彭 乾， 趙德豐， 張 健， 薛一雪， 姜季委， 商秀麗

阿爾茨海默病(Alzheimer’ s disease，AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙為主要特征的慢性退行性疾病。β-淀粉樣蛋白(amyloid protein β，Aβ)沉積是AD主要的病理改變[1]。Aβ片段沉積會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)AD發(fā)展[2]。LncRNA是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，在AD中發(fā)揮重要作用。例如，敲減SOX21-AS1能夠減弱對(duì)miR-107的分子海綿吸附作用，抑制Aβ1-42孵育的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡[3]；敲減SNHG1能夠降低KRENEN1表達(dá)，抑制Aβ25-35孵育的人原代神經(jīng)元和SH-SY5Y細(xì)胞凋亡[4]。Bcl-2在AD中的抗凋亡作用已經(jīng)明確[5]。本研究利用Aβ1-42孵育的SH-SY5Y細(xì)胞建立AD神經(jīng)元損傷模型，研究旨在探討LINC00612對(duì)神經(jīng)元凋亡的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制，為AD進(jìn)展提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞來自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司細(xì)胞庫。細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM/F12(Gibco，美國(guó))培養(yǎng)液中于37 ℃，5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將SH-SY5Y細(xì)胞接種于96孔板，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后根據(jù)Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。LINC00612過表達(dá)質(zhì)粒于上海吉瑪公司合成。

1.3 qRT-PCR 按照說明書使用PCR一步法試劑盒(Takara Bio，日本)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

LINC00612引物序列：

Forward：GGATCTCATCACCAGGCAAGCAC

Reverse：GTGACACTCCAAATCCCAGGAAGC

1.4 細(xì)胞活性檢測(cè) 將SH-SY5Y細(xì)胞接種到96孔板，24 h后，分別用0，1，2，4，8，16 μmol/L Aβ1-42于37 ℃，5% CO2環(huán)境中孵育24 h。隨后應(yīng)用CCK-8試劑盒(碧云天，中國(guó))進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)。

1.5 Western blot 收集細(xì)胞并超聲裂解，BCA法測(cè)量蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，隨后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。PVDF膜用牛奶封閉2 h后，Bcl-2一抗(1：1000)，GAPDH(1：1000)孵育過夜。二抗室溫孵育2 h后發(fā)光，分析灰度值。

1.6 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 使用Annexin V-FITC /PI(碧云天，中國(guó))試劑盒進(jìn)行染色。收集待測(cè)細(xì)胞，加入Annexin V-FITC，室溫暗處溫育染色15 min，隨后加入PI染色5 min。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

1.7 RNA-pulldown實(shí)驗(yàn) 使用RNA-pulldown試劑盒(碧云天，中國(guó))進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.8 RIP實(shí)驗(yàn) 使用RIP試劑盒(碧云天，中國(guó))進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，收集細(xì)胞裂解液，在含有磁珠和抗人anti-Ago2抗體的RIP緩沖液孵育，陰性對(duì)照組采用IgG孵育。純化后的RNA應(yīng)用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 Aβ1-42孵育降低SH-SY5Y細(xì)胞活力 在37℃，5% CO2環(huán)境中，分別用0，1，2，4，8，16 μmol/L Aβ1-42孵育SH-SY5Y細(xì)胞24 h。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，8，16 μmol/L濃度的Aβ1-42顯著降低SH-SY5Y細(xì)胞活力(見圖1)。

圖1 不同濃度的Aβ1-42對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響(*P<0.05 vs. Control)

2.2 LINC00612在Aβ1-42孵育的SH-SY5Y細(xì)胞中低表達(dá) qRT-PCR結(jié)果表明，與Control組相比，LINC00612在Aβ1-42孵育的SH-SY5Y細(xì)胞中表達(dá)量顯著降低(見圖2)。

圖2 LINC00612在Aβ1-42孵育的SH-SY5Y細(xì)胞中的表達(dá)(**P<0.01 vs. Control)

2.3 在Aβ1-42孵育的SH-SY5Y細(xì)胞中，過表達(dá)LINC00612增加Bcl-2的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在Aβ1-42孵育的SH-SY5Y細(xì)胞中，過表達(dá)LINC00612顯著增加Bcl-2表達(dá)。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)LINC00612顯著抑制細(xì)胞凋亡(見圖3)”。

圖3 過表達(dá)LINC00612對(duì)Aβ1-42孵育的SH-SY5Y細(xì)胞中Bcl-2(A)和凋亡(B)的影響(**P<0.01 vs. LINC00612(+)-NC)

2.4 LINC00612與Bcl-2結(jié)合，抑制Aβ1-42孵育的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡 RNA-pulldown實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Bcl-2能夠與LINC00612結(jié)合。RIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，anti-Bcl-2組LINC00612的富集程度顯著高于anti-IgG組，提示Bcl-2能夠靶向結(jié)合LINC00612(見圖4)。

圖4 在Aβ1-42孵育的SH-SY5Y細(xì)胞中，RIP(A)和RNA-pulldown(B)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LINC00612與Bcl-2的結(jié)合作用(**P<0.01 vs. anti-IgG)

3 討 論

本研究證明了在Aβ1-42孵育的SH-SY5Y細(xì)胞中，LINC00612表達(dá)顯著上調(diào)；過表達(dá)LINC00612通過靶向結(jié)合Bcl-2，增加Bcl-2表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。

一些研究表明，AD的發(fā)生發(fā)展與LncRNA表達(dá)異常緊密相關(guān)[6]。在AD大鼠模型中，MEG3通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路改善認(rèn)知障礙，抑制海馬神經(jīng)元凋亡[7]。LncRNA RPPH1通過miR-326/PKM2軸降低Aβ25-35孵育SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡[8]。本研究結(jié)果表明，過表達(dá)LINC00612能夠抑制Aβ1-42孵育的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。與本研究結(jié)果相似的研究結(jié)果有，在慢性阻塞性肺疾病中，過表達(dá)LINC00612能夠下調(diào)Notch1，抑制人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[9]。

Bcl-2蛋白家族最初在B細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)，包括促凋亡因子(Bax，Bad)和抗凋亡因子(Bcl-2)[10]?？沟蛲鲆蜃覤cl-2在大腦中廣泛表達(dá)，并與腦缺血，癲癇等疾病中的神經(jīng)元損傷相關(guān)[11，12]。研究表明，由鈣離子超載引起的興奮性毒性損傷促進(jìn)帕金森、AD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展[13～15]。在AD中，Aβ能夠誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]。而Bcl-2能夠減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載，保護(hù)神經(jīng)元免受興奮性毒性的傷害，抑制細(xì)胞凋亡[17]。本研究證明了LINC00612能夠靶向結(jié)合于Bcl-2，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，降低Aβ1-42孵育的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究證明了LINC00612在Aβ1-42孵育的SH-SY5Y細(xì)胞中低表達(dá)，過表達(dá)LINC00612通過靶向結(jié)合Bcl-2下調(diào)其表達(dá)，抑制Aβ1-42孵育的神經(jīng)元凋亡。本研究的結(jié)果為AD進(jìn)展提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，LINC00612下調(diào)Bcl-2的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。