劉敬霞， 任非非， 劉會(huì)賢， 劉 洋， 李 娟， 虎喜成

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回藥扎里奴思方聯(lián)合BMSCs移植對腦缺血再灌注大鼠BBB緊密連接蛋白的影響

劉敬霞1， 任非非1， 劉會(huì)賢2， 劉 洋2， 李 娟2， 虎喜成1

目的 觀察扎里奴思方聯(lián)合BMSCs移植對MCAO模型大鼠BBB上Occludin和Claudin mRNA表達(dá)的影響。方法 250只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、扎方組、移植組和聯(lián)合組，除假手術(shù)組10只外，其余各組15只；線栓法制備MCAO模型，體外全骨髓貼壁法培養(yǎng)及擴(kuò)增BMSCs；大鼠灌胃給藥[14.6 g/(kg·d)]，BMSCs懸浮液經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈移植入腦(2×106/200 μl)；移植后1 d、3 d、7 d、14 d取材，干濕重法檢測腦含水量，Real time-PCR技術(shù)檢測Occludin和Claudin mRNA表達(dá)。結(jié)果 模型大鼠腦含水量較假手術(shù)組增加(P<0.01)，Occludin和Claudin mRNA表達(dá)降低(P<0.01)；與模型組比較，扎方、移植及聯(lián)合各3 d、7 d、14 d組腦含水量降低(P<0.01)，各組各時(shí)間點(diǎn)Occludin和Claudin mRNA表達(dá)增高(P<0.01)；與移植組比較，扎方1 d組腦含水量降低(P<0.05)，3 d組Occludin mRNA表達(dá)增高(P<0.01)，7 d組表達(dá)降低(P<0.01)，扎方1 d組Claudin mRNA表達(dá)增高(P<0.05)，7 d、14 d組表達(dá)降低(P<0.01)，聯(lián)合各組腦含水量均降低，以1 d、14 d明顯(P<0.01)，各組Occludin和Claudin mRNA表達(dá)均增高(P<0.01)；扎方與聯(lián)合組比較，聯(lián)合各組腦含水量降低，以7 d、14 d組明顯(P<0.01，P<0.05)，Occludin和Claudin mRNA表達(dá)增高(P<0.01)；同組間比較，均以7 d組變化顯著，腦含水量呈先增后減趨勢，Occludin和Claudin mRNA表達(dá)呈先減后增趨勢，14 d有明顯改善(P<0.01)。結(jié)論 腦缺血再灌注損傷后BBB受損，通透性改變，腦水腫形成，以7 d最為明顯；扎里奴思方和BMSCs移植均可不同程度改善腦缺血后腦水腫程度，以二者聯(lián)合應(yīng)用作用顯著，其機(jī)制可能與干預(yù)Occludin和Claudin mRNA動(dòng)態(tài)表達(dá)有關(guān)。

腦缺血再灌注； 扎里奴思方； 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； Occludin mRNA； Claudin mRNA

腦缺血再灌注損傷(Cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)可發(fā)生于多種腦血管疾病過程中，其病理生理機(jī)制是涉及多環(huán)節(jié)、多因素、多途徑損傷的復(fù)雜的酶促級聯(lián)反應(yīng)。而腦內(nèi)血腦屏障(blood brain barrier，BBB)通透性改變既是損傷后的結(jié)果，又是導(dǎo)致?lián)p傷進(jìn)一步加重的重要因素[1]。緊密連接(tight junction，TJ)是存在于BBB上內(nèi)皮細(xì)胞與毛細(xì)血管之間的復(fù)雜的細(xì)胞系統(tǒng)，是BBB的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，對維持BBB生理功能具有重要意義[2]。Occludin和Claudin是組成TJ的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是衡量TJ功能變化的重要指標(biāo)[3]。研究顯示，Occludin和Claudin與BBB通透性的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，其表達(dá)變化可作為衡量BBB損傷程度的標(biāo)志[4，5]。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是位于骨髓內(nèi)除造血干細(xì)胞之外的另一類非造血干細(xì)胞[6]，具有強(qiáng)大的增殖和多向分化潛能，已成為應(yīng)用干細(xì)胞移植治療腦缺血損傷領(lǐng)域的熱點(diǎn)[7]。扎里奴思方是《回回藥方》中記載的治療腦病的常用方劑，具有芳香開竅，補(bǔ)腎活血功效，能顯著調(diào)控腦缺血后BBB通透性，改善腦組織損傷程度[8]。本研究擬以SD大鼠為研究對象，觀察CIRI大鼠腦內(nèi)Occludin和Claudin的表達(dá)變化及應(yīng)用扎里奴思方聯(lián)合BMSCs移植對其變化的影響，探討聯(lián)合應(yīng)用治療腦缺血損傷的機(jī)制，為回醫(yī)藥聯(lián)合干細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性SD大鼠，250只，清潔級，(350±30) g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(寧)2009-0001；所有大鼠于同一動(dòng)物房中飼養(yǎng)，溫度(26±1) ℃，濕度(50±10)%，光暗周期12 h/12 h，自由進(jìn)食和飲水；常規(guī)環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 試劑和藥物 培養(yǎng)基DMEM/F-12(美國生命科技公司，批號(hào)1292607)，0.25%胰酶(美國HyClone，批號(hào)J130020)，胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào)051126)，青霉素、鏈霉素(美國Solarbio，批號(hào)20110726)，TRIzol(美國Invitrogen，批號(hào)15596-026)，cDNA第一鏈合成試劑盒(美國Thermo Fisher，批號(hào)K1622)，SYBR Green Real time PCR Master Mix(日本TOYOBO)，Agarose(西班牙Biowest，批號(hào)111860)，50×TAE電泳緩沖液(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)KGM020)，氯仿(南京化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)11012710115)，異丙醇(南京化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)12021023041)，DEPC處理70%乙醇(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)KGDN6)，0.1%DEPC Water(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)KGDN4500)，尼龍線栓(北京沙東生物科技有限公司，批號(hào)2636-4A)，水合氯醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20100709)，氨芐青霉素鈉(美國Amresco，批號(hào)0339)。扎里奴思方出自《回回藥方》，組成為：阿你松 (安息香)3 g、法里公(小茴香)12 g、兀沙吉(乳香)12 g、法忒剌撒里榮(當(dāng)歸)12 g、木里(沒藥)12 g、撒法郎(紅花)12 g、阿咱兒公(牡丹皮)9 g、拆不牙剌 (蘆薈)12 g、伯思八牙(水龍骨)12 g、祖伐(懷牛膝)24 g、撒的知(肉桂)6 g、膃肭臍(海狗腎)12 g、阿夫忒蒙(菟絲子)12 g、哈咱卜咱里剌(石菖蒲)12 g。制劑由寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)中醫(yī)院制劑室提供，煎煮濾取并濃縮藥液至生藥濃度為1.46 g/ml，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 儀器 PM-10AD-倒置相差顯微鏡(日本Olympus)，T02323-二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Sheldon Plumbing Inc. )，YP1201N-電子天平(上海精科天平儀器廠)，BL310/BL21S-分析天平(德國Sartorius)，80-2-臺(tái)式低速離心機(jī)(上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，ST16R-高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo Sorvall)，XW-80A-渦旋振蕩器(其林貝爾儀器制造有限公司)，UV-2450-紫外光度儀(日本SHIMADZU)，TC9600-G-普通梯度PCR儀(美國Labnet MultiGene Gradient)，DA7600-熒光定量PCR循環(huán)儀(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)，DYY-6B-核酸電泳儀(北京市六一儀器廠)，Gel Doc XR-凝膠成像儀(美國BIO-RAD)，MDF-U7386S-sanyo超低溫冰箱(日本三洋公司)，CU-420-電熱恒溫水槽(上海恒科技公司)，HS-840U-超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，GZX-DH·500-BS-電熱恒溫干燥箱(上海昕儀儀器儀表有限公司)，YY0088-92-微量進(jìn)樣器(江蘇欣悅玻璃儀器有限公司)，YXQ-LS-50-立式壓力鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 局灶性腦缺血再灌注大鼠模型制備 參照Longa等[9]的改良線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。10%水合氯醛ip麻醉大鼠，待麻醉完全后，仰臥位固定大鼠，常規(guī)消毒手術(shù)視野區(qū)皮膚，頸前正中切開皮膚，鈍性分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)；分離頸內(nèi)(ICA)、頸外(ECA)動(dòng)脈，穿線備用；結(jié)扎ECA近心端和遠(yuǎn)心端，將ECA從中間剪斷；結(jié)扎翼腭動(dòng)脈(PA)，于ECA近CCA分叉處剪一小口，將線栓通過小口穿入ICA并緩慢前向推進(jìn)，直至有阻力感為止，線栓插入深度約為(18.0±0.5) mm；插線成功后留出線栓殘端約1 cm，結(jié)扎ECA剪口處，縫合皮膚，并在切口處滴注青霉素鈉溶液，以防感染。缺血2 h后拆線并緩慢拔出線栓(但未全部拔出ECA)以進(jìn)行缺血再灌注，后縫合皮膚。假手術(shù)組只分離CCA，ICA及ECA，不插入線栓。手術(shù)過程中保持大鼠肛溫(37.0±0.5) ℃，保持室溫(26±1) ℃。術(shù)后參考Longa等[9]的5級4分法對模型進(jìn)行評分：(1)0分，正常，無神經(jīng)功能缺損癥狀。(2)1分，不能完全伸展病變對側(cè)上肢。(3)2分，出現(xiàn)Horner征，行走時(shí)向病變對側(cè)旋轉(zhuǎn)。(4)3分，行走時(shí)向病變對側(cè)傾倒。(5)4分，無自發(fā)活動(dòng)伴意識(shí)降低。1～3分者為成功模型。若術(shù)中意外死亡、缺血再灌注24 h內(nèi)死亡、線栓插入過深造成蛛網(wǎng)膜下腔出血的大鼠被剔除。

1.2.2 BMSCs的培養(yǎng)、擴(kuò)增和移植

(1)懸液收集：將2月齡雄性SD大鼠(250 g)斷頸處死，全身浸泡于75%乙醇中消毒10 min。無菌條件下取出股骨、脛骨，剔除表面附著的組織，PBS清洗3次；剪掉股骨、脛骨的骨垢端，露出骨髓腔，用DMEM/F-12培養(yǎng)基(含肝素及青、鏈霉素)10 ml 反復(fù)沖洗骨髓腔，反復(fù)吹打后用200目細(xì)胞過濾篩過濾，1000 r/min 離心5 min，棄上清；加入含10%FBS的DMEM/F-12完全培養(yǎng)基5 ml 吹打混勻，重懸，收集BMSCs單細(xì)胞懸液；(2)培養(yǎng)、擴(kuò)增：將收集到的BMSCs單細(xì)胞懸液以1×108/L細(xì)胞濃度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、濃度為5%的CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3～4 d 換液1次，棄去未貼壁細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞形態(tài)及生長；待瓶底貼壁細(xì)胞達(dá)80%～90%時(shí)，棄去瓶內(nèi)培養(yǎng)基，PBS緩慢洗滌細(xì)胞，以清除培養(yǎng)瓶內(nèi)混雜細(xì)胞；加入0.25%胰酶2 ml 消化，于倒置顯微鏡下觀察，待貼壁細(xì)胞明顯收縮，間隙變大，大部分細(xì)胞形態(tài)變圓并開始脫落時(shí)，加入完全培養(yǎng)基終止消化，結(jié)束原代培養(yǎng)；反復(fù)吹打培養(yǎng)基，收集細(xì)胞懸液至15 ml 離心管中，1000 r/min，離心5 min，棄上清，加入含10%FBS的DMEM/F-12完全培養(yǎng)基重懸，按1：2比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。逐日觀察細(xì)胞生長狀態(tài)；(3)重懸、計(jì)數(shù)：收集第3代細(xì)胞，如前法進(jìn)行消化、離心及PBS漂洗3次，進(jìn)行細(xì)胞重懸并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至每0.2 ml PBS含細(xì)胞數(shù)為2×106個(gè)備用；(4)移植：建立MCAO模型24 h后，拆線并將剩余線栓殘端全部拔出ECA，沿ECA切口將直徑0.7 mm密閉式靜脈留置針管緩慢插入ECA，緩慢向前推進(jìn)至ICA前端并結(jié)扎；用微量移液器抽取BMSCs單細(xì)胞懸液200 μl，對移植組和聯(lián)合組大鼠經(jīng)留置針管由缺血同側(cè)的頸內(nèi)動(dòng)脈緩慢移植入腦，后拔出留置針，徹底結(jié)扎ECA殘端，縫合皮膚。

1.3 分組與用藥

1.3.1 分組 大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、扎里奴思方組(簡稱扎方組)、BMSCs移植組(簡稱移植組)、BMSCs移植聯(lián)合扎里奴思方組(簡稱聯(lián)合組)；后4組根據(jù)取材時(shí)間點(diǎn)不同又各分為1 d、3 d、7 d、14 d，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)組大鼠15只，假手術(shù)組10只大鼠。

1.3.2 用藥 假手術(shù)組及模型組以同等體積生理鹽水灌胃(ig)；模型組頸內(nèi)動(dòng)脈給予和移植組同等體積的生理鹽水；扎方組于術(shù)前4 dig(大鼠ig用藥的劑量根據(jù)人與大鼠等效劑量換算公式計(jì)算，ig體積按照100 g大鼠ig 1 ml 計(jì)算，生藥用量為[14.6 g/(kg·d)]，配成的混懸液濃度為1.46 g/ml)，再灌注后24 h頸動(dòng)脈給予生理鹽水200 μl；移植組于術(shù)前4 d給予和扎方組同等體積的生理鹽水ig，再灌注后24 h頸內(nèi)動(dòng)脈給予BMSCs懸浮液200 μl(細(xì)胞數(shù)為2×106個(gè))；聯(lián)合組于術(shù)前4 d給予扎里奴思方ig，再灌注后24 h頸內(nèi)動(dòng)脈給予BMSCs懸浮液200 μl。大鼠于術(shù)前12 h禁食，不禁水。

1.4 取材 假手術(shù)組于術(shù)后14 d取材，其余各組根據(jù)時(shí)間點(diǎn)分別于頸內(nèi)動(dòng)脈用藥后1 d、3 d、7 d、14 d取材；麻醉大鼠，4%的多聚甲醛溶液進(jìn)行灌注固定，斷頭取腦，用4 ℃生理鹽水沖洗3次。于冰盤上迅速分離大腦半球，取左側(cè)半球，自額極向后冠狀切取3 mm厚腦組織，待測腦組織含水量；再向后冠狀切取約3 mm厚腦組織切片，取切片皮質(zhì)及半暗帶腦組織50 mg，置入液氮內(nèi)保存，待提取總RNA。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 腦組織含水量測定 斷頭取材后，切取的腦組織迅速用電子天平稱取濕重，后放入電熱恒溫干燥箱(100±2) ℃中干燥24 h，稱取干重。按如下公式計(jì)算。腦組織含水量=(腦濕重-腦干重)/腦濕重×100%。

1.5.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 取切取的缺血側(cè)腦組織置入1.5 ml EP管中，利用TRIzol試劑盒提取總RNA，紫外光度儀測定RNA含量。采用cDNA第一鏈合成試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物采用SYBR Green Real time PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參，采用20 μl 反應(yīng)體系，各引物序列如下：GAPDH：F 5’-GGCCTTCCGTGTTCCTACC-3’，R 5’-CGCCTGCTTCACCACCTTC-3’，103bp；Occludin：F 5’-CCAATCATTATGCACCAAGC-3’，R 5’-GAATTTCGTCTTCCGGGTAA-3’，201 bp；Claudin-5：F 5’-GAAATTCTGGGTCTGGTGCT-3’，R 5’-ATATTGTGGTCCAGGAAGGC-3’，101bp?？偡磻?yīng)體系包括cDNA 1 μl，SYBR Green 2X Real time PCR Master Mix 10 μl，上下游引物各1 μl，0.1% DEPC Water 7 μl。放入熒光定量PCR循環(huán)儀，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，40 cycle；溶解曲線95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，60.3 ℃ 15 s，60.6 ℃ 15 s。目的基因表達(dá)量采用ΔΔCT法進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 腦組織含水量 與假手術(shù)組比較，模型組各時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量增加(P<0.01)。與模型組比較，扎方、移植和聯(lián)合各3 d、7 d、14 d組腦組織含水量降低(P<0.01)。與移植組比較，扎方1 d組腦組織含水量降低(P<0.05)，其余各組變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；聯(lián)合各組腦組織含水量降低，以1 d、14 d組降低顯著(P<0.05，P<0.01)。扎方組與聯(lián)合組比較，聯(lián)合各組腦組織含水量降低，以7 d、14 d組降低顯著(P<0.05，P<0.01)。同組別不同時(shí)間點(diǎn)比較，模型、扎方、移植及聯(lián)合各7 d組腦組織含水量均較1 d、3 d、14 d組增加(P<0.01)，模型、聯(lián)合各14 d組較1、3 d組有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)，扎方14 d組較1 d組降低(P<0.01)，移植14 d組較1 d、3 d組變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。

2.2 腦組織Occludin mRNA表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組各時(shí)間點(diǎn)Occludin mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，扎方、移植及聯(lián)合各組Occludin mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.01)。與移植組比較，聯(lián)合各組及扎方3 d組Occludin mRNA表達(dá)增加(P<0.01)，扎方7 d組表達(dá)降低(P<0.01)。扎方組與聯(lián)合組比較，聯(lián)合各組Occludin mRNA表達(dá)增加(P<0.01)。同組別不同時(shí)間點(diǎn)比較，模型、扎方、移植及聯(lián)合各組Occludin mRNA表達(dá)均成先減后增趨勢，扎方、聯(lián)合各7 d組較1 d、3 d、14 d組降低(P<0.01)，模型7 d組較1 d、3 d組降低(P<0.01)，移植7 d組較14 d組降低(P<0.05)，模型14 d組較3 d組降低(P<0.01)，扎方、聯(lián)合各14 d組較3 d組增加，變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2、圖1)。

2.3 腦組織Claudin-5 mRNA表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組各時(shí)間點(diǎn)Claudin-5 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，扎方、移植及聯(lián)合各組Claudin-5 mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.01)。與移植組比較，聯(lián)合各組及扎方1 d組Claudin-5 mRNA表達(dá)增加(P<0.01，P<0.05)，扎方7 d、14 d組表達(dá)減少(P<0.01)。扎方組與聯(lián)合組比較，聯(lián)合各組Claudin-5 mRNA表達(dá)增加(P<0.01)。同組別不同時(shí)間點(diǎn)比較，模型、移植及聯(lián)合各3 d組Claudin-5 mRNA表達(dá)均較1 d組增加，扎方3 d組較1 d組降低，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，各7 d 組Claudin-5 mRNA表達(dá)均最低，模型、扎方各7 d組均較1 d、3 d、14 d減少(P<0.01)，移植7 d組較14 d組減少(P<0.01)，聯(lián)合7 d組較3 d、14 d減少(P<0.01，P<0.05)(見表3、圖1)。

t為時(shí)間點(diǎn)；與假手術(shù)組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；與移植組比較：5)P<0.05，6)P<0.01；扎方組與聯(lián)合組比較：7)P<0.05，8)P<0.01；與同組別1 d組比較：9)P<0.05，10)P<0.01；與同組別3 d組比較：11)P<0.05，12)P<0.01；與同組別7 d組比較：13)P<0.05，14)P<0.01 (表2、表3同)

表2 扎里奴思方聯(lián)合BMSCs對大鼠腦組織Occludin mRNA的影響

表3 扎里奴思方聯(lián)合BMSCs對大鼠腦組織Claudin-5 mRNA的影響

Occludin mRNA

Claudin-5 mRNA

圖1 Occludin及Claudin-5 mRNA的real time-PCR擴(kuò)增曲線及溶解曲線

3 討 論

BBB是位于腦內(nèi)血管與組織間的一個(gè)復(fù)雜結(jié)構(gòu)，主要由腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其間的TJ、基膜和周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞終足形成的膠質(zhì)膜和細(xì)胞外基質(zhì)組成，是腦組織與周圍環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的通道，對腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要[10]。研究表明[11]，TJ是維持BBB完整性的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其結(jié)構(gòu)和功能的異常對BBB通透性變化起重要作用。TJ由多種蛋白組成，主要包括胞漿黏附蛋白ZO家族(zonula occludens)、跨膜蛋白和細(xì)胞骨架蛋白三類[12]。跨膜蛋白又包括咬合蛋白(Occludin)、閉合蛋白(Claudin)和連接黏附分子(junctional adhesive molecule，JAM)三種膜蛋白[13]。

Occludin是1993年由Furuse等[14]最先分離出的第一個(gè)TJ跨膜蛋白，由504個(gè)氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為65 kDa。Terry等[15]研究證實(shí)，Occludin與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的“屏障”作用密切相關(guān)。Claudin是1998年Furuse等發(fā)現(xiàn)的另一類新的TJ跨膜蛋白[16]，目前已發(fā)現(xiàn)24個(gè)Claudin跨膜蛋白成員，相對分子質(zhì)量在18～27 kDa之間，序列同源性約12.5%～69.7%。研究[17，18]表明，在腦微血管內(nèi)皮系統(tǒng)中，Claudin-3和Claudin-5含量最高，調(diào)節(jié)Claudin特別是Claudin-5對于BBB通透性起重要作用。另有研究[19]發(fā)現(xiàn)，Occludin和Claudin-5兩種蛋白表達(dá)在腦缺血再灌注損傷后4 h減少，于損傷后1～2 d逐漸恢復(fù)，同時(shí)也證實(shí)二者表達(dá)降低加速了腦缺血后BBB的損傷。本研究顯示，CIRI后1 d，大鼠腦組織含水量開始增加，并隨時(shí)間延長呈上升趨勢，在損傷后7 d達(dá)高峰，后逐漸降低，但14 d時(shí)仍高于1 d水平，表明CIRI后BBB受損，通透性改變，大量水分進(jìn)入腦組織形成腦水腫，加重腦損傷程度。Occludin mRNA和Claudin-5 mRNA轉(zhuǎn)錄水平在CIRI后明顯降低，并于損傷后7 d 降至最低，之后逐漸上調(diào)，14 d仍低于1 d、3 d，提示CIRI引起Occludin mRNA和Claudin-5 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的降低是導(dǎo)致BBB通透性改變，損傷程度加重的途徑之一。

BMSCs是存在于骨髓中的一類具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，且具有易于體外分離和培養(yǎng)、免疫原性低的特性，能和腦組織整合并定向遷移、分化以促進(jìn)受損神經(jīng)細(xì)胞再生和修復(fù)[20]。因此，BMSCs被認(rèn)為是干細(xì)胞移植治療腦缺血損傷理想的種子細(xì)胞，利用BMSCs移植成為促進(jìn)損傷后神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)的有效途徑[21]。但腦內(nèi)BBB的屏障作用限制了BMSCs進(jìn)入腦內(nèi)的數(shù)量，影響其治療作用的發(fā)揮[22]。如何有效調(diào)控BBB通透性以促進(jìn)BMSCs進(jìn)入腦內(nèi)并向受損部位遷徙和歸巢成為應(yīng)用BMSCs移植治療CIRI研究的熱點(diǎn)。

芳香開竅類藥物氣味辛香，善于走竄，以開竅醒神、啟閉回蘇為應(yīng)用特點(diǎn)，研究[23]表明，該類藥物能通過多個(gè)途徑調(diào)控BBB通透性，發(fā)揮腦保護(hù)作用。扎里奴思方出自《回回藥方》，由安息香、小茴香、乳香、當(dāng)歸、沒藥、紅花、牡丹皮、蘆薈、水龍骨、懷牛膝、肉桂、海狗腎、菟絲子、石菖蒲等藥組成，原書[24]論其“可開竅，凈其渾身厚濁風(fēng)痰，治療痰盛弱病”，具有芳香開竅、補(bǔ)腎活血功效，其配方中的“香藥”應(yīng)用更是切中中風(fēng)后邪蒙清竅、風(fēng)痰阻竅的病機(jī)變化，是回族醫(yī)學(xué)治療腦梗死的常用方劑之一。前期研究[8]顯示，該方能有效促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)，減輕腦水腫，減少IgG表達(dá)，發(fā)揮BBB調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)將該方與BMSCs聯(lián)合應(yīng)用，結(jié)果顯示，聯(lián)合各組腦組織含水量均較扎方、移植組降低，以7 d、14 d降低明顯，聯(lián)合組各時(shí)間點(diǎn)Occludin和Claudin-5各mRNA轉(zhuǎn)錄水平均較該兩組增高。同時(shí)，扎方組大鼠腦含水量、Occludin和Claudin-5各mRNA轉(zhuǎn)錄水平均較模型組有不同程度改善，表明該方能有效調(diào)控CIRI后BBB通透性，促進(jìn)BMSCs進(jìn)入腦內(nèi)發(fā)揮腦保護(hù)作用，且以兩者聯(lián)合作用顯著。提示兩者聯(lián)合在降低腦缺血損傷后腦水腫方面作用顯著，其機(jī)制可能與影響B(tài)BB上TJ跨膜蛋白Occludin和Claudin-5的動(dòng)態(tài)表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，扎里奴思方聯(lián)合BMSCs移植對CIRI大鼠腦內(nèi)BBB破壞具有協(xié)同保護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)TG跨膜蛋白Occludin和Claudin-5各mRNA轉(zhuǎn)錄水平有關(guān)。

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Effect of Hui Medicine Zhali Nusi Recipe(ZLNS) Combined with Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Transplantation on Expression of Tight Junction Occludin and Claudin mRNA of Blood-brain Barrier in Rats after Cerebral Ischemia Reperfusion Injury

LIUJingxia，RENFeifei，LIUHuixian，etal.

(TraditionalChineseMedicineSchoolofNingXiaMedicalUniversity，Yinchuan750004，China)

Objective To observe the effect of Hui Medicine Zhali Nusi Recipe(ZLNS) combined with bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) transplantation on expression of tight junction Occludin and Claudin mRNA of blood brain barrier(BBB) in middle cerebral artery occlusion(MCAO) rats. Methods SD rats were divided randomly into Sham-operated，model，ZLNS，BMSCs transplantation and ZLNS combined with BMSCs groups；MCAO model was duplicated with nylon thread，BMSCs were cultured and amplified by the whole bone marrow adherence method；Drugs were given to the rats by intragastric administration[14.6 g/(kg·d)]，BMSCs suspension solution were transplanted into brain through carotid artery(2×106/200 μl)；Rat brain was taken out at 1，3，7，14 days after transplantation；Brain water content(BWC) was detected by dry-weight assay，Occludin and Claudin mRNA were detected by real time-PCR. Results The BWC in model groups were obviously increased than that of the sham-operated groups(P<0.01) and the expression of Occludin and Claudin mRNA were obviously decreased(P<0.01)；Compared with the model groups，the BWC at 3、7、14 days in ZLNS，transplantation and combination groups were decreased obviously(P<0.01)，the expression of Occludin and Claudin mRNA in each groups were significantly increased(P<0.01)；Compared with the transplantation groups，the BWC at 1 day in ZLNS group was decreased(P<0.05)，the expression of Occludin mRNA at 3 day in ZLNS group was obviously increased(P<0.01) and was significantly decreased at 7 day(P<0.01)，the expression of Claudin mRNA at 1 day in ZLNS group was increased(P<0.05) and were obviously decreased at 7、14 days(P<0.01)，the BWC in each combination groups were decreased，and were obvious at 1，14 days groups(P<0.01)，the expression of Occludin and Claudin mRNA in each combination groups were significantly increased(P<0.01)；Compared with the ZLNS groups，the BWC were decreased in each combination groups and also obvious at 7、14 days groups(P<0.01，P<0.05)，the expression of Occludin and Claudin mRNA were significantly increased(P<0.01)；Compared with the same group，all changes were remarkable in 7 days group，the BWC was increased firstly and then decreased，the expression of Occludin and Claudin mRNA were opposite to it. All the indicators were improved in 14 days group. Conclusion The BBB was damaged and the permeability of BBB changed after cerebral ischemia reperfusion，the brain edema was formed and was remarkable at 7 days group. Both ZLNS and BMSCs transplantation can improve the brain edema in different extent，the effect is superior by the combination of them，and its mechanism may be related to the regulation of the dynamic expression of Occludin and Claudin mRNA.

Cerebral ischemia reperfusion； Zhali Nusi Recipe； Bone marrow mesenchymal stem cells； Occludin mRNA； Claudin mRNA

1003-2754(2016)01-0054-06

2015-09-29；

2015-11-30

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81260569)

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)中醫(yī)院，寧夏 吳忠 751100)

劉敬霞，E-mail：ljx199566@163.com

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