張敏

[摘要] 目的 研究普伐他汀（pravastatin，Pra）對(duì)人胰腺癌細(xì)胞SW1990增殖和凋亡的影響及其聯(lián)合吉西他濱（gemcitabine，GEM）對(duì)該細(xì)胞的作用。 方法 MTT比色法測(cè)定普伐他汀對(duì)SW1990細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。不同濃度普伐他汀處理細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。吉西他濱、普伐他汀聯(lián)合吉西他濱作用細(xì)胞48 h，MTT法測(cè)定各處理組的OD值，并計(jì)算相互作用指數(shù)。 結(jié)果 MTT比色法顯示普伐他汀對(duì)SW1990細(xì)胞具有抑制增殖的作用，5、15、25 μmol/L普伐他汀處理SW1990細(xì)胞后，SW1990細(xì)胞出現(xiàn)典型的形態(tài)學(xué)改變，且凋亡百分率隨濃度增大而逐漸增加。普伐他汀聯(lián)合吉西他濱作用細(xì)胞后，GEM的IC50值降低。結(jié)論 普伐他汀具有抑制胰腺癌細(xì)胞SW1990增殖和誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡的作用，普伐他汀聯(lián)合吉西他濱對(duì)SW1990細(xì)胞具有協(xié)同抗瘤作用。

[關(guān)鍵詞] 普伐他?。患魉麨I；胰腺癌；增殖；凋亡；SW1990

[中圖分類號(hào)] R735.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）27-0009-04

胰腺癌是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在歐美等西方發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)病率高，致死率在美國(guó)僅次于結(jié)腸癌居第4位[1]。近年來(lái)，隨著環(huán)境污染加重、飲食結(jié)構(gòu)調(diào)整及糖尿病年輕化等原因，我國(guó)胰腺癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)[2]。胰腺癌起病隱匿，進(jìn)展迅速，確診時(shí)超過(guò)80%的患者已屬中晚期而失去手術(shù)機(jī)會(huì)，需采用以化療為主的綜合治療手段。吉西他濱為脫氧胞苷類似物，是治療進(jìn)展期和轉(zhuǎn)移性胰腺癌的一線標(biāo)準(zhǔn)藥物，但有效率不高，且易發(fā)生耐藥。如何提高化療藥物的敏感性并逆轉(zhuǎn)耐藥，是目前胰腺癌治療領(lǐng)域研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。他汀類藥物通過(guò)抑制內(nèi)源性膽固醇合成的限速酶——羥甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶，具有降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成的作用，是臨床治療高脂血癥的主要藥物[3]，廣泛用于治療和預(yù)防其他心腦血管疾病[4]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物除降膽固醇作用外，還可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。本實(shí)驗(yàn)初步研究了普伐他汀對(duì)人胰腺SW1990細(xì)胞的體外作用及其協(xié)同吉西他濱的抗瘤作用。

1材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

人胰腺癌細(xì)胞株SW1990購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞研究所。普伐他汀購(gòu)自Sigma公司，將普伐他汀溶解、激活、滴定后加無(wú)菌蒸餾水配制成1 mmol/L備用。吉西他濱為市售齊魯制藥公司產(chǎn)品，溶解于無(wú)菌0.9%生理鹽水，按實(shí)驗(yàn)設(shè)定用培養(yǎng)基稀釋成所需終濃度。胎牛血清為杭州四季青生物技術(shù)公司產(chǎn)品，四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。試劑均為分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

在37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，將SW1990細(xì)胞于含10%胎牛血清、含青霉素100 U/mL、含鏈霉素100 U/mL的RPMI-1640培養(yǎng)基中常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MTT比色法檢測(cè)普伐他汀對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后制備成單細(xì)胞懸液（濃度為1×105/mL），接種于96孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，加入含不同濃度普伐他汀的RPMI-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24、48、72 h收集細(xì)胞，上機(jī)測(cè)定OD值（代表細(xì)胞存活率）。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組（培養(yǎng)基調(diào)零）、細(xì)胞對(duì)照組（未經(jīng)普伐他汀處理）、含5、15、25 μmol/L普伐他汀的處理組，每組設(shè)6個(gè)平行孔，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。收集細(xì)胞前預(yù)先加入MTT液，培養(yǎng)4 h后于波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定OD值并計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率： 生長(zhǎng)抑制率%=（細(xì)胞組OD值-處理組OD值）/（細(xì)胞組OD值-空白組OD值）×100%。

1.3.2 光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 SW1990細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，貼壁后，加入0、5、15、25 μmol/L普伐他汀，繼續(xù)生長(zhǎng)48 h，培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并隨機(jī)拍照。

1.3.3 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后，加入0、5、15、25 μmol/L的普伐他汀處理48h后收獲細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行DNA分析并計(jì)算凋亡率。

1.3.4 MTT比色法檢測(cè)普伐他汀聯(lián)合吉西他濱對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的影響 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW1990細(xì)胞接種于96孔板上，細(xì)胞貼壁后加入含不同組別、不同濃度藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞后上機(jī)測(cè)定OD值并計(jì)算不同組別細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組、細(xì)胞對(duì)照組、濃度為0.1、0.5、2 μg/mL單藥吉西他濱組、濃度為5、15、25 μmol/L普伐他汀分別聯(lián)合0.1、0.5、2 μg/mL吉西他濱組。

通過(guò)iobolanalysis分析按公式CI值=普伐他汀1/普伐他汀2+吉西他濱1/吉西他濱2計(jì)算兩藥聯(lián)合的相互作用指數(shù)（combination index，CI）。其中，普伐他汀1、吉西他濱1為兩藥聯(lián)合達(dá)到某一生長(zhǎng)抑制率時(shí)各自的濃度，普伐他汀2、吉西他濱2為兩藥單獨(dú)應(yīng)用達(dá)到相同生長(zhǎng)抑制率時(shí)的各自的濃度。CI值<1.0表明兩藥聯(lián)合具有協(xié)同作用；CI值=1.0表明兩藥聯(lián)合具有相加作用或無(wú)關(guān)作用；CI值>1.0表明兩藥聯(lián)合具有拮抗作用。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1普伐他汀對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的影響

MTT法結(jié)果顯示，5、15、25 μmol/L普伐他汀處理細(xì)胞24～72 h后，各處理組OD值逐漸下降，呈現(xiàn)明顯的劑量和時(shí)間依賴性（表1）。方差分析結(jié)果顯示同一作用時(shí)間，各組OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（24 h 組別：F=99.905，P<0.05；48 h 組別：F=274.000，P<0.05；72 h 組別：F=316.670，P<0.05）。

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

對(duì)照組細(xì)胞呈扁長(zhǎng)形，形態(tài)規(guī)則、連接緊密。細(xì)胞經(jīng)不同濃度普伐他汀處理48 h后，出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)改變：細(xì)胞皺縮變形，有的胞質(zhì)中可見(jiàn)中空的空泡，細(xì)胞破裂增多，在細(xì)胞周圍可見(jiàn)大量裂解片段，細(xì)胞之間空隙增加，見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度普伐他汀作用SW1990細(xì)胞48 h（10×10）

2.3普伐他汀對(duì)SW1990細(xì)胞凋亡的影響

如圖2所示：SW1990細(xì)胞經(jīng)5、15、25 μmol/L普伐他汀處理48 h后，流式細(xì)胞儀測(cè)得的細(xì)胞凋亡率隨處理濃度增加逐漸升高。

2.4 普伐他汀聯(lián)合吉西他濱對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的影響

MTT比色法分析了普伐他汀聯(lián)合吉西他濱對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的作用，如表2所示，0.1、0.5、2 μg/mL吉西他濱作用細(xì)胞后，OD值顯著低于細(xì)胞對(duì)照組（F=851.059，P<0.05）。5、15、25 μmol/L普伐他汀分別配伍聯(lián)合0.1、0.5、2 μg/mL吉西他濱，不同濃度普伐他汀聯(lián)合某一濃度吉西他濱后，聯(lián)合組OD值顯著低于該濃度單藥吉西他濱組0.1、0.5、2 μg/mL吉西他濱組別（F值分別為93.543、124.774、14.060，P均<0.05）。

根據(jù)公式計(jì)算出普伐他汀聯(lián)合吉西他濱作用SW1990細(xì)胞后的生長(zhǎng)抑制率并繪制成抑制率曲線（圖3）。從抑制率曲線中可以看出聯(lián)合5、15、25 μmol/L普伐他汀可顯著降低吉西他濱的IC50值，且隨著普伐他汀濃度增加，吉西他濱的IC50值降低愈明顯。根據(jù)CI值公式，我們計(jì)算了普伐他汀聯(lián)合吉西他濱達(dá)到細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為50%時(shí)的CI值，發(fā)現(xiàn)普伐他汀聯(lián)合吉西他濱的CI值均<1，說(shuō)明普伐他汀和吉西他濱可協(xié)同抑制SW1990細(xì)胞增殖。

3 討論

HMG-CoA還原酶是內(nèi)源性膽固醇合成的限速酶。他汀類藥物包括辛伐他汀、美伐他汀、普伐他汀等，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制HMG-CoA還原酶的活性阻滯甲羥戊酸（mevalonic acid，MVA）通路，減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇的合成，并能增加血清膽固醇的清除，從而起到降低膽固醇的作用。膽固醇合成過(guò)程中的中間產(chǎn)物MVA是體內(nèi)許多生物活性物質(zhì)的前體，如泛醌、血紅素A、異戊烯腺嘌呤、焦磷酸法呢酯（FPP）、焦磷酸牻牛兒基牻牛兒酯（GGPP）等[5]。他汀類藥物可通過(guò)阻礙MVA途徑從而抑制其一系列下游產(chǎn)物的合成，進(jìn)而影響細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡及細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)，發(fā)揮調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用[6-8]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和研究的不斷深入，他汀類藥物的抗腫瘤作用日益受到重視。近年來(lái)一系列的研究表明，他汀類藥物對(duì)前列腺癌[9]、肺癌[10]、乳腺癌[11，12]、結(jié)直腸癌[13]、惡性膠質(zhì)瘤[14]、頭頸部腫瘤[15]等多種腫瘤細(xì)胞具有明確的抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT法觀察普伐他汀對(duì)胰腺癌細(xì)胞SW1990的影響，發(fā)現(xiàn)普伐他汀可明顯抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。如表1所示，不同濃度普伐他汀作用SW1990細(xì)胞24～72 h后，抑制率由14.47%增至65.37%。光學(xué)顯微鏡下，我們可以看到普伐他汀作用細(xì)胞后的凋亡形態(tài)學(xué)改變，DNA凝膠電泳則顯示藥物組出現(xiàn)階梯狀排列的DAN梯帶，說(shuō)明普伐他汀可誘導(dǎo)SW1990細(xì)胞發(fā)生凋亡。在聯(lián)合用藥的實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)計(jì)算普伐他汀聯(lián)合吉西他濱的CI值均小于1，證實(shí)普伐他汀可增強(qiáng)吉西他濱的抑瘤作用，二者聯(lián)合具有協(xié)同作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在臨床應(yīng)用吉西他濱單藥或含有吉西他濱的聯(lián)合化療方案治療胰腺癌，同時(shí)加用普伐他汀，可能起到增加化療藥物敏感性、減少化療藥物劑量的作用，進(jìn)而提高進(jìn)展期或晚期胰腺癌患者的化療耐受性，改善生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期。

近年來(lái)越來(lái)越多的體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)他汀類藥物具有抗腫瘤作用，但確切的分子機(jī)制尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為臨床治療胰腺癌提供了一些有益的借鑒，關(guān)于普伐他汀抗胰腺癌細(xì)胞及增敏吉西他濱的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。

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（收稿日期：2016-04-27）