何美琳，張煥容,2*，程方明，楊曉農,2，岳 華,2

(1.西南民族大學 生命科學與技術學院，四川 成都 610041；2.西南民族大學 動物醫(yī)學四川省高等學校重點實驗室，四川 成都 610041)

基因C 型鴨病毒性肝炎是由基因C 型鴨甲肝病毒(Duck hepatitis A virus genotype C，DHAV-C)引起雛鴨的一種以肝臟腫大和出血為主要病理變化的急性、高度接觸性和致死性的病毒性傳染病[1-2]。以發(fā)病急、傳播迅速、病死率高為特征，廣泛分布于全世界養(yǎng)鴨地區(qū)，是危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴重的傳染病之一[3-5]。目前在我國大陸流行的主要是基因A 型和C型DHAV。兩種基因型DHAV 引起雛鴨的臨床癥狀和病理變化無法區(qū)分[6]。目前檢測DHAV-C 的主要方法有RT-PCR、病毒分離鑒定、中和試驗和ELISA等，其中ELISA 既可以檢測抗原，也可以檢測抗體，并以靈敏度高、特異性強及檢測速度快等優(yōu)點廣泛用于免疫學檢測中。

本研究利用純化的DHAV-C 作為包被抗原，純化的單克隆抗體(MAb)抑制血清與抗原結合，建立檢測DHAV-C 特異性抗體的MAb 競爭ELISA 方法，為DHAV-C 抗體的快速檢測與血清學調查提供方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株、MAb及血清 DHAV-C 臨床分離株(SWUN3502)由西南民族大學動物醫(yī)學實驗室保存；鼠抗DHAV-C MAb 5E3-9、DHAV-C 和DHAV-A 鴨陽性血清、鴨瘟(DP)、新城疫(ND)、禽流感(AI)、大腸桿菌(E.coli)、金葡萄球菌(S.aureus)、沙門氏菌(Salmonella)、禽多殺性巴氏桿菌(P.multocida)和鴨疫里墨氏桿菌(R.anatipestifer)的陽性鴨血清以及SPF 鴨陰性血清均由西南民族大學動物醫(yī)學實驗室制備并保存；鴨乙型肝炎(DHBV)陽性血清和鴨圓環(huán)病毒(DUCV)陽性血清由四川農業(yè)大學賈仁勇教授饋贈。

1.2 主要試劑 HRP 標記的羊抗鼠IgG(HRP-IgG)購自北京中杉金橋生物技術有限公司；TMB 購自Thermo 公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自生工生物工程(上海)有限公司。

1.3 DHAV-C MAb 5E3-9的純化 取適量的MAb 5E3-9 小鼠腹水5 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液用蛋白A 瓊脂糖親和層析純化，純化的MAb進行SDS-PAGE 電泳，檢測其純度。

1.4 抗原的制備 參考文獻[2]增殖和純化DHAV-C，于DU800 核酸蛋白檢測儀上測定蛋白濃度，根據(jù)測定OD280nm和OD260nm值，按公式：(mg/mL)=(1.45×OD280nm～0.74×OD260nm)×稀釋倍數(shù)，計算純化病毒的濃度。取適量純化病毒負染后于掃描電鏡觀察，確定病毒的純度及病毒粒子的形態(tài)。

1.5 抗原最佳包被量與MAb最佳稀釋度的優(yōu)化 采用方陣法，用包被緩沖液將純化的DHAV-C 按20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL、1.25 μg/mL、0.625 μg/mL 稀釋后包被酶標板，100 μL/孔，4 ℃過夜；洗滌后5 %脫脂奶粉37 ℃封閉2 h；洗滌后加入稀釋的MAb 5E3-9，MAb 稀釋度為1∶200、1∶300、1∶400、1∶600、1∶800、1∶1 200、1∶1 600、1∶2 400，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；洗滌后加入羊抗鼠HRP-IgG(1∶10 000)，100 μL/孔，37 ℃孵育0.5 h；洗滌后加入底物TMB 顯色，室溫避光孵育15 min；加入2 moL/L H2SO4終止，測定OD450nm值。OD450nm值在1.0～1.5 并且與左右相差較大的反應孔抗原濃度與MAb 稀釋度即為最佳抗原包被量與MAb 最佳稀釋度。

1.6 待檢血清最佳稀釋倍數(shù)、羊抗鼠HRP-IgG濃度及孵育時間和封閉液的優(yōu)化 以最佳抗原包被濃度包被酶標板，100 μL/孔，4 ℃過夜，洗滌封閉后加入用最佳稀釋度MAb 作1∶2、1∶4、1∶8、1∶10、1∶16、1∶20 倍稀釋的陽性血清，并設空白對照孔、不稀釋陽性血清孔、陰性血清孔及最佳稀釋度MAb孔對照，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；洗滌后加入羊抗鼠HRP-IgG，37 ℃孵育0.5 h，洗滌后加入底物TMB 顯色，室溫避光孵育15 min；加入2 moL/L H2SO4終止，測定OD450nm值，計算抑制率。抑制率(%)=100 %×(完全MAb OD450nm值-樣品OD450nm值)/完全MAb OD450nm值。同法優(yōu)化羊抗鼠HRP-IgG 最佳濃度(1∶5 000、1∶10 000、1∶15 000、1∶20 000)和孵育時間(37 ℃孵育30 min、45 min、60 min、90 min)。分別用1 % BSA、2 % BSA、5 %脫脂奶粉、10 %脫脂奶粉、1 %明膠做為封閉液，經上述最佳反應條件反應，選擇最佳封閉液。

1.7 臨界值的確定 利用優(yōu)化的競爭ELISA 方法對30 份不含有DHAV-C 抗體的鴨陰性血清經最佳稀釋度MAb 稀釋后進行檢測，測定OD450nm值，計算抑制率，計算30 份血清的平均抑制率和標準偏差(SD)，確定臨界值，臨界值=陰性血清的

1.8 特異性試驗 采用建立的MAb 競爭ELISA 方法對DHAV-A、DPV、DHBV、DUCV、NDV、AIV陽性鴨血清以及E.coli、S.aureus、Salmonella、P.multocida 和R.anatipestifer 的鴨陽性血清進行檢測，計算上述檢測血清的抑制率，分別與臨界值比較，確定建立的競爭ELISA 方法是否與其他相關病原的鴨源陽性血清發(fā)生交叉反應。

1.9 靈敏性試驗 將DHAV-C 陽性血清用最佳稀釋度MAb 分別做1∶2～1∶256 稀釋，其余條件按照優(yōu)化的最佳MAb 競爭ELISA 條件進行，測定不同稀釋度陽性血清MAb 競爭ELISA 檢測的OD450nm值，計算抑制率，分別與臨界值比較，確定建立的競爭ELISA 方法的靈敏性。

1.10 重復性試驗 利用同一塊酶標板中4 復孔對同1 份DHAV-C 陽性血清進行檢測，測定OD450nm值，計算抑制率，比較批內變異系數(shù)；利用4 塊酶標板分別對同1 份DHAV-C 陽性血清進行檢測，測定OD450nm值，計算抑制率，比較批間變異系數(shù)。

1.11 符合率試驗 將中和試驗確定的15 份DHAV-C 陽性血清和18 份陰性血清，采用建立的競爭ELISA 方法進行檢測，比較兩者的符合率。

2 結果

2.1 純化的MAb 5E3-9 將腹水上清液利用蛋白A 瓊脂糖親和層析純化后，經SDS-PAGE 電泳檢測，結果顯示純化的MAb 5E3-9 在約50 ku(IgG 重鏈)和25 ku(IgG 輕鏈)處有二條明顯的條帶。經測定BCA 蛋白定量結果為568 μg/mL。

2.2 純化的DHAV-C 經氯仿去脂，蔗糖密度梯度離心純化的DHAV-C，負染后掃描電鏡觀察，存在大量圓形規(guī)則的病毒粒子，直徑在20 nm～40 nm，與DHAV-C 的大小相符合(圖1)，核酸蛋白檢測儀測定純化的病毒蛋白濃度經計算為3.68 mg/mL。

圖1 純化的DHAV-C 電鏡掃描結果Fig.1 Purified DHAV-C scanned with electronic microscope(Bar=100 nm)

2.3 MAb競爭ELISA檢測方法反應條件優(yōu)化結果將不同濃度DHAV-C 包被抗原與不同稀釋度MAb 5E3-9 采用方陣滴定法確定最佳工作濃度，并在此基礎上，進一步優(yōu)化ELISA 檢測條件，結果如表1所示。

表1 MAb 競爭ELISA 檢測方法反應條件優(yōu)化結果Table 1 Optimized conditions of the MAb competitive ELISA

2.4 臨界值的確定 采用優(yōu)化的MAb 競爭ELISA檢測30 份鴨陰性血清，根據(jù)檢測結果繪制陰性血清正態(tài)分布圖(圖2)，平均抑制率為28.07 %，SD 為0.026，根據(jù)公式計算陽性臨界值為35.77 %，即當血清抑制率≥35.77 %者判為陽性，當血清的抑制率<35.77 %者判為陰性。

2.5 特異性試驗結果 采用建立的MAb 競爭ELISA 對NDV、AIV、DHAV-A、DPV、DHBV、DUCV 鴨血清、S.aureus、E.coli、P.multocida、Salmonella 和R.anatipestifer 鴨血清進行檢測，結果顯示，除DHAV-C 外，對其他病原的鴨陽性血清的抑制率值均小于陽性臨界值，表明建立的DHAV-C MAb 競爭ELISA 特異性良好(圖3)。

圖2 陰性血清正態(tài)分布圖Fig.2 Normal distribution of negative serum

圖3 競爭ELISA 的特異性檢測Fig.3 Specific detection of competitive ELISA

2.6 靈敏性試驗結果 將稀釋的DHAV-C 陽性血清(1∶2～1∶256)經優(yōu)化的MAb 競爭ELISA 檢測，結果陽性血清稀釋度為1∶128 時，抑制率為36.77 %，而陽性血清稀釋度為1∶256 時，抑制率為35.12 %(表2)。表明該方法的最低檢測稀釋度為1∶128。

表2 靈敏性試驗結果Table 2 Sensitivity detection of the MAb competitive ELISA

2.7 重復性試驗結果 同一酶標板中4 復孔經批內重復試驗檢測，其變異系數(shù)在4.64 %～5.21 %；4塊酶標板批間重復性試驗變異系數(shù)在6.02%～8.68%(表3)。表明該檢測方法具有良好的重復性。

表3 MAb 競爭ELISA 重復性試驗(n=4)Table 3 Repeatability assay for MAb competitive ELISA(n=4)

2.8 符合率試驗結果 中和試驗檢測陽性的15 份DHAV-C 陽性血清經建立的MAb 競爭ELISA 檢測，結果均為陽性，陽性符合率為100 %(15/15)；中和試驗檢測的18 份DHAV-C 陰性血清經建立的MAb競爭ELISA 檢測，結果陰性血清14 份，另外4 份為MAb 競爭ELISA 陽性，兩種方法對陰性樣品的檢測符合率為77.8 %(14/18)。

3 討論

本研究成功建立了基于DHAV-C 特異性MAb的競爭ELISA 抗體檢測方法。為保證該方法的特異性，采用了純化的DHAV-C 作為包被抗原，包被抗原的純度越高，對于減少ELISA 的非特異性結合越明顯。前期研究在純化鴨肝炎病毒過程中利用鴨胚增殖鴨肝炎病毒，收集鴨胚尿囊液和胚體混合勻漿后采用蔗糖密度梯度法離心純化鴨肝炎病毒，然而純化產物通過電鏡觀察均含有大量的雜質[7-9]。胡燕賓等在純化鴨肝炎病毒時加入了反復凍融以及氯仿去脂抽提的步驟，以消除在蔗糖梯度離心時脂類對病毒純化的影響[10]。本實驗綜合上述病毒純化方法，采用DHAV-C 接種SPF 鴨胚收獲的尿囊液勻漿胚體組織，經反復凍融，使病毒從組織細胞中充分釋放出來，然后離心收集上清液，利用氯仿抽提去上清液中的脂質，用0.22 μm 濾器再次去脂，最后采用蔗糖密度梯度離心后收集白色亮帶，用PBS 溶解獲得了純化的DHAV-C，經測定病毒蛋白濃度和掃描電鏡觀察病毒粒子，證明純化的DHAV-C 雜質較少，作為包被抗原降低了非特異性結合。建立ELISA 方法時，封閉液對于消除背景值具有重要的作用，本研究最終選擇了含5 %脫脂乳的PBST，顯著消除了非特異性結合。

國內學者采用了以蔗糖密度梯度離心法純化的病毒作為包被抗原建立檢測DHAV-A 抗體的ELISA方法，孫泉云等建立的DHAV-A 間接ELISA 抗體檢測方法，只檢測了與DPV 陽性血清無交叉反應，孔鳳萍等建立的DHAV-A 間接ELSIA 抗體檢測方法只報道了該方法對DPV、R.anatipestifer 和腺病毒等陽性血清無交叉反應，均未對所建立的方法的靈敏性進行評價[11-12]。本研究建立的以DHAV-C 特異性MAb 競爭結合待檢血清的ELISA 抗體檢測方法，與DHAV-C 陽性血清以外的其他10 種相關病原的鴨陽性血清均無交叉反應，該方法的特異性較好。用該方法檢測經中和試驗確定的陽性血清符合率，結果顯示陽性符合率為100 %，陰性符合率為77.8 %。本研究首次建立了基于DHAV-C McAb 的特異、敏感的競爭ELISA 抗體檢測方法，對于DHAV-C 的血清學調查和免疫或感染抗體的檢測提供了新的方法。

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