封 瑞，于麗鳳，胡慧媛，郭 鳳，龜山正樹(shù)，郝麗英

L型鈣通道是電壓依賴(lài)型鈣通道，其由4個(gè)亞單位組成，分別為 α1、α2δ、β1－4和 γ，其中 α1亞單位決定了通道的大部分功能［1］。編碼 α1亞單位蛋白的基因分別為 α1S、α1C、α1D和 α1F，對(duì)應(yīng)命名為 Cav1.1、Cav1.2、Cav1.3、Cav1.4。L 型鈣通道廣泛存在于各種細(xì)胞中，特別是心肌和心血管平滑肌細(xì)胞中，心肌L型鈣通道主要為Cav1.2鈣通道。L型鈣通道是細(xì)胞興奮時(shí)外鈣內(nèi)流的最主要途徑，其在許多生理和病理情況下起到非常重要的作用，例如在肌肉收縮、激素或神經(jīng)遞質(zhì)分泌，以及在基因表達(dá)方面都具有關(guān)鍵作用［2］。

近年來(lái)，關(guān)于L型鈣通道功能和結(jié)構(gòu)的研究越來(lái)越深入，研究手段也越來(lái)越多，如應(yīng)用電生理的方法檢測(cè)L型鈣通道電流的變化［3］，采用共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣的變化間接反映L型鈣通道的功能等。除此之外，分子生物學(xué)的方法也得到了廣泛應(yīng)用，例如采用免疫印跡的方法檢測(cè)鈣通道蛋白的表達(dá)情況［4］，免疫共沉淀的方法檢測(cè)鈣通道蛋白與某些特定蛋白的結(jié)合作用情況［5］，以及Pull-down assay的方法檢測(cè)鈣通道片段與某些蛋白的結(jié)合情況［6］。然而，研究者們發(fā)現(xiàn)L型鈣通道蛋白作為細(xì)胞的膜蛋白，在提取和制備方面仍然存在一定困難。利用傳統(tǒng)的提取總蛋白的方法獲得的L型鈣通道蛋白的量較少，且純度不高，在需要增溶的鈣通道蛋白的研究中，提取總蛋白的方法也無(wú)法滿足進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，給深入的實(shí)驗(yàn)研究帶來(lái)了不同程度的困難。小麥胚芽凝集素(wheat germ lectin-agarose，WGA)能與L型鈣通道蛋白上的膜糖蛋白特異性結(jié)合，因此，本研究采用WGA親和層析的方法制備與純化豚鼠心肌Cav1.2鈣通道蛋白，并用免疫印跡的方法對(duì)純化的鈣通道蛋白進(jìn)行鑒定。以期尋找到制備與純化全長(zhǎng)的心肌Cav1.2鈣通道蛋白的方法，為心肌Cav1.2鈣通道蛋白的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 豚鼠，♂♀不限，體質(zhì)量300～400 g，由日本鹿兒島大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要試劑 膠原酶，日本Yakult公司;Protease inhibitor cocktail，Roche Diagnostics GmbH，德國(guó);CHAPS，Sigma 公司;抗Cav1.2抗體，抗 N末端1－46氨基酸，Alomone Labs公司;抗Cav1.2抗體，抗C末端1507－1733氨基酸，Stress-Marq Biosciences Inc公司;小麥胚芽凝集素(WGA)，日本W(wǎng)ako公司;ECL發(fā)光試劑盒，GE Health-care公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 超高速離心機(jī)，日本佐久間制造所;小型動(dòng)物呼吸機(jī)，日本SETA GAYA.KU公司;勻漿儀，日本IUCHI株式會(huì)社;Western blot電泳槽和轉(zhuǎn)印槽，美國(guó) Bio-Rad;凝膠自動(dòng)成像儀，韓國(guó)DAHAN公司;圖像分析系統(tǒng)，日本ALTO公司。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠心室肌組織的制備 豚鼠，體質(zhì)量300～400 g。1%戊巴比妥鈉按100 mg·kg－1行腹腔注射麻醉，氣管插管后，在人工呼吸機(jī)支持下開(kāi)胸進(jìn)行主動(dòng)脈管插管，迅速取出心臟，將心臟離體并連接于Langendorff灌流裝置上，37℃恒溫及供氧條件下臺(tái)氏液連續(xù)灌流約3 min，無(wú)鈣臺(tái)氏液灌流約6 min，用含0.05%膠原酶的無(wú)鈣臺(tái)氏液灌流至心室肌組織被消化;KB液灌流沖洗，剪碎心室肌組織，存于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 豚鼠心室肌Cav1.2鈣通道蛋白的提取 豚鼠心室肌組織在蛋白裂解液中剪成小塊，然后研磨法勻漿，勻漿后12 000 ×g 離心，20 min，取上清，45 000 r·min－1離心，1 h，沉淀用 Tris緩沖液(100 mmol·L－1Sucrose，20 mmol·L－1Tris-HCl，10 mmol·L－1EGTA，5 mmol·L－1EDTA)重懸，此懸浮液體與WGA孵育2 h，然后用Tris緩沖液洗兩次，所有操作均在冰上進(jìn)行。將提純的 Cav1.2鈣通道蛋白應(yīng)用Bradford方法檢測(cè)蛋白濃度。牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品被用來(lái)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 SDS-PAGE凝膠電泳鑒定Cav1.2鈣通道蛋白 制備濃度為5.8%的SDS-PAGE凝膠以備電泳。SDS-PAGE凝膠電泳分離制備的心肌Cav1.2鈣通道蛋白，上樣量為20μg，同時(shí)使用預(yù)染蛋白Marker，依據(jù)分子量對(duì)所制備的蛋白進(jìn)行鑒定。

1.2.4 Western blot鑒定目的蛋白免疫原性 Cav1.2鈣通道蛋白經(jīng)5.8%的SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印于PVDF膜上，TBST洗膜后5%的BSA室溫封閉1 h，分別采用不同的抗Cav1.2抗體4℃孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜，ECL試劑曝光、顯影及定影，對(duì)膠片進(jìn)行圖像采集。將膠片圖像輸入圖像分析系統(tǒng)，應(yīng)用CS analyzer 3.0軟件進(jìn)行強(qiáng)度測(cè)定，結(jié)果以光密度值表示。

2 結(jié)果

2.1 不同表面活性劑對(duì)Cav1.2鈣通道蛋白制備的影響

膜蛋白是通過(guò)疏水氨基酸殘基錨定在膜結(jié)構(gòu)中的，很難溶解在水性緩沖液中，因此，需要使用去污劑或表面活性劑以達(dá)到增溶的效果。用于增溶的去污劑有離子型和非離子型的，本研究選擇了兩種較為溫和的非離子型去污劑CHAPS和Triton X-100，嘗試制備心肌細(xì)胞膜Cav1.2鈣通道蛋白。心肌組織經(jīng)過(guò)勻漿離心后，上清再分別經(jīng)過(guò)2%CHAPS和1%TritonX-100的處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)2%CHAPS處理的樣本，上清中可能含有較多的Cav1.2鈣通道蛋白，而1%Triton X-100處理過(guò)的上清并未分離得到Cav1.2鈣通道蛋白(Fig 1)。因此，在制備心肌Cav1.2鈣通道蛋白時(shí)本研究選擇CHAPS作為增溶的去污劑。

Fig 1 Soluble effect of Cav1.2 protein treated by CHAPS and Triton X-100 detergent

進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)使用了不同濃度的CHAPS觀察了Cav1.2鈣通道蛋白的增溶效果的不同。結(jié)果顯示(Fig 2)，不同濃度的CHAPS(2%、4%、6%)在鈣通道蛋白的增溶效果上并沒(méi)有明顯差別。同時(shí)，有研究表明高濃度的去污劑可能會(huì)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，使蛋白質(zhì)失去天然的構(gòu)象。因此，后續(xù)研究采用了較低濃度的CHAPS(2%)制備心肌Cav1.2鈣通道蛋白。

Fig 2 Soluble effect of Cav1.2 protein treatedby different concentrations of CHAPS(2%，4%，6%)

2.2 WGA親和層析方法制備Cav1.2鈣通道蛋白 除了選擇合適的去垢劑，蛋白溶解液中的離子強(qiáng)度也是影響膜蛋白制備的重要因素。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)將用于溶解蛋白的Tris緩沖液中加入了氯化鉀(0.5 mol·L－1)，以促使細(xì)胞膜更好的溶解破裂。WGA是能夠特異結(jié)合Cav1.2鈣通道蛋白上糖蛋白的凝集素，經(jīng)氯化鉀處理后的蛋白溶解液，應(yīng)用WGA與蛋白溶解液孵育2 h后，經(jīng)5.8%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，結(jié)果顯示在分子質(zhì)量約為220 ku處存在唯一蛋白條帶(Fig 3)。Cav1.2鈣通道蛋白分子質(zhì)量約220 ku，我們認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)采用WGA制備的蛋白為心肌Cav1.2鈣通道蛋白。2.3 Western blot鑒定Cav1.2鈣通道蛋白 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為了更進(jìn)一步鑒定所制備的蛋白為全長(zhǎng)的心肌Cav1.2鈣通道蛋白，本研究采用了Western blot的方法。使用兩種不同的心肌Cav1.2鈣通道蛋白的抗體對(duì)制備的蛋白進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示應(yīng)用抗C末端(檢測(cè)1507-1733氨基酸片段)的抗體可檢測(cè)到心肌Cav1.2鈣通道蛋白(Fig 4);應(yīng)用抗N末端(檢測(cè)1-46氨基酸片段)的抗體同樣也可檢測(cè)到心肌Cav1.2鈣通道蛋白(Fig 4)，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們成功制備純化了全長(zhǎng)心肌Cav1.2鈣通道蛋白，且此蛋白純度較高。

Fig 3 Cardiac Cav1.2 channel protein was separated by 5.8%SDS-PAGE gel

Fig 4 The Cav1.2 channel protein identified by Western blot

3 討論

心肌L型鈣通道(Cav1.2鈣通道)是心肌細(xì)胞興奮時(shí)外鈣內(nèi)流的主要途徑，研究表明［7－9］，心肌L型鈣通道與許多心血管系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，如心肌L型鈣通道與心律失常、心肌肥大、心力衰竭等有關(guān)。關(guān)于心肌L型鈣通道的研究非常廣泛，研究方法也很多，由于實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，采用的方法也不同。例如采用電生理的方法?duì)心肌L型鈣通道的功能進(jìn)行研究［10－11］，應(yīng)用共聚焦顯微鏡可測(cè)定單個(gè)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，Western blot的方法是檢測(cè)鈣通道蛋白比較常用的方法等。然而本研究采用親和層析的方法提取制備了純度較高的心肌全長(zhǎng)Cav1.2鈣通道蛋白，為系統(tǒng)研究鈣通道奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用是細(xì)胞生化反應(yīng)的重要組成部分，對(duì)調(diào)控細(xì)胞信號(hào)具有重要意義。目前，研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的方法有很多，如酵母雙雜交、免疫共沉淀以及pull-down技術(shù)等。研究發(fā)現(xiàn)很多蛋白質(zhì)可與心肌Cav1.2鈣通道結(jié)合，并且多采用制備不同標(biāo)簽的融合蛋白的方法來(lái)獲得Cav1.2鈣通道的不同片段，應(yīng)用Cav1.2鈣通道的不同片段進(jìn)行進(jìn)一步的蛋白與蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)的研究［6，12］。這種方法在研究全長(zhǎng)Cav1.2鈣通道蛋白與其他蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)中存在缺點(diǎn)，由于Cav1.2鈣通道蛋白的分子質(zhì)量約為220 ku，而采用不同標(biāo)簽的融合蛋白制備方法很難獲得分子質(zhì)量很大的蛋白，因此，本研究探索制備了全長(zhǎng)的Cav1.2鈣通道蛋白，為檢測(cè)某些蛋白與全長(zhǎng)鈣通道蛋白結(jié)合研究提供了方便，也為應(yīng)用全長(zhǎng)的Cav1.2鈣通道蛋白進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究提供新的方法。

親和層析法制備全長(zhǎng)的心肌Cav1.2鈣通道蛋白，是體外系統(tǒng)研究鈣通道蛋白的前提和基礎(chǔ)。研究表明［13－15］，很多細(xì)胞內(nèi)因子可與鈣通道直接結(jié)合，如鈣離子、鈣調(diào)蛋白以及鈣調(diào)蛋白抑素等，它們?cè)阝}通道上的結(jié)合位點(diǎn)是目前研究的熱點(diǎn)，在某些疾病狀態(tài)下，這些細(xì)胞因子與鈣通道的結(jié)合可能會(huì)發(fā)生改變，通過(guò)制備全長(zhǎng)鈣通道蛋白可為尋找這些細(xì)胞內(nèi)因子在鈣通道上的結(jié)合位點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。因此，對(duì)鈣通道蛋白純化方法的研究不僅對(duì)鈣通道在蛋白水平的研究具有很大的促進(jìn)作用，也為與鈣通道相關(guān)的心血管系統(tǒng)疾病的研究拓寬了思路。

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