欒海蓉，孫　健，王得利，吳　紅，董　琦

M3受體激動劑對慢性心衰大鼠心肌ICa－L及［Ca2＋］i的影響

欒海蓉，孫健，王得利，吳紅，董琦

摘要目的研究M3受體激動劑膽堿（choline）對慢性心力衰竭（CHF）大鼠心肌的保護作用及可能的機制。方法CHF大鼠Ⅱ型膠原酶消化分離單個心肌細胞，全細胞膜片鉗技術(shù)記錄L-型鈣電流（ICa－L）變化；激光掃描共聚焦技術(shù)觀測細胞內(nèi)鈣（［Ca2＋］i）變化。結(jié)果膜片鉗實驗結(jié)果顯示，與CHF組比較，choline組ICa－L電流密度明顯增高（n＝6，P＜0．01）；預(yù)敷U73122后加入choline，與choline組比較，ICa－L電流密度明顯下降（n＝6，P＜0．01）。共聚焦實驗結(jié)果顯示，與CHF組比較，choline組［Ca2＋］i明顯升高（n＝80，P ＜0．01）；與choline組比較，U73122與choline共同孵育組［Ca2＋］i升高幅度不明顯（n＝80，P＜0．01）。預(yù)先給予4-DAMP可部分逆轉(zhuǎn)choline升高ICa－L及［Ca2＋］i的作用。結(jié)論M3受體對CHF大鼠的心肌保護作用可能是通過Gq／11-PLC途徑開放L-型鈣通道，促進Ca2＋內(nèi)流，使［Ca2＋］i增加。

關(guān)鍵詞膽堿；U73122；4-DAMP；L-型鈣電流；膜片鉗；激光掃描共聚焦

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是由于慢性心臟病變或血流動力學(xué)負荷過重，引起心肌損傷，導(dǎo)致心室泵血或充盈功能低下的心肌疾?。?］。細胞L-型鈣通道功能異常是導(dǎo)致心衰因素之一［2］，即造成肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2＋減少，興奮－收縮耦聯(lián)過程中所需要的Ca2＋減少，心肌收縮力降低，最終導(dǎo)致心力衰竭。心臟M3受體通過介導(dǎo)鉀電流（IKM3），改善細胞間電信號傳導(dǎo)，對抗心肌缺血、減少細胞凋亡、改善心臟功能，在眾多心臟疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。研究［3－5］顯示，病理狀態(tài)下，心肌M3受體功能性表達明顯增加，激動M3受體可能具有抗CHF作用。該實驗運用膜片鉗和激光掃描共聚焦方法探討M3受體激動劑膽堿（choline）對CHF大鼠心肌L-型鈣電流（ICa－L）及細胞內(nèi)鈣（［Ca2＋］i）的影響及可能的機制。

1　材料與方法

1．1實驗動物

清潔級Wistar大鼠，雄性，體重250～300 g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院提供，于屏障環(huán)境中進行飼養(yǎng)和實驗。

1．2藥品和試劑

U73122、羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、乙二醇四乙酸酯（EGTA）、膠原酶Ⅱ、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、咖啡因、choline和M3受體特異性阻斷劑（4-DAMP）等均購自美國Sigma公司；Fluo-3／AM、F-127購自美國Invitrogen公司；DMSO、臺氏液及KB（Krebs buffer）液試劑等均為國產(chǎn)分析純。

1．3主要儀器

BL-420E生物機能實驗系統(tǒng)購自成都泰盟科技公司；膜片鉗放大器（Axopatch 200B）、膜片鉗數(shù)模轉(zhuǎn)換器（Digidata 1322）購自美國Axon公司；倒置顯微鏡（TE 2000-U）購自日本Nikon公司；三維液壓推進器（MHW-3）購自日本Narishige公司；氣壓減震臺購自美國TMC公司；溫度控制儀（NBD TC2bip）購自美國Cell Micro Controls公司；微電極拉制儀（PP-830）購自日本Narishige公司；FV-300激光掃描共聚焦顯微鏡購自日本Olympus公司。

1．4溶液

臺式液（mmol／L）：NaCl 126，KCl 5．4，MgCl21，CaCl21．8，NaH2PO40．33，葡萄糖10，HEPES 10，用NaOH調(diào)至pH＝7．4。無鈣臺氏液除沒有CaCl2之外，還需加入含2．0 mmol／L EGTA，其

2015－05－14接收

1.5CHF模型的建立［6］

大鼠稱重后腹腔麻醉。進胸腔，在右心室流出道與左心房之間距主動脈根部2～3 mm處，絲線穿過左冠狀動脈主干，連同一小束心肌一起結(jié)扎，以縫線下方心肌色澤變淺、變蒼白，同時心電監(jiān)護肢導(dǎo)R波振幅明顯升高，隨后I、AVL導(dǎo)聯(lián)ST段明顯升高為結(jié)扎成功。術(shù)后8周，行左冠狀動脈結(jié)扎大鼠進行血流動力學(xué)檢測。以左心室舒張末壓≥2 kPa判斷CHF模型構(gòu)建成功。

1.6CHF大鼠心肌細胞急性分離

大鼠麻醉后迅速開胸取出心臟，置于預(yù)冷的4℃臺式液中?？焖儆坞x主動脈并逆行插管連接于Langendorff灌流裝置上。先用正常臺氏液以約8 ml／min的速度連續(xù)灌流約3～5 min，心臟復(fù)跳后洗去心臟內(nèi)殘血。然后換用無鈣臺氏液以12 ml／min速度灌流約20 min至心臟停止搏動后，換用含膠原酶Ⅱ和BSA的無鈣臺氏液繼續(xù)灌流消化膠原組織以獲得單個心肌細胞。當(dāng)心臟變軟、色澤變淺時，開始剪取少量心肌組織，每隔2 min剪取1次。將不同時間剪下的心肌組織置于裝有KB液的試管中，用吸管輕輕吹打，使單個心肌細胞從組織塊上分離下來。去除殘余的大塊組織后置于KB液中放到4℃冰箱穩(wěn)定1 h待用。所有液體使用前，用95%O2＋5%CO2飽和，用于灌流液體的溫度應(yīng)始終控制在（37±0．5）℃。

1．7全細胞膜片鉗電生理記錄［7－8］

應(yīng)用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄單細胞離子電流。將分離好的單細胞置于浴槽中，待貼底壁后，用測鈣外液以5 m l／min恒速灌流沖洗細胞至表面清潔，選擇靜止、桿狀、橫紋清晰、折光性良好的單個心肌細胞進行封接實驗。微電極充灌電極液后接觸細胞并給于負壓使電極尖端和細胞膜間形成高阻封接（＞10 GΩ）后用脈沖式負壓抽吸破膜，形成全細胞構(gòu)型，用電壓鉗模式下進行刺激和記錄。在浴槽中加入相應(yīng)藥品，并記錄給藥3 min后的電流。電極液和細胞外液之間的液接電位（10～11 mV）形成全細胞構(gòu)型前歸零。數(shù)據(jù)采集前進行膜電容和串聯(lián)電阻補償，信號輸入經(jīng)過1 000 Hz的濾波，數(shù)據(jù)存于計算機硬盤以便分析。

1．8心肌細胞內(nèi)鈣測定

細胞穩(wěn)定好后，取鏡下觀察多數(shù)為桿狀且橫紋清晰無顆粒的細胞用于實驗，先棄去負載液，用含有100 mg／L BSA的正常臺氏液預(yù)敷，然后放在37℃恒溫箱中用終濃度為10μmol／L Fluo-3／AM染色30 min，離心去除染色液后，用有鈣液稀釋至所需的濃度（10倍物鏡視野中30～40個細胞）后待用。取染好色的細胞置于浴槽中，靜置貼壁5 min后，選取桿狀、橫紋清晰無顆粒的細胞進行實驗。在激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為526 nm，在Time series程序下對細胞XY平面進行掃描，間隔時間為10 s，共掃描30次，于掃描獲得基礎(chǔ)值后于第2次和第3次掃描間隙之間加入30 mmol／L 的KCl。給藥組孵育10 min后加 KCl（30 mmol／L）；對照組細胞直接加KCl（30 mmol／L）。計算細胞XY平面內(nèi)平均熒光強度（Fi），以Fi代表［Ca2＋］i。以Fmax（給藥后最高熒光強度）與F0（給藥前熒光強度）的比值代表［Ca2＋］i的熒光強度變化。

1．9統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1choline和U73122對CHF大鼠心室肌細胞ICa－L的作用比較

在形成全細胞封接狀態(tài)后，將細胞鉗制在－40 mV，以去除鈉電流的影響。測鈣內(nèi)外液均含CsCl，K＋被Cs－所取代，以阻斷鉀電流。命令電位從 －30 mV～＋50 mV，以10 mV為步階，波寬為300 ms，此時可記錄到內(nèi)向鈣電流。choline組（0．5 mmol／L）ICa－L電流密度（－8．06±0．59）pA／pF較CHF組（－4．86±0．57）pA／pF明顯升高（P＜0．01）。給予choline前預(yù)敷M3受體阻斷劑4-DAMP（3 nmol／L），ICa－L電流密度降至（－5．80± 0．65）pA／pF，與choline組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。而給予choline前預(yù)敷 U73122（3 μmol／L），電流密度則降至（－6．33±0．53）pA／pF，與choline組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。各組間峰值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝194．448，P＜0．01）。見圖1。

2.2choline對CHF大鼠心室肌細胞鈣庫的影響

利用激光掃描共聚焦技術(shù)觀察choline對CHF大鼠心肌細胞鈣庫的影響。在無鈣液中，給予choline （0．5 mmol／L）后，鈣 Fmax／F0升至（3．87±0．32）（n ＝70），提示choline能在去除外鈣的條件下引起CHF大鼠心肌細胞內(nèi)鈣庫釋放。

2.3choline和U73122對CHF大鼠心室肌細胞［Ca2＋］i的影響

正常情況下，加入30 mmol／L KCl后，細胞內(nèi)鈣Fmax／F0為（5．13±0．21）。與對照組比較，CHF組鈣Fmax／F0明顯降低至（3．95±0．53），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。與CHF組比較，choline組［Ca2＋］i明顯升高，F(xiàn)max／F0為（6．39± 0．62），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。與choline組比較，U73122與choline共同孵育后，F(xiàn)max／F0降至（3．85±0．56），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。預(yù)先給予4-DAMP可部分逆轉(zhuǎn)choline升高［Ca2＋］i的作用，與choline組比較，F(xiàn)max／F0為（3．88±0．38），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。U73122組與U73122＋choline共同作用組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2。各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝72．813 8，P ＜0．01）。

3　討論

本研究結(jié)果表明，choline能明顯增加CHF大鼠心室肌細胞ICa－L及［Ca2＋］i，M3受體 阻 斷 劑4-DAMP可部分逆轉(zhuǎn)choline的作用，提示激動M3受體可以增加外鈣內(nèi)流，從而升高心肌細胞胞內(nèi)鈣水平。

L-型鈣通道表達下調(diào)所致心肌興奮－收縮耦聯(lián)的異常是導(dǎo)致心衰的原因之一。M3受體為G蛋白偶聯(lián)受體，通過Gq／11激活磷脂酶 C（phospholipase C，PLC），使膜結(jié)合的4，5-二磷酸肌醇水解為1，3，4-三磷酸肌醇（inositol 1，4，5-triphosphate，IP3）和二酰甘油（diacylglycerol，DAG）。IP3和DAG作為細胞內(nèi)第二信使，分別激活I(lǐng)P3／Ca2＋和DAG／蛋白激酶C （protein kinase C，PKC）兩個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而開放鈣離子通道，促進內(nèi)鈣釋放，使細胞內(nèi)鈣增加。本研究顯示，PLC抑制劑U73122可以逆轉(zhuǎn)choline增加ICa－L及升高［Ca2＋］i的作用，提示M3受體可能通過Gq／11-PLC途徑調(diào)控L-型鈣通道，使鈣離子通道開放，細胞［Ca2＋］i增高，肌漿網(wǎng)內(nèi)的Ca2＋容量增多，興奮－收縮耦聯(lián)過程中所需的Ca2＋增加，心肌收縮力增加，從而起到對CHF大鼠的心肌保護作用。

研究［9］顯示，M3受體介導(dǎo)IKM3間接影響細胞內(nèi)Ca2＋，使其內(nèi)流減少，還能直接抑制L-型鈣通道［10］，兩者作用結(jié)果均使得細胞［Ca2＋］i降低。M3受體此作用可以使得心肌收縮力減弱，減少心肌耗氧，降低心律失常發(fā)生率，對缺血性心肌產(chǎn)生保護作用。本研究顯示，M3受體還可以通過Gq／11-PLC途徑開放L-型鈣通道，促進Ca2＋內(nèi)流，使細胞［Ca2＋］i增加，與之前作用結(jié)果相反。M3受體此作用可以增加心肌收縮力，對抗長期缺血低氧所造成的CHF?？梢?，在不同病理狀態(tài)下，M3受體對心?。跜a2＋］i的影響可能不同，發(fā)揮的保護機制也不相同。

本研究結(jié)果與之前研究存在較大差異，原因主要在于：①Gq／11-PLC通路與其他信號傳導(dǎo)通路可能存在交互作用，目前的研究未考慮其它的交互因素，可能是多條通路共同參與調(diào)控的綜合結(jié)果，也可能某種通路起主導(dǎo)作用，掩蓋或抑制了其他通路的作用；②體外實驗不能完全模仿體內(nèi)環(huán)境，體內(nèi)所處的環(huán)境較為復(fù)雜，心衰細胞可能會受到多種因素調(diào)控和影響（如神經(jīng)、體液因素的干擾），而這些因素也能對其進行間接的調(diào)控。

在今后的研究中，需要進一步闡明在各種因素交互作用下，M3受體對CHF細胞的保護作用，Gq／11-PLC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與其他通路之間的對話也是未來研究的重點，闡明其調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和主要交互影響因素。預(yù)期將有針對性地對慢性疾病發(fā)生發(fā)展使用M3受體相關(guān)藥物干預(yù)給于指導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)和驗證新的藥物作用靶點和可能的作用途徑，并為心血管疾病的防治開拓新思路和提供理論依據(jù)。

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中圖分類號R 331．31

文獻標(biāo)志碼A

文章編號1000－1492（2015）10－1422－04

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年基金項目（編號：81300163）；黑龍江省教育廳科研課題（編號：12531731）

作者單位：牡丹江醫(yī)學(xué)院機能學(xué)教研室，牡丹江157011

作者簡介：欒海蓉，女，講師，碩士；孫健，女，講師，博士，責(zé)任作者，E-mail：mdjsunjian＠126．com余成分與臺氏液相同。KB液（mmol／L）：谷氨酸70，牛磺酸15，KCl30，KH2PO410，MgCl20．5，EGTA 0．5，HEPES 10，葡萄糖10，用KOH調(diào)至pH＝7．3～7．4。測鈣外液（mmol／L）：Tris-Cl 136，CsCl 5．4，MgCl2·6H2O 1，CaCl2·H2O 2，NaH2PO 40．33，葡萄糖10，HEPES 10，用Tris-OH調(diào)至pH＝7．4。電極液（mmol／L）：CsCl 20，MgCl2·6H2O 1，MgATP 5，EGTA 10，CsOH 110，天冬氨酸110，用 CsOH調(diào)至pH＝7．2。

Effect of M3R agonist on ICa－Land［Ca2＋］iin myocardium of chronic heart failure rats

Luan Hairong，Sun Jian，Wang Deli，et al
（Dept of Functional Medicine，Mudanjiang Medical College，Mudanjiang157011）

AbstractObjectiveTo investigate the protective effectsof choline on ICa－Land［Ca2＋］iinmyocardium from rats with chronic heart failure．MethodsThe single ventricularmyocytes were isolated by use of collegenase type II，ICa－Lwas recorded by whole-cell patch clamp technique；［Ca2＋］iwas detected by laser scanning confocalmicroscope in ventricularmyocytes．Resu ltsThe normalized peak currents of ICa－Lin ventricularmyocyteswere elevated by choline group compared with those in CHF group，which could be neutralized by U73122 and partly reverted by 4-DAMP．The［Ca2＋］iinduced by KCl in ventricularmyocyteswere significantly increased by choline group，which could be suppressed by U73122 and also partly reverted by 4-DAMP．ConclusionsThe possible mechanism of protection of M3receptor involved in the protection of CHF rats is due to the open L type calcium channel，increased ［Ca2＋］ivia activation of Gq／11-PLC signal passway．

Key wordscholine；U73122；4-DAMP；ICa－L；patch-clamp technique；laser scanning confocalmicroscope