吳新海+趙中保+莫麗賢

【摘要】 目的 探討右美托咪定（Dex）混合氯胺酮對(duì)新生大鼠離體海馬細(xì)胞凋亡的影響。方法 SD新生大鼠（出生7 d）海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)6 d， 采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（C組）， 100 μmol/L氯胺酮組（K組）， 10 μg/ml Dex組（D組）， 10 μg/ml Dex 混合100 μmol/L氯胺酮組（DK組）， 各6只。孵育24 h后采用免疫組化法檢測(cè)Caspase-3蛋白的表達(dá)， 雙染法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡。結(jié)果 與C組比較， K組的海馬細(xì)胞凋亡率和Caspase-3表達(dá)水平升高（P<0.05）；與C組比較， D組海馬細(xì)胞凋亡率和Caspase-3表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與K組比較， DK組和D組的海馬細(xì)胞凋亡率和Caspase-3表達(dá)水平降低（P<0.05）。結(jié)論 Dex能減輕氯胺酮誘導(dǎo)的新生大鼠離體海馬細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】 右美托咪定；氯胺酮；海馬細(xì)胞；凋亡

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.14.210

Influence by dexmedetomidine mixed with ketamine on isolated hippocampus cells apoptosis from infant rats WU Xin-hai， ZHAO Zhong-bao， MO Li-xian. Department of Anesthesiology， Beijing University Shenzhen Hospital， Shenzhen 518036， China

【Abstract】 Objective To investigate influence by dexmedetomidine （Dex） mixed with ketamine on isolated hippocampus cells apoptosis from infant rats. Methods Hippocampal neuron from SD infant rats （7 d after birth） were taken for 6-d culture in vitro， and they were randomly divided into control group （group C）， 100 μmol/L ketamine group （group K）， 10 μg/ml Dex group （group D）， and 10 μg/ml Dex mixed with 100 μmol/L ketamine group （group DK）， with 6 rats in each group. After 24 h of incubation， immunohistochemistry method was applied to detect expression of Caspase-3 protein， and double-staining method was used to detect neuronal apoptosis. Results Comparing with group C， group K and increased hippocampus cells apoptosis rate and Caspase-3 expression level （P<0.05）， and group D had no statistically significant difference of hippocampus cells apoptosis rate and Caspase-3 expression level （P>0.05）. Comparing with group K， groups KD and D had reduced hippocampus cells apoptosis rates and Caspase-3 expression levels （P<0.05）. Conclusion Dex can relieve ketamine-induced isolated hippocampus cells apoptosis from infant rats.

【Key words】 Dexmedetomidine； Ketamine； Hippocampus cells； Apoptosis

氯胺酮可改變發(fā)育中大鼠海馬神經(jīng)元N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDA）的表達(dá)及谷氨酸的活化， 誘導(dǎo)海馬細(xì)胞變性和遠(yuǎn)期認(rèn)知功能的障礙[1， 2]。高選擇性的α2 受體激動(dòng)劑Dex是高選擇性α2腎上腺素受體， 作用于中樞神經(jīng)與周圍神經(jīng)系統(tǒng)及其他器官組織的α2腎上腺素受體， 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)Dex具有神經(jīng)保護(hù)作用， 能減輕異氟烷導(dǎo)致的新生大鼠海馬細(xì)胞凋亡[3， 4]；而Dex與氯胺酮合用對(duì)新生大鼠海馬細(xì)胞凋亡的影響尚不清楚?，F(xiàn)將本院研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 實(shí)驗(yàn)材料：清潔級(jí)出生7 d的雄性SD大鼠（北京大學(xué)深圳醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）， 體重10～16 g。鹽酸氯胺酮（上海制藥一廠）， Dex（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）， DMEM/F-12（Sigma）， B27（Gibi-co）， 胎牛血清（杭州四季青）， Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）， Caspase-3免疫組化試劑盒（江蘇海門碧云天技術(shù)研究所）， 激活型caspase-3單克隆抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）， β-actin單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）。實(shí)驗(yàn)用儀器：CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱， 流式細(xì)胞儀（BD公司）， 倒置相差顯微鏡（日本Olympus）， 高速低溫離心機(jī)。

1. 2 方法

1. 2. 1 海馬神經(jīng)元培養(yǎng) 取新生7 d內(nèi)的SD大鼠在無(wú)菌環(huán)境中， 剪開皮膚和顱骨， 取腦組織置預(yù)冷D-Hank S液的培養(yǎng)皿中， 在顯微鏡下取海馬。將海馬移至另一預(yù)冷HBSS液的培養(yǎng)皿中剪碎， 將海馬移至另一預(yù)冷HBSS液的培養(yǎng)皿中剪碎， 加入胰蛋白酶， 加入等量HBSS液， 置37℃ 、5% CO2 培養(yǎng)箱消化15 min。用含10% 胎牛血清的DMEM/F12終止反應(yīng)， 吹散為單細(xì)胞懸液， 靜置后取上清液， 約1000 r/min離心5 min， 棄上清細(xì)胞計(jì)數(shù)后， 用含2% B27、EGF、bFGF培養(yǎng)基稀釋使細(xì)胞數(shù)為5×105個(gè)/ml， 以100 μl接種于96孔培養(yǎng)板中， 37℃ 、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 24 h后全量換液， 48 h后加入終濃度為10 μmol/L阿糖胞苷作用24 h更換新培養(yǎng)液， 以后每2天半量換液， 培養(yǎng)6 d用于實(shí)驗(yàn)。

1. 2. 2 實(shí)驗(yàn)分組 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的新生大鼠海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為對(duì)照組（C組）；100 μmol/L氯胺酮組（K組）；10 μg/ml Dex組（D組）；10 μg/ml Dex 混合100 μmol/L氯胺酮組（DK組）。每組設(shè)6個(gè)平行樣。將各組細(xì)胞置于37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

1. 2. 3 海馬細(xì)胞凋亡率的流式細(xì)胞儀檢測(cè) 培養(yǎng)的海馬細(xì)胞收集到10 ml的離心管中， 每樣本細(xì)胞數(shù)為5×106， 1000 r/min離心5 min棄培養(yǎng)液。PBS洗1次， 1000 r/min離心5 min。用5 μl的Annexin V重懸細(xì)胞， 室溫下避光孵育15 min， 1000 r/min離心5 min沉淀細(xì)胞， PBS液洗1次， 加入5 μl的PI 4℃下孵育20 min， 避光并不時(shí)震蕩。上流式細(xì)胞儀檢測(cè)海馬細(xì)胞凋亡率。

1. 2. 4 海馬細(xì)胞caspase-3陽(yáng)性表達(dá)的檢測(cè) 6孔培養(yǎng)板中的細(xì)胞接種于蓋玻片， 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法固定， 參照說(shuō)明書操作， 細(xì)胞核著深褐色即為陽(yáng)性細(xì)胞， 光鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野， 計(jì)算平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)反映caspase-3蛋白的表達(dá)水平。

1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

與C組比較， K組的海馬細(xì)胞凋亡率和caspase-3蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）；與C組比較， D組海馬細(xì)胞凋亡率和caspase-3蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與K組比較， DK組和D組的海馬細(xì)胞凋亡率和caspase-3蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05）。見(jiàn)表1。

3 討論

NMDA受體參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程的調(diào)控， 調(diào)節(jié)興奮性突觸傳遞和發(fā)育過(guò)程中突觸可塑性， 與神經(jīng)元生長(zhǎng)、分化、遷移和功能修飾密切相關(guān)， 并參與學(xué)習(xí)記憶的形成[5， 6]。NMDA受體拮抗劑氯胺酮， 可以阻斷神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸和NMDA受體的結(jié)合， 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)大量使用氯胺酮可導(dǎo)致新生大鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能的異常[7]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)， 氯胺酮可使體外培養(yǎng)的新生大鼠海馬細(xì)胞的凋亡率增加以及caspase-3蛋白表達(dá)增加；caspase-3是所有細(xì)胞凋亡途徑的最后效應(yīng)子， 哺乳動(dòng)物神經(jīng)元的凋亡可高表達(dá)caspase-3 ， 因此檢測(cè)caspase-3的表達(dá)可反映神經(jīng)元凋亡程度。

Dex作用于中樞神經(jīng)與周圍神經(jīng)系統(tǒng)及其他器官組織的α2腎上腺素受體， 具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抑制交感神經(jīng)活性的效應(yīng)， 常用作臨床麻醉輔助用藥[1， 2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)Dex具有神經(jīng)保護(hù)作用， 不僅能減輕缺血性大鼠腦細(xì)胞損傷[3]， 還能減輕異氟烷導(dǎo)致的新生大鼠海馬細(xì)胞凋亡[4]。前期研究也發(fā)現(xiàn)Dex證實(shí)減輕七氟烷誘導(dǎo)的新生大鼠遠(yuǎn)期認(rèn)知功能的障礙[8]。在本研究中， 發(fā)現(xiàn)Dex不影響新生大鼠離體培養(yǎng)的海馬細(xì)胞的凋亡， 但是混合氯胺酮能減輕其誘導(dǎo)的新生大鼠離體海馬細(xì)胞的凋亡。Dex對(duì)于吸入麻醉劑和氯胺酮誘發(fā)的發(fā)育中大鼠腦細(xì)胞損傷的保護(hù)作用的機(jī)制尚不清楚， 有研究認(rèn)為Dex神經(jīng)保護(hù)機(jī)制可能通過(guò)降低循環(huán)中及腦細(xì)胞外的兒茶酚胺濃度、抑制鈣離子內(nèi)流和興奮性氨基酸的釋放、激活A(yù)kt或ERK等細(xì)胞生存信號(hào)通道， 調(diào)節(jié)凋亡和抗凋亡蛋白之間的平衡[9]。

參考文獻(xiàn)

[1]Sinner B， Friedrich O， Lindner R， et al. Long-term NMDA receptor inhibition affects NMDA receptor expression and alters glutamatergic activity in developing rat hippocampal neurons. Toxicology， 2015， 333：147-155.

[2]Yan J， Huang Y， Lu Y， et al. Repeated administration of ketamine can induce hippocampal neurodegeneration and long-termcognitive impairment via the ROS/HIF-1α pathway in developing rats. Cell Physiol Biochem， 2014， 33（6）：1715-1732.

[3]Hoffman WE， Kochs E， Werner C， et al. Dexmedetomidine improves neurologic outcome from incomplete ischemia in the rat. Reversal by the alpha 2-adrenergic antagonist atipamezole. Anesthesiology， 1991， 75（2）：328-332.

[4]Sanders RD， Xu J， Shu Y， et al. Dexmedetomidine attenuates isoflurane-induced neurocognitive impairment in neonatal rats. Anesthesiology， 2009， 110（5）：1077-1085.

[5]Fredriksson A， Archer T， Alm H， et al. Neurofunctional deficits and potentiated apoptosis by neonatal NMDA antagonist administration. Behav Brain Res， 2004， 153（2）：367-376.

[6]Behar TN， Scott CA， Greene CL， et al. Glutamate acting at NMDA receptors stimulates embryonic cortical neuronal migration. J Neurosci， 1999， 19（11）：4449-4461.

[7]Green CR， Kobus SM， Ji Y， et al. Chronic prenatal ethanol exposure increases apoptosis in the hippocampus of the term fetal guinea pig. Neurotoxicol Teratol， 2005， 27（6）：871-881.

[8]吳新海， 鄧若熹， 張燕. 右美托咪定減輕七氟醚誘導(dǎo)的新生大鼠海馬細(xì)胞凋亡和遠(yuǎn)期認(rèn)知障礙. 國(guó)際麻醉學(xué)與復(fù)蘇雜志， 2015， 36（9）：782-786.

[9]Zhu YM， Wang CC， Chen L， et al. Both PI3K/Akt and ERK1/2 pathways participate in the protection by dexmedetomidine against transient focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats. Brain Res， 2013， 1494（4）：1-8.

[收稿日期：2016-01-21]