈?zhǔn)艿揭种?，氧化磷酸化障礙，線(xiàn)粒體膜的結(jié)構(gòu)和通透性的改變，大量鈣離子，活性氧，細(xì)胞色素C等物質(zhì)釋放進(jìn)入胞漿，從而激活casepase家族，細(xì)胞進(jìn)入不可逆的凋亡過(guò)程[10]。同時(shí)由于ATP減少，細(xì)胞能量耗竭，不能維持正常的滲透壓和膜電位，蛋白質(zhì)合成受到抑制，甚至基因表達(dá)異常，進(jìn)一步加速了凋亡的進(jìn)程[11]。穩(wěn)定線(xiàn)粒體跨膜電位能夠減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。這對(duì)腦梗死體積和神經(jīng)功能預(yù)后有非常密切的關(guān)系，對(duì)臨床治療更有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

JC染色是一種以JC-1為熒光探針，快速靈敏地檢測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線(xiàn)粒體膜電位變化的試劑盒，可以用于早期的細(xì)胞凋亡檢測(cè)。在線(xiàn)粒體膜電位較高時(shí)，產(chǎn)生紅色熒光，較低時(shí)，產(chǎn)生綠色熒光。通過(guò)JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測(cè)到細(xì)胞膜電位的下降，同時(shí)也可以作為細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)。本研究中JC染色結(jié)果表明腦片損傷后存在線(xiàn)粒體電位的耗散在早期已經(jīng)出現(xiàn)，應(yīng)用NBP干預(yù)后，可阻斷線(xiàn)粒體膜電位的降低，且這種作用與NBP濃度存在量效關(guān)系，呈正比，表明NBP可以通過(guò)保護(hù)線(xiàn)粒體膜電位的作用，減輕細(xì)胞凋亡過(guò)程。

本實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，NBP對(duì)OGD/復(fù)氧復(fù)糖誘導(dǎo)的腦片急性和遲發(fā)損傷均具有保護(hù)作用，且有明顯的量效關(guān)系。NBP(10 μmol/L)對(duì)遲發(fā)性損傷有明顯的保護(hù)作用，對(duì)腦組織損傷的預(yù)后具有明顯的改善作用，這一作用與NBP能夠保護(hù)線(xiàn)粒體，減少線(xiàn)粒體膜電位的耗散有關(guān)，但是具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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The effection of NBP on apoptosis of organotypic brain slices in the model of oxygen-glucose deprivation

LIShipin，DONGMei，GUOYanfang，etal.

(DepartmentofNeurology，KeyLaboratoryofNeurologyofHebeiProvince，TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050000，China)

Objective To establish the oxygen and glucose deprivation (OGD) model of organotypic brain slices of rat cerebral cortex and observe the effects of n-butyl phthalide (NBP) on apoptosis and mitochondrial membrane potential. Methods Culturing brain slices of SD rats on the membrane insert and observed the morphological changes of pyramidal cells by SMI-32 stain with immunohistochemistry. After being cultured two weeks in vitro，brain slices were divided into two groups：control group(group C) and test group(group T). Group T include five subgroup(T0、T0.01、T0.1、T1、T10) according to different concentrations of NBP(0，0.01μm，0.1 μm，1 μm，10 μm) to brain slices after treating with OGD 30 min. Brain slices were observed by PI dyeing before and after being given NBP 1 h with different concentrations. Then observing the brain slices in T0and T10dyeing by PI at different time (OGD 30min，NBP 1 h，24 h，72 h，7 d). Group C and each subgroups of T，treated by OGD and NBP in order (no PI)，were detected the mitochondrial membrane potential by JC-1 kits. Results Brain slices were treating with NBP 1 h after OGD 30 min，they showed different brightness of red fluorescence in control group and test group (T0、T0.01、T0.1、T1、T10) by PI staining. Compared with control group，the fluorescence intensity of each experimental subgroup were greater and negatively related to the concentration of NBP (P<0.05). Observing the apoptosis in slices of T0and T10at different time (OGD 30 min，NBP 1 h、24 h、72 h、7 d)，we found the number of cell death had no significant different at OGD 30 mim. After giving normal glucose and oxygen，the brain slices had increasing fluorescence intensity in T0and decreasing fluorescence intensity in T10with prolonged time (P<0.05). After OGD 30 min and returned to normal oxygen and glucose 1 h，the slices were detected by mitochondrial membrane potential detection kit(JC-1 kit). The value of red/green fluorescence of each group (C，T0、T0.01、T0.1、T1、T10) dramatic reduced correlated positively with dose of NBP. The value of each experimental group was smaller than the control group (P<0.05). Conclusion Treated with OGD，brain slices showed ischemic damage including acute cell death and delayed apoptosis. The model can be established easily. NBP had protective effect on ischemic brain. There is a dose-effect relationship between NBP and brain damage. There was dissipation of mitochondrial membrane potential in brain slices after OGD. NBP could prevent the decline of mitochondrial potential in dose-effect dependent way.

Organotypic brain slices； Oxygen and glucose deprivation； N-butyl phthalide； Apoptosis； PI staining

1003-2754(2016)01-0004-05

2015-11-01；

2015-12-16

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，神經(jīng)病學(xué)河北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050000)

李春巖，E-mail：lichuny@126.com

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