黃鳳霞　賀紅艷　黃君華　李小峰　張淑莉　王影

【摘 要】目的：探討雷帕霉素（RAPA）對人慢性髓系白血病K562細胞株增殖和凋亡作用的影響。方法：取對數(shù)生長期K562細胞，用不同濃度的雷帕霉素（25、50、100nmol/L）處理K562細胞24、48、72h后收集細胞，MTT比色法檢測處理組細胞的生長抑制率，流式細胞術(shù)檢測細胞早期凋亡率。結(jié)果：MTT法檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，不同濃度的雷帕霉素對K562細胞的增殖均有明顯的抑制作用，100nmol/L雷帕霉素處理72h后抑制率高達48%，且呈濃度和時間雙重依賴性，與對照組相比具有統(tǒng)計學意義（t=6.691，p<0.05）；流式細胞術(shù)檢測25、50、100nmol/L雷帕霉素作用24h后，K562細胞早期凋亡率分別為13.12±0.32，18.56±0.12，25.95±0.16，均較對照組明顯增高，48h、72h細胞凋亡率明顯增高，兩兩比較差異具有統(tǒng)計學意義（t=4.900，t=14.640，t=16.830，p<0.05）。結(jié)論：雷帕霉素對K562細胞的生長具有抑制作用，并誘導細胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】雷帕霉素；K562細胞；增殖；凋亡

慢性粒細胞白血病是一種起源于造血干細胞的疾病，其特征是具有Ph染色體在分子形式形成BCR/ABL融合基因。[1]它的治療受到科學界的廣泛重視，雷帕霉素（RAPA）是一種大環(huán)內(nèi)酯類抑制劑，已作為抗真菌藥、免疫抑制劑應(yīng)用于臨床[2]。研究證實雷帕霉素具有抗腫瘤作用，如抑制骨肉瘤細胞的增殖及其血管生長[3]、誘導胰腺癌細胞的凋亡[4]等。研究報道雷帕霉素在HER2陽性的乳腺癌細胞[5]、A549肺癌細胞[6]、HepG-2肝癌細胞[7]等多種惡性腫瘤細胞中有較強的抑制作用。

有研究顯示雷帕霉素抑制膀胱癌5637細胞增殖同時可以誘導細胞凋亡[8]。對于RAPA抗惡性血液腫瘤作用的機制研究報道不多。本研究以人慢性粒細胞性白血病K562細胞為研究對象，分析雷帕霉素對慢性粒細胞白血病K562細胞株的增殖及細胞凋亡的影響，為臨床治療慢性粒細胞白血病找到新方法。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人慢性髓性白血病K562細胞細胞株（陜西省人民醫(yī)院血液內(nèi)科中心實驗室）。

1.2 主要試劑

雷帕霉素（美國LC公司）、二甲基亞砜（DMSO）（Sigma）、噻唑藍（MTT）購自上海生工公司、RPMI-1640（Gibco公司）、Annexin V-FITC/PI雙標記染色試劑盒（晶美公司）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

人慢性髓性白血病K562細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10g/dl胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，并加入含1g/dl青霉素-鏈霉素，培養(yǎng)條件為37℃、飽和濕度為5ml/dlCO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對數(shù)生長期K562細胞進行實驗。

1.3.2 MTT檢測細胞增殖

將處于對數(shù)生長期的K562細胞，調(diào)整細胞密度為5×105個/ml，接種于96孔無菌培養(yǎng)板中，分別用25、50、100nmol/L雷帕霉素處理K562細胞，每組均設(shè)3個復孔，各組細胞置于37℃、5ml/dl CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h、48h和72h后，然后加入10μlMTT孵育4h，將孵育后培養(yǎng)板取出，小心吸棄孔內(nèi)上清，每孔加入150μlDMSO，于搖床上振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。以調(diào)零孔調(diào)零，在酶標儀上490nm波長處檢測各孔吸光度值，實驗重復三次，按照如下公式計算細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗孔A490/對照孔A490）×100%。

1.3.3 Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率

取對數(shù)生長期K562細胞，調(diào)整細胞密度為1×106個/ml，分別用25、50、100nmol/L雷帕霉素處理K562細胞，每組均設(shè)3個復孔，各組細胞置于37℃、5ml/dlCO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h、48h和72h后，4℃預(yù)冷PBS洗1次，棄上清，用100μl鈣緩沖液重懸細胞，加AnnexinV-FITC10μl和PI5μl，室溫孵育15min，加鈣緩沖液300μl。應(yīng)用流式細胞儀檢測早期凋亡細胞百分率，實驗重復三次。

1.3.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用■±S表示，均數(shù)的兩兩比較用t檢驗，p<0.05有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2.1 雷帕霉素抑制K562細胞增殖抑制作用：

不同濃度雷帕霉素處理K562細胞24h、48h和72h后，隨著濃度的增加和時間的延長，對K562細胞抑制作用逐漸增加，細胞增殖抑制率增高，見表1。雷帕霉素對K562細胞生長有明顯的抑制作用，并呈現(xiàn)濃度和時間雙重依賴性，與對照組比較有明顯差異（p<0.05）。

2.2 雷帕霉素誘導K562細胞凋亡

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，25，50，100nmol/L的雷帕霉素作用于K562細胞，作用24h，48h，72h后細胞凋亡率均較空白對照組顯著增加（p<0.05），（表2）表明具有劑量依賴性，因此雷帕霉素處理組可以誘導K562細胞凋亡。

3 討論

慢性粒細胞白血?。–ML）是起源于造血干細胞的克隆性增殖性疾病，目前研究在探索治療慢性粒細胞白血病的機制及其新方法，誘導腫瘤細胞調(diào)亡是治療白血病的必要手段。研究表明，mTOR通路抑制劑可以使細胞周期阻滯在G1期，并可進一步促進線粒體損傷途徑，產(chǎn)生自噬及介導細胞凋亡[9]。雷帕霉素是一種強有效的新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其主要作用位點在mTOR信號傳導通路，靶向mTOR信號通路是治療腫瘤的一個新的方向，目前臨床上已經(jīng)應(yīng)用雷帕霉素治療腎細胞癌，在惡性血液疾病研究當中逐漸開始關(guān)注，探索雷帕霉素在慢性粒細胞白血病的作用機制，為臨床治療提供理論依據(jù)。

采用MTT法檢測不同濃度雷帕霉素處理K562細胞24h、48h、72h后，對細胞生長增殖的影響，結(jié)果顯示，雷帕霉素處理K562細胞增殖明顯被抑制，并呈時間和劑量依賴性。增殖抑制率與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.05），表明雷帕霉素作為mTOR的抑制劑，可以抑制K562細胞中的mTOR的活性，已有研究顯示，雷帕霉素對白血病細胞HL-60、SUP-B15細胞具有較強抑制作用，因而，證實雷帕霉素抑制K562細胞的增殖，可以為慢性粒細胞白血病聯(lián)合用藥治療提供新的治療方案。

流式細胞術(shù)檢測不同濃度雷帕霉素對K562細胞的早期凋亡率，結(jié)果顯示，作用K562細胞24h后，早期凋亡率分別是15.19±0.32，

21.56±0.12，25.95±0.16，各實驗組與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.05），雷帕霉素使得大量K562細胞停滯于G0/G1期，不能進入S期進行DNA的合成，抑制腫瘤細胞的增殖，并誘導細胞凋亡。研究表明，雷帕霉素可通過抑制mTOR信號，從而導致造血干細胞發(fā)育分化進程被抑制，阻止細胞周期的轉(zhuǎn)變[10]，提示雷帕霉素明顯抑制K562細胞增殖，誘導細胞凋亡，具體機制有待進一步研究。

【參考文獻】

[1]G，ui XM， Zhang Y Pan JL，et al. Chronic myeloid leukemia with e14a3 BCR-ABL transcript： anslysis of characteristic and prognostic significance[J].Lurk lymphoma， 2015：56（12）：3343-3347

[2]張亞莉，陳濤，王劍青，等，雷帕霉素對人急性淋巴細胞白血病細胞SUP-B15的增殖、凋亡與自噬的影響[J].實用預(yù)防醫(yī)學，2012，19（9）：1291-1295. Zhang YL， Chen T， Wang JQ， et al. Study on the Effects of Rapamycin on Cell Proliferation， Apoptosis and Autophagy in Human Acute Lymphoblastic Cell Line SUP-B15[J].Practical Preventive Medicine2012，19（9）：1291-1295.

[3]Liu WN， Lin JH， Cheng YR， et al. FIM-A， a phosphorus-containing sirolimus，inhibits the angiogenesis and proliferation of osteosarcomas[J].Oncol Res，2013，20（7）：319-326.

[4]Muilenburg D， Parsons C， Coates J， et al. Role of autophagy in apoptotic regulation by Akt in pancreatic cancer[J]. Anticancer Res， 2014， 34（2）：631-637.

[5]Yan C， Wei H， Minjuan Z， et al. The mTOR inhibitor rapamycin synergizes with a fatty acid synthase inhibitor to induce cytotoxicity in ER/HER2-positive breast cancer cells[J].PLoS One， 2014，9（5）：e97697.

[6]Krzesniak M， Zajkowicz A， Matuszczyk I， et al. Rapamycin prevents strong phosphorylation of p53 on serine 46 and attenuates activation of the p53 pathway in A549 lung cancer cells exposed to actinomycin D[J].Mech Ageing Dev， 2014，

139：11-21.

[7]葉獻詞，薛剛，束慶文，等.雷帕霉素聯(lián)合順鉑誘導肝癌細胞凋亡和自噬及對細胞侵襲力的影響[J].中華臨床醫(yī)師雜志：2014，8（7）：1293-1297.

[8]單廣夷，付成，陳昂，等.雷帕霉素對膀胱癌5637細胞增殖及細胞周期的影響[J].中國醫(yī)科大學學報，2015，44（3）：230-233.

[9]Sun YW， Huang WJ， Hsiao CJ， et al. Methoxychalcone induces cell-cycle arrest and apoptosis in human hormone-resistant prostate cancer cells through PI 3-kinase independent inhibition of mTOR pathways[J]. Prostate，2010，70（12）；1295-1306.

[10]Xiang X， Zhao J， Xu G， et al. mTOR and the differentiation of mesenchymal stem cells. Acta Biochim Biophys Sin， 2011；43（7）：501-510[J].

[責任編輯：王楠]