李華芳，曹 俊，劉松艷，陳利蘋，劉思國(guó)

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物細(xì)菌病研究室，黑龍江 哈爾濱 150001)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群引起的各種疾病的總稱。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群包括人結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MT)、牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis，MB)、非洲分枝桿菌(Mycobacterium african，MA)和其他的分枝桿菌[1]。結(jié)核病為一種慢性消耗性人畜共患病，對(duì)人類和動(dòng)物的健康造成嚴(yán)重的威脅。

rv0394c 基因?yàn)橹虏⌒苑种U菌核心基因之一，通過(guò)生物學(xué)信息分析發(fā)現(xiàn)該基因存在于MT、MB 和MA 等致病性分枝桿菌中，而在其他非致病性分枝桿菌如恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis，MS)中并不存在。因此提示rv0394c 基因可能與分枝桿菌的致病性相關(guān)。通過(guò)生物學(xué)信息軟件分析發(fā)現(xiàn)該蛋白含有跨膜區(qū)，預(yù)測(cè)RV0394c 蛋白可能為一種分泌型蛋白。同時(shí)相關(guān)報(bào)道顯示該蛋白具有透明質(zhì)酸酶的活性[2]，在細(xì)胞間質(zhì)和肺泡上皮細(xì)胞表面存在大量透明質(zhì)酸，推測(cè)透明質(zhì)酸酶的功能可能與分枝桿菌對(duì)上皮細(xì)胞的粘附具有一定的關(guān)系[3]。為制備具有生物活性和天然狀態(tài)的RV0394c 蛋白，本研究將rv0394c 基因在同屬的MS 中進(jìn)行表達(dá)。并鑒定蛋白以及重組菌對(duì)肺泡上皮細(xì)胞的粘附特性，證明了RV0394c 蛋白為一種粘附蛋白，為進(jìn)一步研究RV0394c 蛋白在致病性中的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株、載體及蛋白 結(jié)核分枝桿菌H37Rv 菌株購(gòu)自中國(guó)生物制品監(jiān)察所；人的肺泡上皮細(xì)胞(A549)購(gòu)自ATCC；大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒pMV262 及MS 菌株MC2155 由北京結(jié)核研究所黃海榮教授饋贈(zèng)；大腸桿菌DH5α 感受態(tài)菌購(gòu)自天根生化科技有限公司；大腸桿菌中表達(dá)純化的RV0394c 重組蛋白(rRV0394c)由本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶及Pfu DNA 聚合酶均購(gòu)自Fermentas 公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)自O(shè)MEGA 公司；羊抗鼠IgG-FITC 和山羊抗鼠IgG-DyLightTM均購(gòu)自Sigma 公司；抗His 標(biāo)簽單克隆抗體(MAb)購(gòu)自Novagen 公司。

1.3 RV0394c蛋白對(duì)A549細(xì)胞的粘附試驗(yàn) A549細(xì)胞在6 孔板培養(yǎng)12 h 后，棄培養(yǎng)液，PBS 洗3次，加入100 μL rRV0394c(1 μg/μL)，37 ℃作用1 h，PBS 洗3 次，洗去未粘附的重組蛋白。以80 %預(yù)冷的丙酮固定10 min，PBS 洗3 次，以抗RV0394c MAb(1∶100)為一抗，羊抗鼠IgG-FITC(1∶100)為二抗，同時(shí)以來(lái)源于分枝桿菌的其他無(wú)關(guān)蛋白(RV3295)和對(duì)應(yīng)的MAb 作為對(duì)照組。在共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.4 重組質(zhì)粒p262-sec的構(gòu)建 根據(jù)GenBank 中登錄的rv0394c 基因序列(NC_000962.3)，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增rv0394c 基因的上下游引物(5'-CTAGG ATCCGACTGAGCCCAGACCTGTCTTC-3'/5'-GCAGA ATTCCTCGACGTGGACGGGTGCG-3')，預(yù)擴(kuò)增片段為680 bp，由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司合成。以H37Rv 基因組DNA 為模板，采用Pfu DNA 聚合酶經(jīng)PCR 擴(kuò)增rv0394c 基因。反應(yīng)體系為50 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃3 min；95 ℃30 s、64 ℃30 s、72 ℃1.0 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將擴(kuò)增的rv0394c 基因經(jīng)Bam HⅠ和Eco RⅠ雙酶切后，克隆于pMV262 質(zhì)粒中，構(gòu)建大腸桿菌-分枝桿菌穿梭重組表達(dá)質(zhì)粒p262-sec，并由華大基因科技公司測(cè)序鑒定。

1.5 p262-sec/MS重組菌的構(gòu)建 將鑒定正確的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入MS 感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)25 μg/mL卡那霉素平板篩選陽(yáng)性克隆，接種于含終濃度25 μg/mL 卡那霉素的7H9 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后提取重組質(zhì)粒，MS 為革蘭氏陽(yáng)性菌，細(xì)胞壁較厚，在提取質(zhì)粒時(shí)利用電動(dòng)研磨器研磨，溶菌酶處理，以便菌體的裂解，其他提取質(zhì)粒步驟同質(zhì)粒小提試劑盒。重組質(zhì)粒用Bam HⅠ和Eco RⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.6 重組蛋白的表達(dá)和檢測(cè) 將鑒定正確的重組菌在含有25 μg/mL 卡那霉素的7H9 培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)48 h 后，45 ℃熱激30 min。集菌超聲破碎。離心后分別取上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分離，以抗His MAb(1∶2 000)為一抗，IgG-DyLightTM(1∶10 000)為二抗，進(jìn)行western blot 檢測(cè)。

1.7 重組菌對(duì)A549細(xì)胞的粘附和粘附阻斷試驗(yàn)按常規(guī)方法培養(yǎng)重組菌p262/MS 和p262-sec/MS，培養(yǎng)至OD600nm值為0.6。經(jīng)稀釋后分別以感染復(fù)數(shù)為10 的接種劑量加入到A549 細(xì)胞單層中(在粘附阻斷實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞與rRV0394c 蛋白在37 ℃預(yù)作用20 min)。于37 ℃，5 % CO2，作用6 h 后，洗滌3 次，洗去未粘附的菌體，利用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，反復(fù)吹打充分分散細(xì)胞，稀釋后涂板，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 rRV0394c蛋白對(duì)A549細(xì)胞的粘附特性鑒定rRV0394c 蛋白與A549 細(xì)胞在37 ℃作用1 h 后，以抗RV0394c MAb 為一抗，羊抗鼠IgG-FITC 為二抗，實(shí)驗(yàn)組在激光共聚焦顯微鏡下顯示明顯的綠色熒光，而對(duì)照組無(wú)綠色熒光(圖1)，表明rRV0394c 蛋白可以與A549 細(xì)胞發(fā)生特異性粘附。

圖1 rRV0394c 蛋白對(duì)A549 細(xì)胞的粘附Fig.1 Adhesion of rRV0394c to A549 cells

2.2 重組質(zhì)粒p262-sec的構(gòu)建及鑒定 利用PCR技術(shù)，以結(jié)核分枝桿菌強(qiáng)毒株H37Rv 基因組DNA為模板擴(kuò)增rv0394c 基因，結(jié)果顯示目的基因大約為700 bp，與預(yù)期相符(圖2)。rv0394c 基因通過(guò)酶切處理后克隆至pMV262 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒p262-sec，經(jīng)由華大基因測(cè)序鑒定插入片段為680 bp，與預(yù)期結(jié)果一致。

圖2 rv0394c 基因的PCR 結(jié)果Fig.2 Amplification of rv0394c gene by PCR

2.3 p262-sec/MS重組菌的檢測(cè) 將鑒定正確的重組質(zhì)粒p262-sec 電轉(zhuǎn)化入MS，在MS 中提取重組質(zhì)粒，雙酶切鑒定，結(jié)果可獲得約680 bp 的目的片段，與預(yù)期結(jié)果一致。挑取鑒定正確的單克隆重組菌，利用抗His 標(biāo)簽的MAb 檢測(cè)重組菌中蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖3 所示，重組菌的裂解上清液可檢測(cè)到目的蛋白，大小約25 ku，目的蛋白呈可溶性表達(dá)。

圖3 重組菌蛋白表達(dá)的western blot 檢測(cè)Fig.3 Detection of the protein expression by western blot

2.4 重組菌對(duì)A549細(xì)胞的特異性粘附和粘附阻斷試驗(yàn)結(jié)果 將重組菌p262/MS 和p262-sec/MS 分別與A549 細(xì)胞感作后，收集細(xì)胞涂板后計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示含有外源目的基的重組菌(p262-sec/MS)粘附特性與空載體(p262/MS)相比具有顯著性差異，并且這種粘附特性可被rRV0394c 蛋白阻斷(圖4)，表明重組菌p262-sec/MS 可以特異性粘附于A549 細(xì)胞表面。

圖4 重組菌的粘附和粘附阻斷Fig.4 Adhesion and adhesion inhibition of recombinant bacteria

3 討論

目前結(jié)核病仍是危害人類和動(dòng)物的重大傳染病之一，尤其是近年來(lái)隨著多重耐藥分枝桿菌的出現(xiàn)以及與病毒的混合感染，使得對(duì)結(jié)核病的治療變得困難[4-6]。因此，研究結(jié)核病的致病機(jī)理，研發(fā)新型高效的結(jié)核病疫苗就顯得尤為重要。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用分枝桿菌表達(dá)系統(tǒng)—MS，它屬于快生長(zhǎng)型分枝桿菌，生長(zhǎng)周期相對(duì)較短，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，并且與結(jié)核分枝桿菌在進(jìn)化上有相近親緣關(guān)系，采用該系統(tǒng)表達(dá)結(jié)核分枝桿菌的蛋白更容易獲得具有天然構(gòu)象的、有生物功能活性的目的蛋白。因此這一表達(dá)系統(tǒng)的成功構(gòu)建為后續(xù)研究其他相關(guān)基因蛋白的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

目前為止，本實(shí)驗(yàn)室前期研究證明RV0394c 蛋白為一種具有透明質(zhì)酸酶活性的蛋白[2]，通過(guò)生物學(xué)信息分析發(fā)現(xiàn)表達(dá)該蛋白的基因僅存在于致病性的分枝桿菌中，推測(cè)該基因可能與分枝桿菌的致病性相關(guān)[7-10]，因此本實(shí)驗(yàn)利用大腸桿菌表達(dá)的RV0394c重組蛋白，以A549 細(xì)胞為細(xì)胞模型進(jìn)行了粘附試驗(yàn)，結(jié)果顯示該蛋白可能參與了結(jié)核分枝桿菌對(duì)A549 細(xì)胞的粘附過(guò)程。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一試驗(yàn)結(jié)果，將該基因轉(zhuǎn)入非致病性的MS 中，構(gòu)建可以表達(dá)天然構(gòu)像的RV0394c 蛋白的重組菌。將重組菌與A549 細(xì)胞進(jìn)行粘附和粘附阻斷，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明引入rv0394c 基因的重組菌與對(duì)照組相比，對(duì)A549 細(xì)胞粘附作用顯著提高。這一結(jié)果證明該蛋白參與了結(jié)核分枝桿菌對(duì)肺泡上皮細(xì)胞的粘附過(guò)程，是結(jié)核分枝桿菌新發(fā)現(xiàn)的粘附蛋白，為進(jìn)一步研究RV0394c蛋白在結(jié)核分枝桿菌致病性中的作用提供了依據(jù)。

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