姜 逸，唐夢(mèng)君，程 旭，沈欣悅，李建梅，尤素蘭，趙寶華，戴亞斌，周 生

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 家禽研究所，江蘇 揚(yáng)州 225003)

雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)為冠狀病毒科冠狀病毒屬中的一個(gè)代表種，其基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，長(zhǎng)約27.6 nt，具有典型的5' 帽子和3' Poly A 序列結(jié)構(gòu)。IBV 至少有10 個(gè)明顯的開(kāi)放閱讀框(ORF)，ORF 的定位次序?yàn)?'-1a-1b-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N-3'[1]。其中1a 和1b 編碼病毒的RNA 聚合酶；S、E、M 和N編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白；3a、3b、5a、5b 均編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白。在IBV 感染細(xì)胞內(nèi)可以檢測(cè)到3a、3b、5a 和5b，但其功能目前尚不清楚。研究表明3ab 和5ab 編碼區(qū)的缺失不影響病毒的復(fù)制和致病性[2]。

γ-干擾素(IFN-γ)是由多種細(xì)胞由特定的誘生劑作用產(chǎn)生的一種具有高度生物活性的可溶性糖蛋白[3]。IFN-γ 可以促進(jìn)Th1 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞以及自然殺傷性細(xì)胞等細(xì)胞免疫應(yīng)答，在抗病毒免疫及粘膜免疫中發(fā)揮重要作用[4]。雞IFN-γ(ChIFN-γ)對(duì)多種病毒感染均具有較好的抑制作用，如流感病毒、新城疫病毒[5]以及馬立克病病毒[6]等。ChIFN-γ 還能夠作為一種有效的免疫佐劑[7]。ChIFN-γ 可以通過(guò)脂質(zhì)體[8]、重組病毒載體[9]以及重組質(zhì)粒DNA 體內(nèi)接種發(fā)揮作用[10]。本研究前期已經(jīng)建立了IBV H120 疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)[11]，并且構(gòu)建了表達(dá)gfp 基因的重組病毒H120-EGFP/5a[12]。在此基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)反向遺傳技術(shù)構(gòu)建表達(dá)IFN-γ 基因的重組IBV，為開(kāi)展IBV 的分子致病機(jī)理，尤其是新型基因重組疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 用于構(gòu)建IBV H120 疫苗株全長(zhǎng)cDNA 的重組質(zhì)粒系統(tǒng)pMDTM1～pMDTM10 及H120 株核蛋白基因(N)的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAXN 均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所保存；BHK-21 細(xì)胞株購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；SPF種蛋購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑 PrimeSTAR?HS DNA 聚合酶、PrimeScript RT reagent Kit、DNA A-Tailing Kit、pMD18-T、SYBR Premix Ex Taq、Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit、T4 DNA 連接酶、T7 RNA聚合酶等均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；限制性?xún)?nèi)切酶、m7G(5')ppp(5')G 帽子結(jié)構(gòu)等購(gòu)自NEB公司；GenJet 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美中清水灣生物科技有限公司；抗His 標(biāo)簽的單克隆抗體(MAb)購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司；羊抗鼠IgG-HRP 購(gòu)自南京生興生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank 中登錄的ChIFN-γ 基因序列(GQ246226)設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，cIFNF：5'-TTGGTCTCAGATGACTTGCCAGACTT-3'(Bsa Ⅰ)和cIFNR：5'-TTGGTCTCAGGTGGCAATTG CATCTCCT-3'(BsaⅠ)，預(yù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為515 bp。根據(jù)5a 基因所在重組質(zhì)粒pMDTM9 的序列，設(shè)計(jì)用于構(gòu)建pMDTM9-cIFN/5a 的引物，5aF：5'-TAGG TCTCGCACCATCACCATCACCATTAATGGCTGAC TAGTT-3'(BsaⅠ)和5aR：5'-GTTCTGGTCTCGCATC GTCTGTATTTGTTAAG-3'(BsaⅠ)，并在ChIFN-γ 基因3' 端引入6×His 標(biāo)簽序列，預(yù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為5.8 kb。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 ChIFN-γ 基因的擴(kuò)增 雞脾淋巴細(xì)胞的分離、誘導(dǎo)培養(yǎng)及總RNA 的提取參照文獻(xiàn)[13]。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明合成cDNA，并以其為模板，cIFNF/cIFNR 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。將PCR 產(chǎn)物經(jīng)DNA A-Tailing Kit 按照使用說(shuō)明處理后，連接至pMD18-T 構(gòu)建重組質(zhì)粒pMDcIFN，將其轉(zhuǎn)化JM109，篩選陽(yáng)性重組子，并進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.5 重組質(zhì)粒p MDTM9-c IFN/5a的構(gòu)建 以重組質(zhì)粒pMDTM9 為模板，5aF/5aR 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。將PCR 產(chǎn)物及重組質(zhì)粒pMDcIFN 分別采用BsaⅠ酶切后，膠回收目的片段并連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMDTM9-cIFN/5a，將其轉(zhuǎn)化JM109 進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.6 表達(dá)ChIFN-γ 基因重組基因組全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建 將pMDTM1～pMDTM8、pMDTM9-cIFN/5a及pMDTM10 重組質(zhì)粒經(jīng)BsaⅠ酶切，膠回收TM1、TM2、TM3、TM4、TM5、TM6、TM7、TM8、TM9-cIFN/5a 和TM10 片段。根據(jù)文獻(xiàn)[12]的方法構(gòu)建表達(dá)ChIFN-γ 基因重組基因組全長(zhǎng)cDNA。

1.7 重組病毒的拯救及鑒定 參考文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行重組病毒的拯救。取P1 代含拯救病毒尿囊液，采用RNA 提取試劑盒提取其總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。采用分別位于重組病毒基因組中IFN-γ 基因上游和下游位置的檢測(cè)引物JC4S(5'-GGAAAAGTCC ACTACGAAGG-3')和 JC4A(5'-GCTCTGCTTGTCCT GCTTTG)，RT-PCR 擴(kuò)增包含完整IFN-γ 基因的片段。拯救病毒的預(yù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為968 bp，而rH120 的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為461 bp，并進(jìn)行測(cè)序鑒定。將拯救的重組病毒命名為rH120-cIFNγ/5a。

1.8 目的基因表達(dá)的鑒定 取含有親本病毒H120和拯救獲得的rH120-cIFNγ/5a 尿囊液，經(jīng)5 倍蛋白上樣緩沖液煮沸8 min，制備蛋白樣品進(jìn)行SDSPAGE 電泳；電轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，采用5 %的脫脂奶封閉，以抗His 標(biāo)簽MAb 為一抗，羊抗鼠IgG-HRP 為二抗(1∶8 000)，通過(guò)ECL 光學(xué)顯影進(jìn)行western blot 鑒定。

1.9 重組病毒的生物學(xué)特性測(cè)定 將rH120-cIFNγ/5a的P2 代以PBS 100 倍稀釋后，接種于6 枚10 日齡的SPF 雞胚尿囊腔內(nèi)，0.2 mL/胚，同時(shí)2 枚未接種雞胚作為陰性對(duì)照，置37 ℃孵化至144 h，觀(guān)察雞胚的病變；將病毒尿囊液經(jīng)PBS 進(jìn)行10 倍梯度稀釋后，取10-5～10-9稀釋度，分別接種5 枚10 日齡SPF 雞胚，根據(jù)Reed-Muench 法測(cè)定EID50；將親本病毒株H120 和rH120-cIFNγ/5a 的尿囊液104倍稀釋后，接種于10 枚11 日齡的SPF 雞胚，接種后間隔不同時(shí)間，使用注射器分別對(duì)每只胚進(jìn)行連續(xù)取樣，抽取尿囊液0.2 mL/胚，通過(guò)熒光定量RT-PCR法對(duì)樣品中的病毒含量進(jìn)行測(cè)定，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.10 重組病毒的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè) 將rH120-cIFNγ/5a P1 代尿囊液100 倍稀釋后，接種于5 枚10 日齡～11 日齡的SPF 雞胚中進(jìn)行連續(xù)傳代至P12 代后，取P1、P3、P6、P9 和P12 代病毒的尿囊液提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以JC4S/JC4A 為引物PCR 檢測(cè)ChIFN-γ 基因的完整性。將P12 代擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序分析。

2 結(jié)果

2.1 ChIFN-γ 基因的擴(kuò)增及IBV全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建 以白來(lái)航雞脾淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)物的總RNA制備的cDNA 為模板，cIFNF/cIFNR 為引物，PCR擴(kuò)增ChIFN-γ 基因，結(jié)果顯示擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為500 bp，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1A)。測(cè)序結(jié)果表明該片段長(zhǎng)度為515 bp，包含完整的ChIFN-γ 基因編碼區(qū)。將ChIFN-γ 基因插入H120 基因組中非結(jié)構(gòu)蛋白5a 編碼區(qū)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(TRS)之間，構(gòu)建含有ChIFN-γ 基因的IBV 基因組全長(zhǎng)cDNA(圖1B)。在ChIFN-γ 基因終止密碼子前引入6×His 標(biāo)簽序列。

圖1 A ChIFN-γ 基因的PCR 擴(kuò)增Fig.1 A Amplification of ChIFN-γ gene by PCR

圖1 B 表達(dá)ChIFN-γ 基因的rIBV 基因組全長(zhǎng)cDNA 的構(gòu)建Fig.1 B Construction of genomic cDNA of rIBV expressing ChIFN-γ gene

2.2 重組病毒的拯救及鑒定 以含有ChIFN-γ 基因的IBV 基因組全長(zhǎng)cDNA 為模板，采用T7 RNA 聚合酶體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成病毒基因組RNA，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染BHK-21 細(xì)胞進(jìn)行病毒的拯救。采用引物JC4S/JC4A，RT-PCR 擴(kuò)增包含完整IFN-γ 基因的片段進(jìn)行拯救的重組病毒鑒定。結(jié)果顯示，重組病毒的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約1 kb，而H120 親本病毒的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約0.5 kb，與預(yù)期結(jié)果相符(圖2)。擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果表明，ChIFN-γ 基因已正確插入到病毒基因組中5a 編碼區(qū)的上游。

圖2 重組病毒的RT-PCR 鑒定Fig.2 Identification of recombinant virus by RT-PCR

2.3 Western blot鑒定目的基因的表達(dá) 采用抗His 標(biāo)簽MAb 對(duì)rH120-cIFNγ/5a IFN-γ 的表達(dá)進(jìn)行western blot 鑒定。結(jié)果顯示，rH120-cIFNγ/5a 在約20 ku 處出現(xiàn)特異性條帶，并且條帶的大小與理論結(jié)果相符，而H120 則無(wú)此條帶(圖3)。

圖3 Western blot 鑒定目的基因的表達(dá)Fig.3 Identification of ChIFN-γ expression by western blot

2.4 對(duì)雞胚的致病性試驗(yàn)結(jié)果 將重組病毒接種10 日齡的SPF 雞胚，至144 h 后觀(guān)察雞胚的病變；rH120-cIFNγ/5a 能夠引起IBV 感染雞胚的特征性變化：雞胚發(fā)育受阻，成為侏儒胚(圖4)。

圖4 重組病毒感染雞胚的病變Fig.4 Pathogenicity of rIBV to chicken embryos

2.5 重組病毒EID50的測(cè)定結(jié)果 將H120 和rH120-cIFNγ/5a 分別接種10 日齡SPF 雞胚，根據(jù)Reed-Muench 法，測(cè)定H120 和rH120-cIFNγ/5a 的EID50，結(jié)果分別為107.5/0.1 mL 和106.83/0.1 mL。

2.6 重組病毒增殖曲線(xiàn)測(cè)定結(jié)果 將H120 和rH120-cIFNγ/5a 分別接種11 日齡SPF 雞胚，通過(guò)熒光定量RT-PCR 對(duì)不同時(shí)間段取樣中的病毒滴度進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，兩病毒株的病毒滴度均在感染后約30 h 達(dá)到峰值，兩者配對(duì)樣本t 檢驗(yàn)結(jié)果(p<0.05)表明rH120-cIFNγ/5a 生長(zhǎng)復(fù)制能力受到一定程度的影響(圖5)，這與EID50的測(cè)定結(jié)果相符。

2.7 重組病毒的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果 將rH120-cIFNγ/5a 在SPF 雞胚中進(jìn)行連續(xù)傳代，采用RT-PCR檢測(cè)ChIFN-γ 基因在P1、P3、P6、P9 和P12 的完整性，結(jié)果顯示，ChIFN-γ 基因在病毒傳代至第9代時(shí)大部分仍保持完整，但至第12 代時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)明顯的缺失(圖6)。

進(jìn)一步將P12 代重組病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果顯示，不同重組子中ChIFN-γ 基因發(fā)生缺失的位點(diǎn)及缺失的程度存在差異，部分重組病毒中ChIFN-γ 基因編碼區(qū)已經(jīng)完全缺失(圖7)。

圖5 H120 和rH120-cIFNγ/5a 的增殖曲線(xiàn)Fig.5 Growth curve of H120 and rH120-cIFNγ/5a

圖6 重組病毒的遺傳穩(wěn)定性分析Fig.6 Analysis of genetic stability of the rIBV

圖7 ChIFN-γ 基因缺失位點(diǎn)測(cè)序分析Fig.7 Integrity analysis of ChIFN-γ gene by sequencing

3 討論

已有研究表明IBV 5a 蛋白編碼區(qū)的缺失并不影響病毒的復(fù)制[3]，因此本研究基于已建立的IBV H120 疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)，將ChIFN-γ 基因插入H120 病毒基因組中的5a 蛋白編碼區(qū)上游，構(gòu)建rH120-cIFNγ/5a。通過(guò)western blot 分析，在重組病毒感染雞胚尿囊液中能夠檢測(cè)到ChIFN-γ 蛋白的表達(dá)。rH120-cIFNγ/5a 具有與親本病毒株H120 相似的生物學(xué)特性，能夠引起感染雞胚特征性的變化，但與親本病毒株相比，其毒價(jià)有所下降，因此ChIFN-γ 基因的插入對(duì)IBV 的復(fù)制產(chǎn)生了影響。

研究表明，不同外源基因在IBV 基因組中的穩(wěn)定性不同，部分基因在傳代過(guò)程中容易發(fā)生缺失。外源基因在重組冠狀病毒中的穩(wěn)定性受多種因素影響，如基因的大小、序列特性及其在病毒基因組中的位置等。Shen 等選擇EGFP、螢火蟲(chóng)熒光素酶基因、eIF3f、SARS 病毒的ORF6 及登革熱病毒核心蛋白基因，分別插入IBV 基因組的不同位置拯救獲得重組病毒，并對(duì)重組病毒中外源基因的表達(dá)情況及重組病毒的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明重組病毒的穩(wěn)定性主要由外源基因本身的特性以及其在病毒基因組中的位置決定[14]。Bentley 等分別采用EGFP 和人源化海腎螢光素酶基因(hRluc)替換IBV基因組中的5a、IR 和3a3b 基因區(qū)域，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)重組病毒的遺傳穩(wěn)定性與基因組片段插入的位置有關(guān)，并且表達(dá)密碼子優(yōu)化hRluc 基因的重組病毒，其遺傳穩(wěn)定性有所提高[15]。本研究將重組病毒rH120-cIFNγ/5a 株在SPF 雞胚中進(jìn)行連續(xù)傳代，檢測(cè)ChIFN-γ 基因在不同代次的完整性，結(jié)果表明ChIFN-γ 基因在病毒傳代至第9 代時(shí)仍保持完整，但至第12 代時(shí)出現(xiàn)部分或完全缺失的現(xiàn)象。以上研究結(jié)果表明，研發(fā)以IBV 為載體的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，需要解決重組病毒的遺傳穩(wěn)定性問(wèn)題。

[1]Brian D A,Baric R S.Coronavirus genome structure and replication[J].Curr Top Microbiol Immunol,2005,287:1-30.

[2]Hodgson T,Britton P,Cavanagh D.Neither the RNA nor the proteins of open reading frames 3a and 3b of the coronavirus infectious bronchitis virus are essential for replication[J].J Virol,2006,80(1):296-305.

[3]Isaacs A,Lindenmann J.Virus interference.I.The interferon[J].Proc R Soc Lond B Biol Sci,1957,147(927):258-267.

[4]Boehm U,Klamp T,Groot M et al.Cellular responses to interferon-gamma[J].Annual Rev Immunol,1997,15：749-795.

[5]Yeh H Y,Winslow B J,Junker D E et al.In vitro effects of recombinant chicken interferon-gamma on immune cells[J].J Interferon Cytokine Res,1999,19(6):687-691.

[6]Zheng Xing,Schat K A.Inhibitory effects of nitric oxide and gamma interferon on in vitro and in vivo replication of Marek's disease virus[J].J Virol,2000,74(8):3605-3612.

[7]Lowenthal J W,O'Neil T E,Broadway M,et al.Coadministration of IFN-gamma enhances antibody responses in chickens[J].J Interferon Cytokine Res,1998,18(8):617-622.

[8]Kedar E,Palgi O,Golod G et al.Delivery of cytokines by liposomes.III.Liposome-encapsulated GM-CSF and TNF-alpha show improved pharmacokinetics and biological activity and reduced toxicity in mice[J].J Immunother,1997,20(3):180-193.

[9]Johnson M A,Pooley C,Lowenthal J W.Delivery of avian cytokines by adenovirus vectors[J].Dev Comp Immunol,2000,24(2-3):343-354.

[10]Haygreen L,Davison F,Kaiser P.DNA vaccines for poultry:the jump from theory to practice[J].Expert Rev Vaccines,2005,4(1):51-62.

[11]周生，戴亞斌，唐夢(mèng)君，等.雞傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株全長(zhǎng)cDNA 感染性克隆的構(gòu)建[J].中國(guó)家禽，2010，23：22-26.

[12]周生，唐夢(mèng)君，戴亞斌，等.表達(dá)綠色熒光蛋白的重組雞傳染性支氣管炎病毒的構(gòu)建[J].病毒學(xué)報(bào)，2011，01：11-17.

[13]劉勝旺，劉思國(guó)，盧景良.雞干擾素基因的分子克隆與序列測(cè)定[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2001，01：45-47.

[14]Shen Hong-yuan,Fang Shou-guo,Chen Bo,et al.Towards construction of viral vectors based on avian coronavirus infectious bronchitis virus for gene delivery and vaccine development[J].J Virol Methods,2009,160(1-2):48-56.

[15]Bentley K,Armesto M,Britton P.Infectious bronchitis virus as a vector for the expression of heterologous genes[J].PLoS One,2013,8(6):e67875.