李　勝,梅同華

(1.重慶市沙坪壩區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)科　400030；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸危重病科　400016)

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Skp2基因沉默對SPC-A-1肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

李勝1,梅同華2△

(1.重慶市沙坪壩區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)科400030；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸危重病科400016)

[摘要]目的探討S期激酶相關(guān)蛋白2(Skp2)基因沉默對肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法將Skp2 RNA干擾表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至SPC-A-1肺癌細(xì)胞中，G418篩選獲得陽性克隆細(xì)胞。通過實時熒光定量(RT-PCR)、蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測肺癌細(xì)胞中Skp2的表達(dá)。采用流式細(xì)胞術(shù)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測各組肺癌細(xì)胞生長、凋亡情況。結(jié)果轉(zhuǎn)染Skp2 shRNA表達(dá)載體的肺癌細(xì)胞中Skp2蛋白表達(dá)量明顯減少,抑制效率分別可達(dá)75.3±5.1，70.4±3.2；轉(zhuǎn)染Skp2 shRNA表達(dá)載體的肺癌細(xì)胞生長減慢，阻滯于G1期的增多，S期細(xì)胞減少。Skp2 shRNA轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組凋亡率較陰性對照組明顯增加，細(xì)胞凋亡率分別為(17.5±2.8)%、(15.6±3.1)%。結(jié)論通過特異性沉默Skp2基因的表達(dá)，可有效降低肺癌細(xì)胞中Skp2蛋白表達(dá)水平,抑制肺癌細(xì)胞生長及增加細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞]肺腫瘤；凋亡；RNA干擾；S期激酶相關(guān)蛋白

S期激酶相關(guān)蛋白2(S phase kinase associated protein 2,Skp2)是泛素蛋白酶降解過程中一種重要蛋白組成部分，參與周期蛋白的泛素化降解，與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)障礙密切相關(guān)的可疑癌蛋白，在細(xì)胞增殖生長中發(fā)揮重要作用[1]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)Skp2具有癌基因的潛能，其表達(dá)水平及活性與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及生物學(xué)性狀有關(guān)[2-4]。為了研究Skp2在肺癌生長、增殖中的作用，本實驗通過構(gòu)建Skp2 shRNA表達(dá)質(zhì)粒，抑制Skp2基因表達(dá)，觀察其對人肺癌細(xì)胞生物學(xué)活性的影響，為肺癌治療找到新的分子靶點。

1材料與方法

1.1材料Skp2 RNA干擾重組質(zhì)粒表達(dá)載體購于武漢晶賽生物技術(shù)公司； SPC-A-1肺癌細(xì)胞由上海細(xì)胞庫提供；兔抗人Skp2抗體、鼠抗人P27抗體購于Santa Cruz公司，羊抗兔抗體、羊抗鼠抗體購于北京中山公司；Annexin V-FITC試劑盒購于晶美生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、細(xì)胞篩選SPC-A-1肺癌細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染前1 d，接種于24孔培養(yǎng)板，用無血清、無抗生素培養(yǎng)基稀釋Skp2 RNA干擾表達(dá)載體質(zhì)粒及脂質(zhì)體。將3種重組質(zhì)粒Skp2 shRNA-1、Skp2 shRNA-2、Skp2 shRNA-HK(空質(zhì)粒對照)分別轉(zhuǎn)染至肺癌細(xì)胞內(nèi)，每周換液2次，取陽性克隆肺癌細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.2.2實驗分組將4組肺癌細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組Skp2 shRNA-1組，Skp2 shRNA-2組，Skp2 shRNA-HK組及無質(zhì)粒的陰性對照組進(jìn)行研究。

1.2.3肺癌細(xì)胞生長曲線檢測將4組實驗組細(xì)胞分別接種于96孔培養(yǎng)板中，移至細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按四甲基偶氮唑鹽(MTT)法加入噻唑藍(lán)溶液后繼續(xù)孵育4 h后，再加入二甲基亞砜，酶聯(lián)免疫檢測儀讀取各孔光吸收數(shù)值。分別繪制各組細(xì)胞生長曲線。每組實驗重復(fù)3次。每日取1塊板檢測，連續(xù)檢測7 d。繪制各組細(xì)胞生長曲線。實驗重復(fù)3次。

1.2.4實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測4組肺癌細(xì)胞內(nèi)Skp2 mRNA水平分別收集4組(5×106個/組)肺癌細(xì)胞，按照RT-PCR試劑盒說明書操作，檢測各組Skp2 mRNA水平。細(xì)胞內(nèi)Skp2 mRNA的相對表達(dá)水平以Skp2與β-actin條帶灰度值的比值計算。各組實驗重復(fù)3次。

1.2.5蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測各組肺癌細(xì)胞Skp2、P27蛋白表達(dá)提取4組肺癌細(xì)胞總蛋白，經(jīng)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入特異性針對Skp2、P27、β-actin的一抗抗體，再加入稀釋后的二抗，最后通過化學(xué)發(fā)光底物顯色。對顯色結(jié)果進(jìn)行圖像分析，Skp2、P27蛋白的相對表達(dá)水平以Skp2、P27與β-actin灰度值的比值表示。實驗重復(fù)3次。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分別收集4組細(xì)胞，每組細(xì)胞數(shù)為1×107個，用70%乙醇固定24 h，加入RNA酶，37 ℃反應(yīng)1 h。加入碘化丙啶溶液染色30 min后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測。實驗重復(fù)3次。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況分別收集實驗4組細(xì)胞，每組設(shè)6孔，收集轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞，按照凋亡試劑盒說明進(jìn)行操作。流式細(xì)胞術(shù)檢測記錄各組凋亡比例，實驗重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1肺癌細(xì)胞生長曲線MTT法結(jié)果顯示，Skp2 shRNA-1組、Skp2 shRNA-2組細(xì)胞生長、增殖速度慢于Skp2 shRNA-HK組及陰性對照組，細(xì)胞生長曲線見圖1。

圖1　4組肺癌細(xì)胞的生長曲線

2.2肺癌細(xì)胞內(nèi)Skp2、P27 mRNA表達(dá)情況RT-PCR檢測4組肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后Skp2、P27 mRNA的表達(dá)：Skp2 shRNA-1組、Skp2 shRNA-2組的Skp2 mRNA的表達(dá)產(chǎn)物明顯弱于Skp2 shRNA-HK組、陰性對照組。Skp2 shRNA-1組、Skp2 shRNA-2組肺癌細(xì)胞mRNA與陰性對照組比較，抑制率分別達(dá)到(74.2±5.3)%、(61.5±3.4)%，見圖2。

M:標(biāo)準(zhǔn)參考物；1:陰性對照組；2:Skp2 shRNA-HK組；3:Skp2 shRNA-1組;4:Skp2 shRNA-2組。

圖2Skp2 shRNA對肺癌細(xì)胞內(nèi)Skp2 mRNA

表達(dá)水平的影響

2.3各組肺癌細(xì)胞內(nèi)Skp2、P27蛋白表達(dá)情況與陰性對照組比較，Skp2 shRNA-1組、Skp2 shRNA-2組細(xì)胞內(nèi)Skp2蛋白表達(dá)明顯受到抑制，其抑制率分別達(dá)到75.3±5.1、70.4±3.2,而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組shRNA-1、shRNA-2 細(xì)胞內(nèi)P27蛋白表達(dá)水平明顯增加，上升幅度為73.6±4.6、67.2±2.6，而各組間的β-actin表達(dá)無明顯差異，見圖3。

A:Skp2蛋白表達(dá);B:P27蛋白表達(dá);C:內(nèi)參蛋白表達(dá);1:陰性對照組;2:Skp2 shRNA-HK組;3:Skp2 shRNA-1組;4:Skp2 shRNA-2組。

圖3shRNA對肺癌細(xì)胞內(nèi)Skp2、P27蛋白

表達(dá)水平的影響

A：Skp2 shRNA-1組；B：Skp2 shRNA-2組；C：Skp2 shRNA-HK組；D：陰性對照組。

圖4Annexin V-FITC法對各組細(xì)胞凋亡率檢測

2.4各組細(xì)胞周期的檢測流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，Skp2 shRNA-1組、Skp2 shRNA-2組進(jìn)入S期細(xì)胞比例平均為(22.42±1.52)%、(20.34±1.87)%，低于陰性對照組和Skp2 shRNA-HK組進(jìn)入S期的細(xì)胞比例(30.53%±2.31)%，(29.43±2.24)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而Skp2 shRNA-1組、Skp2 shRNA-2組停滯于G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為(67.35±2.55)%、(69.43±2.23)%，較陰性對照組及Skp2 shRNA-HK組(56.52±2.33)%、(55.34±2.16)%明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而陰性對照組和Skp2 shRNA-HK組進(jìn)入S期的細(xì)胞比例無明顯差別(P>0.05)，見表1。

2.5各組細(xì)胞凋亡率檢測Annexin V-FITC法檢測結(jié)果表明，Skp2 shRNA-1組、Skp2 shRNA-2組細(xì)胞凋亡率與陰性對照組及Skp2 shRNA-HK組相比，兩組細(xì)胞的凋亡指數(shù)出現(xiàn)不同程度的增加，細(xì)胞凋亡率分別高達(dá)(17.5±2.8)%、(15.6±3.1)%，而陰性對照組的細(xì)胞凋亡率為(2.1±0.4)%，Skp2 shRNA-HK組僅為(2.3±0.3)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

表1　流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組細(xì)胞周期改變±s，%)

a:P>0.05，與陰性對照組比較;b:P<0.05，與對照組相比;c:P<0.05，與Skp2-shRNA-HK組比較。

3討論

細(xì)胞周期障礙在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用日益受到重視，而泛素蛋白酶體系統(tǒng)功能的異常將導(dǎo)致細(xì)胞周期發(fā)生障礙，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[5]。Skp2是細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，屬于泛素蛋白連接酶F-box底物識別亞基，能夠特異性地識別各種磷酸化蛋白底物，并介導(dǎo)其泛素化降解[6]。Skp2在細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞增殖調(diào)控方面發(fā)揮重要作用，是細(xì)胞進(jìn)入S期所必需因子，Skp2在S期時水平較高，對細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換發(fā)揮重要作用[7]。在細(xì)胞周期蛋白的泛素蛋白降解過程中，Skp2主要通過特異性識別底物，促進(jìn)底物蛋白泛素化降解而發(fā)揮作用。目前發(fā)現(xiàn)，E2F、myc、cyclinE、cyclinA、CDC25B，以及細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子P27、P21及P57等都是通過Skp2參與的的途徑進(jìn)行降解。Skp2通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白因子的泛素化降解，促進(jìn)細(xì)胞周期發(fā)生轉(zhuǎn)換，從而參與細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)控，在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，正常細(xì)胞中Skp2是低水平表達(dá)的，而在絕大多數(shù)惡性腫瘤如乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、胃癌，以及淋巴瘤等腫瘤中均發(fā)現(xiàn)有異常高的表達(dá)，與腫瘤的惡性程度、侵襲性、轉(zhuǎn)移、預(yù)后密切相關(guān)，具有癌基因的特性。研究表明Skp2促癌機(jī)制與其誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、抑制凋亡、增強(qiáng)腫瘤的侵襲性及轉(zhuǎn)移活性等多方面的特性有關(guān)[2-4]。由于Skp2基因在腫瘤細(xì)胞中的特異性表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此可能成為腫瘤基因治療新的靶點。

本實驗通過Skp2 shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞，研究Skp2在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，檢測各組肺癌細(xì)胞周期的變化，觀察其對細(xì)胞增殖、凋亡的影響。實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染Skp2 shRNA重組質(zhì)粒的細(xì)胞組與對照組比較，進(jìn)入S期的細(xì)胞比例減少，而停滯在G0/G1期細(xì)胞比例增加，沉默Skp2表達(dá)阻滯了細(xì)胞生長、增殖。本實驗觀察到轉(zhuǎn)染Skp2 shRNA重組質(zhì)粒肺癌細(xì)胞內(nèi)Skp2蛋白表達(dá)下調(diào)同時，P27蛋白表達(dá)水平反而上升，也間接證實Skp2可能通過下調(diào)P27蛋白表達(dá)而在促進(jìn)細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用。關(guān)于Skp2對細(xì)胞周期影響的具體機(jī)制仍不清楚，可能通過抑制Skp2表達(dá)，Skp2對負(fù)性周期調(diào)控因子P27、P21、P57泛素化蛋白降解作用減弱，使上述周期調(diào)控因子在細(xì)胞內(nèi)水平的增加，從而抑制了細(xì)胞增殖[8-9]。

許多資料表明，腫瘤細(xì)胞之所以能在機(jī)體內(nèi)迅速增殖與細(xì)胞凋亡機(jī)制受到了抑制有關(guān)。為進(jìn)一步探討Skp2在腫瘤細(xì)胞中的抗凋亡作用，筆者檢測了轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒肺癌細(xì)胞的凋亡情況。Annexin V-FITC檢測結(jié)果表明轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組的凋亡指數(shù)出現(xiàn)不同程度的增加。結(jié)果表明抑制Skp2蛋白的表達(dá)能促進(jìn)SPC-A-1肺癌細(xì)胞的凋亡的發(fā)生，提示Skp2在腫瘤細(xì)胞抗凋亡方面發(fā)揮作用。目前Skp2對抗凋亡方面的作用機(jī)制，有學(xué)者也進(jìn)行了相關(guān)研究和探討[10-13]。抑制癌細(xì)胞Skp2表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞碎片增多，認(rèn)為細(xì)胞凋亡增加與下調(diào)Skp2表達(dá)后，從而減少了對P27、P53、P21等細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白泛素化蛋白降解，上調(diào)了上述周期調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)水平，激活了細(xì)胞內(nèi)凋亡途徑中的重要的凋亡因子caspase-3、 caspase-8、caspase-9活性及增加其水平有關(guān)。

本實驗通過采用RNAi技術(shù)沉默肺癌細(xì)胞內(nèi)Skp2基因表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)Skp2蛋白表達(dá)，增加細(xì)胞內(nèi)周期蛋白P27水平，抑制肺癌細(xì)胞的生長，增加了細(xì)胞凋亡發(fā)生。以Skp2基因為靶點的基因治療有望在不久的將來應(yīng)用于腫瘤的治療，為肺癌的治療提供新的切入點。

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The effect of Skp2 gene silencing on the proliferation and apoptosis of SPC-A-1 lung cancer cells

Li Sheng1,Mei Tonghua2△

(1.DepartmentofInternalMedicine,thePeople′sHospitalofShapingbaDistrict,Chongqing400030,China;2.DepartmentofRespiratoryDiseases,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of Skp2 gene silencing on the proliferation and apoptosis of SPC-A-1 lung cancer cells.MethodsSpecific small hairpin RNA (shRNA) targeting Skp2 gene was introduced into lung cancer cells by Lipofectamine 2000 and the positive clones were screened by G418.The Skp2 mRNA and protein expression level of lung cancer cells were detected by RT-PCR and Western blot．MTT method and flow cytometry (FCM) analysis were used to observe the effect of RNAi on proliferation of lung cancer cells.Cell apoptosis was analyzed by FCM.ResultsTransfected with Skp2 shRNA expression vector significantly reduced the expression of Skp2 protein in lung cancer cells.Inhibition efficiency was respectively (75.3±5.1),(70.4±3.2).P27 protein expression was increased significantly in lung cancer cells.The growth of lung cancer cells transfected with Skp2 shRNA was blocked,with Glphase cells increased and S phase cells decreased.The apoptosis rate of cancer cells was higher in Skp2 shRNA groups than in control groups.Apoptosis rates were (17.5±2.8)%,(15.6±3.1)% in Skp2 shRNA groups.ConclusionSpecific inhibition of the expression of Skp2 can slow down the growth of lung cancer cells,increase cell apoptosis.

[Key words]lung neoplasms;apoptosis;RNA interference;S-phase kinase associated protein

作者簡介：李勝(1971-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事腫瘤生物學(xué)研究?！魍ㄓ嵶髡?，Tel:(023)89012016;E-mail:mtonghua@163.com。

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.009

[中圖分類號]R734.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)17-2334-03

(收稿日期：2015-12-18修回日期：2016-03-02)