子癇前期患者子宮蛻膜自然殺傷細(xì)胞的表型研究

姜妮娜

(青島市膠州中心醫(yī)院, 山東 青島 266300)

【摘要】目的觀察先兆子癇患者子宮蛻膜自然殺傷細(xì)胞(dNK細(xì)胞)的表型。方法選取2012年12月至2013年5月在我院產(chǎn)科住院的30例子癇前期患者作為病例組，隨機(jī)選取同期在我院產(chǎn)前檢查正常的晚期妊娠婦女30例作為正常對照組。收集孕晚期子宮蛻膜組織，機(jī)械研磨加梯度離心法提取蛻膜內(nèi)單核細(xì)胞，流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)篩選出dNK細(xì)胞，并檢測dNK細(xì)胞表面CD56及CD16的表達(dá)情況。結(jié)果病例組與正常對照組CD56bright CD16- CD3- dNK細(xì)胞的數(shù)量均明顯多于CD56dim CD16+ CD3- dNK細(xì)胞(P<0.05)，病例組與正常對照CD56bright CD16- CD3- dNK細(xì)胞所占比例無顯著差異(P>0.05)，CD56dim CD16+ CD3- dNK 細(xì)胞所占比例也無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論先兆子癇患者與正常孕婦孕晚期子宮蛻膜內(nèi)dNK細(xì)胞表型沒有明顯不同，均以CD56bright CD16- CD3-亞型為主。

【關(guān)鍵詞】子癇前期； 子宮蛻膜； 自然殺傷細(xì)胞； 細(xì)胞表型； 母-胎界面

【中圖分類號】R 714.24+5【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

收稿日期：( 2014-02-10； 編輯： 張文秀)

Study on phenotype of decidual NK cells in preeclampsia patientsJIANG Nina

(DepartmentofObstetrics,JiaozhouCentralHospitalofQingdao,Qingdao266300,Shandong,China)

Abstract【】ObjectiveTo investigate the phenotype of uterine decidual natural killer cells(dNK cells) in preeclampsia patients. Methods30 women with preeclampsia were selected as case group. 30 normal pregnant women were selected as normal control group. The decidual tissues were sampled immediately after caesarean section. The mononuclear cells were extracted from the tissues by means of mechanic grinding and gradient centrifugation. The technique of flow cytometry was used for dNK cell sorting and the expression of CD56 and CD16 on the surface of cells was also examined. ResultsIn case group and normal control group, the proportions of CD56bright CD16- CD3- dNK cells were significantly higher than those of CD56dim CD16+ CD3- dNK cells(P<0.05). Neither the CD56bright CD16- CD3- subtype nor the CD56dim CD16+CD3- subtype had statistical difference between case group and normal control group(P>0.05). ConclusionThe phenotypes of dNK cells from the women with preeclampsia and from healthy pregnant women are both dominated by CD56bright CD16- CD3- subtype, without significant difference.

【Key words】Preeclampsia; Uterine decidua; Natural killer cells; Cell phenotype; Maternal-feta linter face

子癇前期是孕婦妊娠期特有的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。在我國人群中發(fā)病率高達(dá)9.4%，直接影響母兒結(jié)局，危害母嬰健康，但其發(fā)病原因和機(jī)制尚不清晰。研究表明，該病的發(fā)生與母體免疫系統(tǒng)功能混亂有關(guān)[1-2]。母-胎界面的局部免疫微環(huán)境在妊娠的發(fā)生和維持以及臨產(chǎn)的發(fā)動中發(fā)揮重要作用。子宮蛻膜自然殺傷細(xì)胞(decidual natural killer cells, dNK cells)是母-胎界面最主要的免疫細(xì)胞[3]，在局部發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用，主要包括兩種表型：CD56brightCD16-CD3-和CD56dimCD16+CD3-，兩者的平衡是正常妊娠的重要因素，已知正常妊娠者體內(nèi)的dNK細(xì)胞以CD56brightCD16-CD3-亞型為主[4]。子癇前期患者的蛻膜局部免疫微環(huán)境變化可能導(dǎo)致免疫耐受失衡而影響妊娠，Wilczynski等[5]稱子癇前期患者dNK表型存在變化，CD56dimCD16+CD3-亞型增加，而周等[6]稱dNK細(xì)胞表型并未改變。顧及到母-胎界面在妊娠中各種因素，本研究主要對子癇前期患者孕晚期子宮蛻膜內(nèi)dNK細(xì)胞進(jìn)行了表型研究。

1資料與方法

1.1臨床資料選擇2012年12月至2013年5月在我院住院的子癇前期患者30例作為病例組，所有患者無其他妊娠合并癥及并發(fā)癥，隨機(jī)選取同期在我院產(chǎn)前檢查正常的晚期妊娠婦女30例作為正常對照組。兩組孕婦無血緣關(guān)系，平均年齡、孕周、孕產(chǎn)次均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。所有受試者既往沒有高血壓及肝臟疾病史，沒有糖尿病等其他免疫性疾病史，沒有腎臟疾病、器官移植、免疫治療及輸血史，沒有傳染病病史，月經(jīng)規(guī)則，末次月經(jīng)清楚。正常晚期妊娠及子癇前期的診斷參照第7版《婦產(chǎn)科學(xué)》[7]。

1.2主要試劑、儀器RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone公司，人淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)和雙抗(青霉素、鏈霉素)購自上海華精生物有限公司，熒光素標(biāo)記的小鼠抗人單克隆抗體( CD3-PE-Cy5、CD16-FITC和CD56-PE) 購自BD Pharmigen 公司，小鼠IgG1- PE- Cy5、IgG1-FITC和IgG1- PE購自R&D 公司，苔盼藍(lán)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，流式細(xì)胞檢測儀為BD FACE Calibur公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集和單細(xì)胞懸液制備在知情同意的情況下，所有研究對象施行剖宮產(chǎn)手術(shù)，胎盤、胎膜娩出后，立即用眼科剪剪取胎盤附著部位宮壁的蛻膜組織約5 g，用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)沖洗所取蛻膜組織，以洗去組織中的血液、胎糞、胎脂等物質(zhì)，然后將其置于盛有RPMI-1640完全培養(yǎng)液(含胎牛血清10%、青霉素100 U/L和鏈霉素100 mg/L)的平皿中，用眼科剪反復(fù)剪碎至直徑1 mm 左右，用研磨棒輕輕研磨，放在200目不銹鋼網(wǎng)上過濾，收集細(xì)胞懸液。將Ficoll 平鋪于15 mL無菌離心管中，再將收集的細(xì)胞懸液按照1:1的比例平鋪于Ficoll上(形成清楚的分界面)，4℃、2000 r/min離心15 min，然后吸取中間的云霧樣絮狀物層并置于另一支無菌離心管中。PBS洗滌2次(4℃、1500 r/min離心5 min)，最后1次離心棄上清后，加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液輕輕吹打混合均勻，調(diào)整細(xì)胞濃度約為1×108/L，即得單細(xì)胞懸液。取少許細(xì)胞懸液，苔盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞活力> 90%。

1.3.2dNK細(xì)胞表型檢測每份標(biāo)本取2管蛻膜單細(xì)胞懸液各100 μL，分別標(biāo)記為1號和2號，1號管中均加入單克隆抗體小鼠抗人CD3-PE-Cy5、CD16-FITC和CD56-PE各15 μL，2號管中均加入小鼠IgG1- PE- Cy5、IgG1-FITC和IgG1- PE各15 μL作為同型對照，充分混勻，4℃避光孵育30 min，1500 r/min 離心5 min，棄上清，PBS洗滌2次，每管內(nèi)加入200 μL PBS重懸細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2結(jié)果

經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)分選，熒光抗體標(biāo)記CD56表達(dá)陽性、CD3表達(dá)陰性(CD56+CD3-)的細(xì)胞為dNK細(xì)胞。根據(jù)dNK細(xì)胞表面CD56表達(dá)水平的高低及是否表達(dá)CD16，將其分為CD56brightCD16-CD3-dNK細(xì)胞和CD56dimCD16+CD3-dNK細(xì)胞。

2.1病例組和正常對照組中dNK細(xì)胞亞群的分布及比較病例組中子癇前期患者dNK細(xì)胞以CD56brightCD16-CD3-亞型為主，其數(shù)量明顯多于CD56dimCD16+CD3-亞型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；正常對照組中dNK細(xì)胞也以CD56brightCD16-CD3-亞型為主，其數(shù)量明顯多于CD56dimCD16+CD3-亞型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

Tab.1The comparison of CD56brightCD16-CD3-dNK cells and CD56dimCD16+CD3-dNK cells

組別dNK細(xì)胞亞型CD56brightCD16-CD3-CD56dimCD16+CD3-P病例組43.7±17.48.9±6.30.000正常對照組48.3±15.99.3±5.80.000

2.2病例組與正常對照組之間dNK細(xì)胞各亞型的比較分別對病例組與對照組之間的CD56brightCD16-CD3-dNK細(xì)胞和CD56dim CD16+ CD3- dNK細(xì)胞進(jìn)行比較，兩者之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

Tab.2The comparison of dNK cell subtypes

dNK細(xì)胞免疫表型組別病例組正常對照組PCD56brightCD16-CD3-43.7±17.448.3±15.90.290CD56dimCD16+CD3-8.9±6.39.3±5.80.799

3討論

從免疫學(xué)角度看，妊娠這種特殊的生理現(xiàn)象類似于器官移植，但在正常情況下，胚胎作為半同種異體移植物卻不被母體子宮排斥，與復(fù)雜而精細(xì)的免疫學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制密切相關(guān)，尤其是子宮局部免疫微環(huán)境的調(diào)控。子宮蛻膜是最直接與胚胎接觸的母體組織，即母-胎界面。子宮蛻膜組織中含一定量的免疫細(xì)胞，如自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、少量T細(xì)胞和B細(xì)胞等，其中NK細(xì)胞的數(shù)量最多，其比例隨著妊娠的發(fā)展而改變，在早期妊娠中約占蛻膜淋巴細(xì)胞的50%～90%，晚期妊娠時約占30%～40%[8]，在妊娠期間發(fā)揮重要的免疫學(xué)作用[9]。NK細(xì)胞具有自然殺傷作用，屬于非特異性免疫，以非MHC (主要組織相容性復(fù)合體) 限制形式殺傷各種靶細(xì)胞。研究報道，在孕期激素作用下，出現(xiàn)大量dNK細(xì)胞[10]。CD56brightCD16-CD3-dNK細(xì)胞 和CD56dimCD16+CD3-dNK細(xì)胞在基因表達(dá)及功能上也存在很大差異。CD56brightCD16-CD3-dNK細(xì)胞是分泌型細(xì)胞，一方面通過產(chǎn)生各種細(xì)胞因子和血管源性分子等生物活性物質(zhì)參與妊娠的免疫耐受[11]、子宮螺旋動脈的構(gòu)建[12]以及絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(EVT)的浸潤及胎盤的發(fā)育形成[13]，另一方面通過細(xì)胞表面表達(dá)抑制受體，傳遞抑制信號，抑制NK細(xì)胞的激活，保護(hù)胚胎免受母體免疫系統(tǒng)的排斥，進(jìn)而利于妊娠的發(fā)生和維持[14]。CD56dimCD16+CD3-dNK細(xì)胞內(nèi)含有大量的穿孔素、顆粒酶等殺傷性物質(zhì)，主要發(fā)揮細(xì)胞毒性殺傷作用，通過直接釋放預(yù)存的殺傷性物質(zhì)或通過抗體依賴性細(xì)胞毒性作用(ADCC)來殺傷靶細(xì)胞[15]。正常妊娠與dNK細(xì)胞的免疫抑制作用有關(guān)，以對胚胎的營養(yǎng)作用為主，在保證胚胎生長發(fā)育中具有重要作用[16]。不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)、胚胎停止發(fā)育等妊娠早期并發(fā)癥與子宮蛻膜NK細(xì)胞表型和功能密切相關(guān)，一些產(chǎn)科常見的妊娠晚期并發(fā)癥如子癇前期、子癇、胎兒生長受限等，可能也與免疫異常有關(guān)[17]。本研究從子癇前期患者母-胎界面免疫出發(fā)，為從免疫學(xué)角度研究子癇前期的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

子癇前期的發(fā)病機(jī)制尚未明確。關(guān)于病理性妊娠的大量研究表明，子宮局部免疫微環(huán)境的異常是導(dǎo)致妊娠失敗的主要原因之一[18]，明確此處的微循環(huán)特點(diǎn)對認(rèn)識疾病的發(fā)生機(jī)制及預(yù)防治療有著重要的意義。本實(shí)驗(yàn)在對母-胎界面dNK細(xì)胞進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，子癇前期患者孕晚期dNK細(xì)胞的表型沒有發(fā)生明顯改變，與正常妊娠晚期一樣，以具有免疫抑制作用的亞群CD56brightCD16-CD3-dNK細(xì)胞為主，子癇前期患者與正常孕婦CD56brightCD16-CD3-dNK細(xì)胞和CD56dimCD16+CD3-dNK細(xì)胞所占比例均無明顯差異，這與周[19]等的報道相一致。但是，即使是同一表型的細(xì)胞，在功能上也不一定完全一致。dNK細(xì)胞表面表達(dá)殺傷細(xì)胞活化性受體(killer activating receptors, KARs)和殺傷細(xì)胞抑制性受體(killer inhibiting receptors, KIRs)兩種受體，其與相應(yīng)配體相互作用后，通過上調(diào)/下調(diào)dNK細(xì)胞的功能，從而產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。Hanna等[20]報道活化的dNK細(xì)胞能通過分泌NK細(xì)胞來源的生長因子和化學(xué)因子促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤、蛻膜血管形成從而防止子癇前期的發(fā)生，而Hiby等[21]認(rèn)為抑制dNK細(xì)胞可能增加子癇前期患病風(fēng)險。除此之外，dNK細(xì)胞本身的反應(yīng)性也會影響其生物學(xué)效應(yīng)。故我們推測子癇前期的發(fā)生可能是由CD56brightCD16-CD3-dNK細(xì)胞功能異常引起，有必要對dNK細(xì)胞功能進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。

4結(jié)論

妊娠是一個極其復(fù)雜的生理過程，dNK細(xì)胞與正常妊娠的維持密切相關(guān)，在母-胎界面免疫耐受過程中發(fā)揮重要作用，子癇前期患者與正常孕婦妊娠晚期dNK細(xì)胞的表型都是以CD56brightCD16-CD3-亞型為主，推測可能dNK細(xì)胞自身功能異常與本病發(fā)生有關(guān)。

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