高曉龍，范勝濤，李勝楠，國 嬌，王愛榮，孫偉洋，李 雪，虞一聰，王鐵成，李元果，桑曉宇，于志君，張 坤，高玉偉，夏咸柱*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部動物流感重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150001；2.軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，吉林長春 130062)

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)屬于正粘病毒科，為單股負鏈RNA 病毒，其基因組包括8個片段分別為PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS，至少編碼11 種蛋白質(zhì)[1]。根據(jù)其表面蛋白血凝素(Hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，NA)，AIVs 可分為16 個HA 亞型和9 個NA 亞型[2]。AIVs 可以感染包括人、豬、馬、貂、海洋哺乳動物、家禽和野生鳥類在內(nèi)的多種動物。目前為止，禽流感病毒所有亞型(H1～H16，N1～N9)均在野鳥中分離得到，因此野生鳥類尤其是雁形目(鴨、鵝)和鸻形目(鷗類、水鳥)為AIVs 的自然宿主[3]。

自從1977 年從美國沿海地區(qū)鷗類糞便中分離到第1 株H13 亞型AIV[4]，之后有關H13 亞型AIVs 分離的報道較少，這主要與H13 AIVs 的宿主特異性有關，其宿主為鷗類和鴨類等水禽，其他禽類中從未檢測到。2013 年秋季，從大連莊河地區(qū)采集的野鴨糞便樣品中首次分離到國內(nèi)H13N6 亞型低致病性AIV，并對其核苷酸序列同源性以及致病力和傳播能力等生物學特性進行分析。

1 材料和方法

1.1 病毒株及主要實驗材料 病毒分離株A/mallard/Dalian/DZ-137/2013(H13N6)由本實驗室分離保存；SPF 雞胚和豚鼠均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；SPF 雞購自北京梅里亞實驗動物技術有限公司；BALB/c 小鼠購自長春市億斯實驗動物技術有限責任公司。

1.2 主要試劑 病毒RNA 提取試劑盒購自BioFlux公司；AMV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega 公司；高保真DNA 聚合酶購自全式金公司。

1.3 病毒的增殖及雞胚半數(shù)感染量(EID50)測定 將AIV 分離株經(jīng)有限稀釋后采用9 日齡SPF 雞胚純化3 代，進行病毒增殖。增殖后的H13N6 亞型AIV 按10 倍倍比稀釋，每個稀釋度接種3 個SPF 雞胚，每個雞胚接種100 μL，37 ℃培養(yǎng)48 h 后，收取尿囊液測其血凝性，根據(jù)Reed-Muench 方法計算EID50。

1.4 病毒的分離鑒定 將樣品接種9 日齡SPF 雞胚，37 ℃孵化72 h，取尿囊液進行血凝試驗，取200 μL 具有血凝性的病毒尿囊液，按照RNA 提取試劑盒使用說明書提取病毒RNA，然后按照AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明進行反轉(zhuǎn)錄，制備cDNA。PCR 方法鑒定AIV，參照農(nóng)業(yè)部標準NY/T 772-2004 AIV 通用引物：(1)M-F：TTCTAACCGAGGTCGA AAC；M-R：AAGCGT CTACGCTGCAGTCC，擴增目的片段大小為229 bp；(2)NP-F：CAGRTACTGG GCHATAAGRAC；NP-R：GCATTGTCTCCGAAGA AATAAG，擴增目的片段大小為330 bp。根據(jù)Kenji Tsukamoto 等設計的分型引物對AIV 分離株進行分型[5]。

1.5 AIV亞型全序列測序分析 根據(jù)GenBank 中H13N6 亞型AIV 各基因片段同源性最高的序列設計PCR 引物，對該分離株進行全序列擴增，并送由吉林省庫美生物科技有限公司測序。利用DNAStar 軟件包中SeqMan 軟件對所測定的H13N6 分離株全基因序列進行拼接；采用MEGA6.0 軟件中Neighborjoining 方法構建基因序列系統(tǒng)進化樹，Bootstrap 值設定為1 000。

統(tǒng)計截止到2011 年提交到全球流感共享數(shù)據(jù)庫(the Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data，GISAID)的H13 亞型AIVs 分布地區(qū)以及宿主信息。

1.6 小鼠、豚鼠以及SPF雞致病性分析

1.6.1 小鼠致病性試驗 選取9 只8 周齡雌性BALB/c 小鼠乙醚麻醉后，每只小鼠鼻腔接種106EID50/100 μL 病毒稀釋液50 μL，每隔24 h 記錄小鼠體重變化，并于攻毒后3 d、5 d 分別迫殺3 只小鼠，取其腦、鼻甲骨、肺等組織樣品，測其病毒滴度，攻毒后14 d 采集血清，測其抗體水平。

1.6.2 豚鼠傳播試驗 選取6 只雌性體質(zhì)量300 g～350 g SPF 級豚鼠分組試驗，其中3 只豚鼠為接種組，每只豚鼠每個鼻孔接種106EID50/300 μL 的病毒稀釋液150 μL，24 h 后將接觸組3 只豚鼠與接種組豚鼠同籠，分別于接種后2 d、4 d、6 d、8 d、10 d采集豚鼠鼻洗液1 mL，測其病毒滴度。

1.6.3 SPF 雞致病性試驗 按每只雞106EID50/100 μL病毒經(jīng)鼻腔感染接種組8 只6 周齡SPF 雞，24 h 后將另外2 只SPF 雞與接種組同籠。攻毒后第3 d 迫殺2 只接種組雞，取其腦、心、肺、氣管、肺、肝、胃、十二指腸、腎、盲腸扁桃體等組織樣品；并且分別采集接種后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d 泄殖腔和喉頭拭子樣品，并將其接種雞胚進行病毒滴定。

2 結果

2.1 AIV鑒定及序列分析 該分離株病毒經(jīng)PCR鑒定為H13N6 亞型AIV。序列分析顯示，H13N6 亞型AIV 分離株HA 基因核苷酸編碼區(qū)為1 701 bp，編碼567 個氨基酸，與A/duck/Hokkaido/WZ68/2012(H13N2)核苷酸同源性為97 %，堿性裂解位點區(qū)序列為PAISNR↓G 含有1 個堿性裂解位點，具有低致病性AIV 典型特征，含有8 個潛在糖基化位點，并且其226 位點(H3 numbering)為Q，表明該病毒具有禽樣受體結合特性分子標記；NA 核苷酸編碼區(qū)為1 413 bp，編碼471 個氨基酸，與A/glaucouswinged gull/Southeastern Alaska/9JR0822R0/2009(H13N6)核苷酸同源性為96%，莖部未發(fā)現(xiàn)氨基酸缺失(表1)。

2.2 遺傳進化及統(tǒng)計分析 該分離株NA 基因?qū)儆诒泵雷V系，其余7 個基因片段均屬于歐亞譜系；其中NA、PB2、PB1、PA 基因可能來源于野鴨，而HA、NP、M、NS 基因可能來源于鷗類(圖1，圖2，表2)。

統(tǒng)計分析GISAIP 的H13 亞型AIV 數(shù)據(jù)顯示，1985 年～1996 年H13 亞型AIVs 分離數(shù)量少，但呈增長趨勢，而且除大洋洲和南極洲以外呈全球分布，分離宿主80 %為鷗類，其次8 %病毒株分離自水鳥，雁鴨類和水鳥各占5 %。鯨魚樣本分離株僅占2 %，尚未從除鯨魚以外的哺乳動物和陸生家禽中分離到該亞型(圖3)。

表1 H13N6 AIV 分子特性分析Table 1 Molecular analysis of H13N6 AIV

圖1 H13N6 亞型AIV HA 基因遺傳進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of HA gene of H13N6

圖2 H13N6 亞型AIV NA 基因遺傳進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of NA gene of H13N6

表2 H13N6 亞型AIV 譜系分析Table 2 Lineage analysis of H13N6

圖3 1977 年～2011 年各地區(qū)H13 亞型AIV 分離數(shù)量及宿主分布Fig.3 The amount of the H13 AIVs in different areas from 1977-2011 and the host of the H13 AIVs are shown

2.3 病毒對小鼠、豚鼠、雞的感染性試驗 H13N6 AIV 分離株接種BALB/c 小鼠后未觀察到精神不振、弓背、豎毛、體重下降等明顯臨床癥狀，并且其腦、肺、鼻甲骨等組織未檢測到病毒，但均檢測到較低抗體水平(抗體滴度1∶10)；感染豚鼠后，均未從接種組和接觸組鼻洗液中檢測到病毒；感染SPF雞后均無明顯臨床癥狀，雖未從感染雞和同居雞喉頭拭子和泄殖腔拭子檢測到病毒，但攻毒后14 d 其中2 只接種雞有較低抗體水平(抗體滴度1∶20)，接觸組雞血清未檢測到H13N6 抗體。感染雞腦、氣管、肺、心臟、肝、腎、胃、十二指腸、盲腸扁桃體等臟器中同樣也未檢測到該病毒。

3 討論

本研究分離到的H13N6 亞型AIV 系我國首次分離得到，序列分析表明其HA 蛋白的186 位點為纈氨酸(V)[6]、226 位點為谷氨酰胺(Q)、228 位點為絲氨酸(S)，由于H13 亞型AIVs HA 蛋白228 位自然存在的為絲氨酸，所以其受體結合特性不會發(fā)生改變，仍然只能結合禽SAa-2,3Gal 受體；NA 莖部缺失具有改變宿主嗜性、增強病毒復制的能力[7]，該分離株NA 莖部未發(fā)現(xiàn)缺失；PB2 蛋白627 和701位點均未發(fā)生E627K、D701N[8]突變表明其尚未獲得感染哺乳動物的能力，與小鼠致病性試驗結果一致。1977 年～2011 年全球分離H13 亞型AIVs 毒株統(tǒng)計結果表明，H13 亞型分離株均分離于野生水禽、鯨以及環(huán)境樣本，未從陸生家禽中分離到該亞型AIV。以上分析表明H13N6 分離株尚未獲得由野生水禽向陸生家禽和哺乳動物進行跨種傳播的能力，雖然其能夠感染雞，但其不能在雞體內(nèi)進行有效復制，并且不能通過呼吸道和消化道排毒。

候鳥在全球有8 條主要遷徙路線，其中有3 條經(jīng)過我國，因此候鳥在我國AIVs 傳播過程中發(fā)揮重要的作用[9]。隨著H13 亞型AIVs 在全球不同地區(qū)野生水禽中感染數(shù)量不斷增加，由最初的歐亞和北美地區(qū)逐步向南美和非洲地區(qū)傳播。歐亞譜系和北美譜系不同AIVs 之間能通過野生水鳥遷徙進行跨洲際傳播，繼而引起AIVs 不同譜系間發(fā)生重組。遼寧省大連地區(qū)位于東亞-澳大利亞路線遷徙路線內(nèi)，同時該地區(qū)也是北美地區(qū)和歐亞地區(qū)候鳥繁殖地，為病毒傳入該地區(qū)和不同地區(qū)間病毒重組創(chuàng)造了有利條件。我國首例H13N6 亞型AIV 株的分離表明，野生鳥類在AIV 跨洲際和種間傳播中發(fā)揮了重要作用，因此應該加強野生鳥類中AIVs 的監(jiān)測和流行病學調(diào)查。

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