范春艷，宋金祥，薛素琴，唐爭魁，孫惠霞，喬 健，馬興樹,王順山

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193；2.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056002；3.河北省張北縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河北 張北 076450；4.河北省邯鄲市肉雞場，河北 邯鄲 056000；5.河北省邯鄲市邯山區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 邯鄲 056000；6.北京生泰爾科技股份有限公司，北京 大興 102600)

禽流感(Avian influenza，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒中有致病性的任何一型毒株引起各種家禽及野鳥的一種傳染性疾病綜合征，受感染的禽類可呈現(xiàn)臨床癥狀，如輕度上呼吸道疾病，產(chǎn)蛋率、受精率及孵化率下降，甚至急性全身致死性疾病[1]。疾病的嚴重程度取決于病毒毒株的毒力、感染禽種、年齡、性別、有無并發(fā)癥及環(huán)境條件等。迄今為止，已鑒定的A型流感病毒(Avian influenza virus，AIV)表面主要糖蛋白血凝素(HA)為18種(H1～H18)、神經(jīng)氨酸酶(NA)為11種(N1～N11)，其中H1～H16和N1～N9均可自禽類分得[2]，H17N10和H18N11則發(fā)現(xiàn)于蝙蝠[3-4]。H9N2亞型屬于低致病性AIV(LPAIV)，但自1992年我國首次發(fā)現(xiàn)后[5]，現(xiàn)已成為我國主要流行的亞型，分布廣泛，具有跨宿主傳播特點，且有可能產(chǎn)生遺傳特性及抗原特性完全不同的新型流感病毒風(fēng)險[6]。近年來，隨著我國鵪鶉飼養(yǎng)數(shù)量的逐年增多，多種亞型AIV對鵪鶉養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展已構(gòu)成嚴重威脅[7]，有資料表明，鵪鶉在流感病毒生態(tài)系統(tǒng)中可作為一個重要的中間宿主[8-9]。因此，對鵪鶉流感病毒的監(jiān)控具有重要公共衛(wèi)生意義。2006-2014年，對河北省部分養(yǎng)殖場病死鵪鶉采集的氣管拭子樣品23份，通過病毒分離、血凝試驗(HA)、血凝抑制(HI)試驗及反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)鑒定出2株H9N2流感病毒?，F(xiàn)將鑒定結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料與雞胚 病料為采集于河北省部分養(yǎng)殖場病死鵪鶉的氣管分泌物。9～12日齡SPF雞胚，購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.2 陽性血清 雞新城疫病毒血凝抑制試驗陽性血清，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；禽流感病毒H9亞型、H5亞型(Re-6、Re-7及Re-8)及H7亞型(H7N9株)陽性血清，均購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.1.3 試劑盒 MiniBEST病毒RNA/DNA提取試劑盒 (MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0)、一步法RT-PCR試劑盒[PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 (Dye Plus)]，均購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集與處理 2006-2014年，自有呼吸道癥狀、臉腫、下痢(黃綠色稀水樣糞便)、鵪鶉產(chǎn)蛋率下降、死亡率較高的病死鵪鶉的氣管中，用滅菌棉拭子蘸取適量硫酸慶大霉素注射液(8萬IU/mL)，無菌條件下擦拭病死鵪鶉的氣管分泌物，制成氣管拭子。將氣管拭子置于備有2 mL采樣液(硫酸慶大霉素注射液)的滅菌離心管中充分混勻，并將拭子頭在滅菌的離心管壁上反復(fù)擠壓數(shù)次，然后12 000 r/min離心2 min，取上清液經(jīng)直徑0.22 μm的微孔細菌濾器除菌，濾液備用[1]。

1.2.2 病毒分離培養(yǎng) 采用雞胚接種法[1]。取上述處理備用的樣品0.1～0.2 mL接種于10～12日齡SPF雞胚尿囊腔，每一樣品接種5枚雞胚。于37 ℃、56%濕度條件下在孵育箱中孵育2～3 d。棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，收集24～72 h的雞胚尿囊液。收獲的尿囊液分別滴3～4滴于大孔塑料版的不同孔中，加等量的1%雞紅細胞，搖勻后靜置于4 ℃ 30 min觀察結(jié)果，如出現(xiàn)血凝，則可進一步測定血凝滴度并鑒定。如血凝陰性，按上述方法盲傳3代，如仍為陰性，則棄之。

1.2.3 病毒初步鑒定 采用血凝(HA)與血凝抑制(HI)試驗。對具有血凝性的病毒，分別與新城疫(Newcastle disease,ND)陽性血清及H9、H5(Re-6、Re-7、Re-8)及H7(H7N9株)禽流感陽性血清進行HI試驗。

1.2.4 病毒的雞胚傳代 采用雞胚接種法[1]傳代，共傳5代。第1代雞胚尿囊液為氣管拭子的處理樣品接種SPF雞胚收獲的病毒尿囊液。第1～4代病毒尿囊液采用2種方法進行雞胚傳代培養(yǎng)。一種方法是直接用上一代病毒尿囊液原液接種SPF雞胚尿囊腔；另一種方法是將上一代雞胚尿囊液配制為4個凝集單位的病毒液，然后接種SPF雞胚尿囊腔。接種培養(yǎng)后，均采用HA試驗測定1～5代雞胚尿囊液的血凝效價，對2種接種方法進行比較。

1.2.5 病毒RNA提取 按照MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒說明書進行。

1.2.6HA、NA基因的RT-PCR擴增及序列測定 根據(jù)文獻報道的HA和NA引物序列[10]，由寶生物工程(大連)有限公司合成。HA引物序列(F：5′-AGC AAA AGC AGG GGA ATT TCA C-3′；R：5′-AGT AGA AAC AAG GGT GTT TTT GC-3′)和NA引物序列(F：5′-AGC AAA AGC AGG AGT AAA AAT G-3′；R：5′-AGT AGA AAC AAG GAG TTT TTT-3′)。

參照PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒說明書進行RT-PCR擴增：50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；35個循環(huán)：94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min；72 ℃ 10 min；4 ℃終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，送北京華大基因科技服務(wù)有限公司測序。

1.2.7 基因序列同源性分析 采用NCBI在線HA和NA基因序列BLAST分析。

2 結(jié)果

2.1 采樣鵪鶉群的發(fā)病情況調(diào)查 2006-2014年共從23個疑似發(fā)生流感的鵪鶉養(yǎng)殖場進行了樣品采集。疑似發(fā)生流感的鵪鶉群發(fā)病情況基本類似，但臨床表現(xiàn)及病理剖檢變化輕重不一。不同日齡的鵪鶉均可發(fā)生，基本是在禽流感疫苗免疫3月以上或未免疫禽流感疫苗的鵪鶉群發(fā)生。臨床癥狀綜合表現(xiàn)為下列現(xiàn)象：鵪鶉發(fā)病率和死亡率約為20%～100%，其中某些鵪鶉群發(fā)病率約為20%左右，幾乎無死亡。鵪鶉產(chǎn)蛋量下降到60%以下?；疾※g鶉精神沉郁、呆立一隅，食欲減少，羽毛蓬亂；嚴重者低頭縮頸、閉眼、打盹，站立不穩(wěn)，或頭頸歪邪、頭縮于翅下，或蹲臥于籠中，食欲廢絕，排出黃綠色或白色水樣、黏液樣糞便；最嚴重者肢體無力，蹲臥不起。病死鵪鶉剖檢可見，氣管內(nèi)有黏性分泌物或稀軟奶酪樣物質(zhì)，有的氣管出血，有的氣管無出血；腺胃與食道交界處出血，腺胃腫脹，內(nèi)膜覆蓋厚厚一層黏稠分泌物，腺胃乳頭出血；十二指腸等腸道腫脹，內(nèi)有黏性分泌物，腸道黏膜斑塊狀出血；胰腺出血；心冠脂肪出血；輸卵管內(nèi)有黏稠分泌物，嚴重的卵泡變形、破裂,腹腔內(nèi)有破裂的新鮮卵黃等。

2.2 病毒的初步鑒定 2006-2014年共采集不同日齡病死鵪鶉氣管拭子23份，除1個樣品經(jīng)雞胚尿囊腔接種盲傳3代仍無血凝外，其他22份樣品的雞胚尿囊液的血凝滴度均在5Log2以上(表1)。經(jīng)HI試驗鑒定發(fā)現(xiàn)，其中2009年分離的Qa/LC04/09毒株、2011年分離的Qa/LC02/11毒株和Qa/LC04/11為ND陽性病毒，除2008年分離的Qa/LC02/08毒株和2011年分離的Qa/LC01/11毒株為H9N2陽性外，其余樣品均為H5亞型陽性AIV(表1)。

表1 雞胚尿囊液HA和HI試驗結(jié)果Table 1 HA and HI titre of the allantoic fluid from chick embryos

2.3 鵪鶉H9N2流感病毒的雞胚傳代血凝性分析 Qa/LC02/08和Qa/LC01/11毒株的氣管拭子樣品經(jīng)SPF雞胚接種后，收獲的第1代雞胚尿囊液的HA滴度均為5Log2。雞胚尿囊液原液傳代的第2代雞胚尿囊液的HA滴度升高，分別為8Log2和9Log2，第3代雞胚尿囊液的HA滴度均下降為6Log2，第4代HA滴度下降為4Log2和5Log2。但傳代時先將上一代病毒尿囊液稀釋為4個血凝單位病毒尿囊液，然后再接種9～12日齡SPF雞胚尿囊腔，則收獲的下一代病毒尿囊液的HA滴度均能達到8Log2以上(表2)。結(jié)果表明，在流感病毒采用SPF雞胚傳代時，不應(yīng)使用未經(jīng)稀釋的高濃度的病毒尿囊液進行雞胚接種傳代，而應(yīng)將其稀釋為4個血凝單位后，再接種SPF雞胚才能使收獲的病毒尿囊液的HA滴度升高。

表2 不同雞胚傳代次數(shù)的尿囊液HA試驗結(jié)果(Log2)Table 2 HA titre of the different passages of the allantoic fluid from chick embryos (Log2)

2.4 RT-PCR產(chǎn)物的凝膠電泳鑒定 采用發(fā)表文獻的HA和NA引物序列合成相應(yīng)的引物，經(jīng)RT-PCR擴增出H9和N2目的條帶(圖1)。2株H9N2 AIV分別命名為A/Quail/Hebei/LC02/2008(H9N2)(簡稱為Qa/LC02/08)和A/Quail/Hebei/LC01/2011(H9N2)(簡稱為Qa/LC01/11)。

圖1 RT-PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 The electrophoregram of the RT-PCR products of two H9N2 AIV from aquilsM:DNA標準DL-2 000；1:Qa/LC02/08的HA基因；2:Qa/LC01/11的HA基因；3:Qa/LC02/08的NA基因；4:Qa/LC01/11的NA基因M:DL-2 000 DNA Marker;1:HA(H9) gene fragment of Qa/LC02/08;2:HA(H9) gene fragment of Qa/LC01/11;3:NA(N2) gene fragment of Qa/LC02/08;4:NA(N2) gene fragment of Qa/LC01/11

2.5HA和NA基因同源性分析HA基因長度為1 742 bp，NA基因長度為1 413 bp。2株鵪鶉分離株Qa/LC02/08與Qa/LC01/11的HA和NA基因的核苷酸同源性分別為97.7%和93.6%。

分離毒株Qa/LC02/08HA基因核苷酸與A/Chicken/Shandong/JN/1999(H9N2)及A/Chicken/Zhejiang/ZC28/2007(H9N2)同源性最高，均為99.39%，而與A/Chicken/Shandong/N/2010(H9N2)、A/Chicken/Guangxi/G8/2009(H9N2)和鴨源A/Duck/Shanghai/C60/2007(H9N2)同源性分別為99.27%、99.08%和99.08%(表3)。NA基因核苷酸與A/Chicken/Shandong/N/2010(H9N2)、A/Chicken/Shandong/B2/2007(H9N2)和A/Chicken/Shandong/JL/2008(H9N2)的同源性分別為99.12%、98.46%和98.38%(表3)。表明鵪鶉分離株Qa/LC02/08確為H9N2亞型流感病毒。

分離株Qa/LC01/11HA基因核苷酸與A/Chicken/Hebei/FL/2011(H9N2)、A/Chicken/Jiangsu/120/2011(H9N2)和A/Chicken/Shandong/H30/2011(H9N2)的同源性分別為99.63%、99.51%和99.45%(表3)。NA基因核苷酸與A/Chicken/Hebei/FL/2011(H9N2)、A/Chicken/Hebei/ZR/2010(H9N2)和A/Chicken/Shandong/WG18/2011(H9N2) 同源性均為99.7%，與A/Chicken/Jiangsu/SQ79/2011(H9N2)同源性為99.63%(表3)。表明鵪鶉分離株Qa/LC01/11確為H9N2亞型流感病毒。

表3 2株鵪鶉H9N2流感病毒的HA和NA基因序列在線BLAST的主要結(jié)果Table 3 Main results of online BLAST of HA and NA gene sequences of two strains of quail H9N2 influenza virus

3 討論

近年來，鵪鶉流感病毒受到研究者的廣泛關(guān)注，特別是1997年香港禽流感感染者及家禽分離到的H5N1/97樣病毒，其內(nèi)部基因在進化關(guān)系上與鵪鶉來源的病毒株A/Quail/G1/97 (H9N2)高度同源[11]。1999年香港感染人的H9N2流感病毒HA基因與鵪鶉分離株A/Quail/G1/97 (H9N2)親緣關(guān)系相近，而其內(nèi)部基因與Hong Kong/97(H5N1)關(guān)系密切[12]。2007年之前，A/Quail/Gl /97株病毒是我國H9N2 AIV的主要流行亞系，持續(xù)在鵪鶉和其他陸禽間傳播[13]。張增峰等[9]對鵪鶉流感病毒SA受體分布特點的研究結(jié)果顯示，鵪鶉同時表達SAα-2,3半乳糖苷受體和SAα-2,6半乳糖苷受體，SAα-2,3半乳糖苷受體在氣管、支氣管呈弱陽性分布，副支氣管呈陽性分布，而SAα-2,6半乳糖苷受體在氣管、支氣管呈強陽性分布，表明鵪鶉呼吸道易與其他禽流感病毒和人流感病毒結(jié)合，并在其體內(nèi)發(fā)生流感病毒基因重配而形成新亞型病毒感染人的跡象，即鵪鶉也可充當產(chǎn)生人類流感大流行的中間宿主。因此，對鵪鶉流感病毒的監(jiān)測尤為重要。

2006-2014年，我們自病死鵪鶉氣管中采集的23份樣品，經(jīng)接種雞胚分離后，通過HA試驗初步鑒定出19株流感病毒，其中2株H9陽性，17株H5陽性。事實上，我們試圖自鵪鶉不同器官中分離病毒，但未成功。2株H9陽性病毒HA與NA均通過RT-PCR擴增出特異目的條帶，進一步確定為H9N2流感病毒。

同源性分析表明，Qa/LC02/08HA基因與山東1999年雞源H9N2毒株及浙江2007年雞源H9N2毒株同源性最高，達到99.39%，與2007-2009年浙江、上海、廣西、四川、江西、山東、湖北等地的雞源H9N2HA基因同源性均達到98.7%之上，其NA基因除與山東2010年雞源H9N2 AIV同源性達99%以上外，與2007-2009年山東、河南、江蘇、浙江、福建等地的雞源H9N2HA基因同源性均達到98%之上，表明H9N2 AIV跨地區(qū)傳播迅速，并且可在雞和鵪鶉間進行傳播。Qa/LC02/08HA基因與2007年上海鴨源分離株的同源性也達到了99.08%，其NA基因與2008年臺州豬源H9N2流感病毒的NA基因同源性達到97.87%，這也表明H9N2流感病毒有跨種傳播的能力，也間接地說明鵪鶉可以充當中間宿主的角色，既能感染禽源流感病毒又能感染哺乳動物源流感病毒，并將它們在其體內(nèi)發(fā)生重配，起到流感病毒混合器的作用，有可能引起哺乳動物及人類的流感大流行。

Qa/LC01/11的HA基因與同年在河北、江蘇、山東、河南、山西等地雞源H9N2 AIV的同源性非常高，達到99.3%，其NA與2010-2013年河北、山東、天津、北京等地的雞源H9N2 AIVNA基因同源性達到98.67%之上，但其HA和NA基因均與河北本地的雞源分離株A/Chicken/Hebei/FL/2011(H9N2)的同源性最高，分別為99.6%和99.7%，進一步說明雞與鵪鶉可以相互傳播流感病毒，而且能夠在流行地區(qū)形成本地流行毒株在家禽中穩(wěn)定流行，因此，及時對家禽進行流感病毒監(jiān)測是防控禽流感的重要環(huán)節(jié)。另外，Qa/LC01/11的NA基因又與2008年豬源分離株A/Swine/Hebei/012/2008(H9N2)、雞源分離株A/Chicken/Hebei/7/2008(H9N2)及A/Chicken/Hebei/4/2008(H9N2)的同源性均為96.97%，同樣也說明鵪鶉可以同時感染禽源及哺乳動物源流感病毒，甚至引起基因重組而產(chǎn)生新的流感病毒。對鵪鶉流感病毒具有重要公共衛(wèi)生意義。

此外，我們在雞胚傳代過程中發(fā)現(xiàn)，用未經(jīng)稀釋的高滴度病毒尿囊液原液接種SPF雞胚所收獲的下一代雞胚尿囊液的HA滴度降低，這可能與病毒傳代過程中產(chǎn)生大量的缺陷型干擾(Defective interfering，DI)病毒有關(guān)。這與Von Magnus用未稀釋的流感病毒通過雞胚連續(xù)傳代時發(fā)現(xiàn)了不完整的或沒有感染力的DI病毒相一致[14]。在傳代過程中將上一代病毒尿囊液稀釋為4單位病毒再接種雞胚尿囊腔，收獲的下一代病毒尿囊液的HA滴度則明顯升高。故應(yīng)避免使用未加稀釋的高滴度病毒尿囊液接種雞胚，否則因產(chǎn)生大量DI病毒而導(dǎo)致流感病毒HA滴度大幅下降[1,14-15]。