王 建，張維誼，鞠厚斌，楊德全，劉 健，周錦萍，袁世山，劉佩紅*

(1.上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103；2.中國農(nóng)業(yè)科學院 上海獸醫(yī)研究所，上海 200232)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，俗稱“藍耳病”，是由PRRS 病毒(PRRSV)引起的一種高度接觸性傳染病，主要臨床表現(xiàn)為妊娠母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎以及仔豬和育肥豬的呼吸道癥狀[1]。我國1995 年底暴發(fā)該病，目前PRRSV 在中國豬群中感染率高，已造成嚴重的經(jīng)濟損失[2]。2006 年始于南方各省進而蔓延全國的以高熱為特征的高致病性PRRS(HP-PRRS)的暴發(fā)流行，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了沉重的打擊[3-6]。為了解PRRS 的疫情動態(tài)和趨勢，本研究于2004 年～2012年在上海及周邊地區(qū)采集健康豬內(nèi)臟、血清以及發(fā)病豬內(nèi)臟樣品進行檢測，并對發(fā)病豬病例進行回顧調(diào)查，進而研究上海地區(qū)PRRS 的臨床特征、剖解變化、時間分布以及混合感染等情況，為PRRS 的防控提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病例回顧、調(diào)查、剖檢 通過對2004～2012年上海及江蘇、浙江等周邊地區(qū)發(fā)病豬病例回顧調(diào)查，了解PRRS 的臨床特征、剖解病變特征及繼發(fā)疾病等情況，開展縱向跨年度的PRRS 的流行病學調(diào)查。

1.2 樣品采集 無菌采集來自上海及周邊地區(qū)散養(yǎng)戶或規(guī)模養(yǎng)豬場病豬內(nèi)臟病料樣品(肺臟、脾臟、頜下淋巴結(jié))1 499 份，發(fā)病豬主要為保育和育肥豬，部分為母豬和流產(chǎn)胎兒。屠宰場健康豬內(nèi)臟樣品(肺臟、脾臟、頜下淋巴結(jié))130 份、健康豬血清126 份及疑似PRRS 豬血清54 份。詳見表1。

表1 樣品背景情況Table 1 The samples background from 2004-2012

1.3 主要試劑 TRIzol 試劑購自Sigma 公司；Columbia 血瓊脂購自Oxoid 公司；GNI、GPI VITEK細菌鑒定卡購自Bio Merieuxsa 公司；PRRSV 通用型、HP-PRRSV、豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒(PCV)熒光PCR 檢測試劑盒均購自北京生科尚儀科技有限公司；PRRS 美洲型和歐洲型核酸檢測分型試劑購自美國ABI 公司；豬肺炎支原體熒光PCR 試劑盒購自北京海森通生物科技有限責任公司；豬鏈球菌熒光PCR 檢測試劑盒購自法國LSI 公司。

1.4 樣品處理及核酸提取 將1 g 內(nèi)臟組織樣品加入1 mL PBS 緩沖液充分研磨，離心后取上清液，按照試劑盒說明書采用TRIzol 試劑提取總RNA。

1.5 細菌分離與鑒定 將無菌采集的豬內(nèi)臟(肺臟、脾臟、頜下淋巴結(jié))劃線接種于Columbia 血瓊脂及巧克力平板，5 % CO236 ℃培養(yǎng)24 h，挑取可疑菌落涂片鏡檢并純培養(yǎng)。對分離的細菌純培養(yǎng)物按照細菌鑒定卡操作規(guī)程進行操作，并在VITEK 2 Compact 全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)上讀取細菌鑒定結(jié)果。疑似副豬嗜血桿菌及胸膜肺炎放線桿菌的菌落參照文獻[7-8]的方法進行PCR 檢測。

1.6 PCR 檢測 采用商品化試劑盒對通用型PRRSV、HP-PRRSV、CSFV、PRV、PCV、豬肺炎支原體、豬鏈球菌等進行PCR 檢測及結(jié)果判定。其中PRRSV 通用型檢測試劑盒針對ORF5 基因設計特異性引物和探針，而HP-PRRSV 檢測試劑盒針對NSP2 基因設計特異性引物和探針。

2 結(jié)果

2.1 樣品檢測結(jié)果 對采集樣品進行PCR 檢測，結(jié)果顯示，發(fā)病豬的PRRSV 陽性率為34.56 %(518/1 499)，其中2009 年陽性率明顯高于其他年份，為53.69 %，2008 年檢測數(shù)量最多，陽性數(shù)為182 份。2006 年首次檢測到HP-PRRSV，以后每年均檢測到HP-PRRSV，在PRRS 病例中HP-PRRSV共226 株，占陽性PRRSV 的43.63 %(175 株來自江浙地區(qū)，51 株來自上海6 個區(qū)縣)，HP-PRRSV 陽性率呈逐年上升的趨勢，2012 年HP-PRRSV 陽性率升至64 %(表2)。對PRRS 陽性樣品的月份分布進行分析，結(jié)果顯示：每個月均檢測到陽性PRRS 病例，陽性率較高的月份相對集中在5 月份～9 月份，占全年56.59 %(圖1)。對所有的PRRSV 陽性樣品進行美洲型和歐洲型分型檢測，結(jié)果顯示均為美洲型，未檢測到歐洲型PRRSV。

130 份健康豬內(nèi)臟樣品中PRRS 陽性率為4.62 %(6/130)，健康豬血清126 份均為陰性，疑似PRRS豬血清樣品中PRRSV 抗體陽性率為7.41 %(4/54)。

表2 2004～2012 年P(guān)RRSV 檢測結(jié)果Table 2 PRRSV test results from 2004-2012

圖1 PRRS 陽性病例月份分布情況Fig.1 PRRS-positive cases monthly distribution

2.2 混合感染情況 對518 例PRRS 陽性病例進行PCR 檢測與細菌分離鑒定，結(jié)果顯示：PRRS 病征復雜，88.8%為混合感染，多與PCV、PRV、CSFV、豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌等形成多重感染，其中與PCV 混合感染率最高，占臨床發(fā)病數(shù)的40.15%，其次為豬鏈球菌(31.66%)、副豬嗜血桿菌(20.66 %)等，在混合感染中以二重混合為主，占54.44 %，其次是三重感染，為24.9%，多重感染可達四重，占5.41 %。詳見表3。

表3 518 例PRRS 陽性病例中的疾病感染情況Table 3 518 positive PRRS-positive cases

2.3 臨床癥狀及病理剖檢 對518 例PRRS 臨床病例進行分析，發(fā)病豬以哺乳仔豬和保育豬高熱、呼吸障礙最常見，分別占34.17 %和26.06 %，其次為育肥豬高熱、呼吸障礙(19.31 %)，母豬繁殖障礙(11.58 %)，神經(jīng)癥狀(6.37 %)和腸炎(2.51 %)病例比較少見。其中2012 年母豬繁殖障礙病例數(shù)所占比例明顯上升，占到全年P(guān)RRS 病例的24 %(圖2)。

圖2 2004 年～2012 年對PRRS 陽性病例回顧調(diào)查Fig.2 Retrospective survey of PRRS-positive cases from 2004 to 2012

對PRRS 陽性病例回顧調(diào)查顯示：PRRS 可以通過多種途徑傳播，但呼吸道仍是該病的主要感染途徑，也可通過精液傳播而感染。各年齡段的豬均可發(fā)病，發(fā)病大都在每年的夏秋季節(jié)，發(fā)病率高，死亡率隨病程和繼發(fā)感染的嚴重程度不同而異。主要表現(xiàn)為高熱、食欲下降、呼吸困難、部分妊娠母豬流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎，此外，還存在神經(jīng)癥狀、腹瀉等消化道癥狀。因年齡不同，臨床表現(xiàn)也具有較大的差異。

PRRS 的病理變化不太明顯，外觀偶爾可見個別母豬被毛粗，耳、外陰和腹部發(fā)紺，真皮內(nèi)形成色斑、水腫和壞死。主要病變見肺彌漫性間質(zhì)性肺炎，并伴有細胞浸潤和卡他性肺炎區(qū)。流產(chǎn)的胎兒及弱仔剖檢，可見胸腔內(nèi)積有大量清亮液體，偶見肺實變。

3 討論

本研究通過對2004～2012 年發(fā)病豬病例回顧調(diào)查和臨床檢測，分析了上海地區(qū)PRRS 的流行情況。上海地區(qū)自2006 年5 月開始檢測到HP-PRRSV，2009 年以后HP-PRRSV 成為優(yōu)勢病毒株。所有檢測到的陽性PRRSV 均為美洲型，未檢測到歐洲型。據(jù)田克恭報道，在中國大陸的7 個省8 個種豬場檢測到歐洲型PRRSV[9]，而在商品豬中目前尚未檢出歐洲型PRRSV 的報道，因此歐洲型PRRSV 可能來源于引種。帶毒的母豬是豬場的主要傳染源，HP-PRRSV 在豬場的循環(huán)感染和傳播是造成哺乳仔豬、保育豬和生長育肥豬發(fā)病的主要原因，帶毒的后備種豬因流通和種豬交易而造成HP-PRRSV 的擴散。臨床上，HP-PRRSV 感染仍然以發(fā)熱、呼吸道癥狀、母豬流產(chǎn)為主。此外，還可見到神經(jīng)癥狀、腹瀉等消化道癥狀。中、小型豬場和散養(yǎng)戶因缺乏必要的生物安全措施，不能夠阻斷HP-PRRSV 的傳播，疫情發(fā)生較為頻繁，加之豬群發(fā)病后處置不當，大量使用抗生素和不科學地免疫接種，時常造成發(fā)病豬群的高死亡率。

本研究調(diào)查結(jié)果顯示，PRRS 陽性病例中，有88.8 %為混合感染，并且病征復雜。PRRSV 在體內(nèi)的感染和大量復制導致機體免疫調(diào)節(jié)發(fā)生紊亂，導致繼發(fā)感染，并加速PRRS 或其他疾病的進程[10-12]；另一方面，PRRSV 也能夠刺激機體產(chǎn)生保護性免疫，使動物免受再次感染，尤其免受同源病毒的攻擊，所以PRRSV 感染易造成持續(xù)性感染，機體可長期帶毒[10-12]。臨床上，疫苗免疫仍是有效防控PRRS 的措施之一，根據(jù)農(nóng)業(yè)部要求，2007 年上海開始推行HP-PRRS 疫苗強制免疫政策，并積極開展疫苗效果評估和流行病學調(diào)查等相關(guān)科研的研究。2009 年上海地區(qū)開始普遍使用HP-PRRS 弱毒疫苗，PRRSV臨床檢出率由2009 年的53.69 %逐年下降，2012 年已下將至22.3 %，控制效果較好，但由于我國PRRS 疫苗復雜，種類繁多，目前已有多種商品化的PRRS 活疫苗投放應用到養(yǎng)豬生產(chǎn)，所有的疫苗在上海地區(qū)豬場均有流通，這給豬場在疫苗的選擇和使用上帶來了極大的困惑，并且可能會增加疫情的復雜性，還可能會影響到其他重要疫病(如豬瘟)的疫苗免疫防控效果。因此，需要國家相關(guān)部門引起重視，加強對疫苗質(zhì)量和使用層面的監(jiān)管和技術(shù)指導。

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