董 慧，張 鑫，陳建飛，時洪艷，石 達，常鐵城，谷鳳麗,4，徐 天，王智琴，馮 力*

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110161；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/豬傳染病研究室，黑龍江 哈爾濱 150001；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；5.首都醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069)

豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV)屬于套式病毒目，冠狀病毒科，α-冠狀病毒屬，為引起仔豬病毒性腹瀉的病原之一[1]，由其引起的豬傳染性胃腸炎(TGE)以嘔吐、嚴(yán)重腹瀉和對2 周齡以內(nèi)仔豬的高度致死為特征。冠狀病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白具有多種功能，其中包括參與RNA 轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白合成、加工和修飾以及病毒復(fù)制、感染宿主等功能。TGEV NSP5 蛋白為蛋白水解酶，大小為27 ku～34 ku，因其與微小RNA病毒3C 蛋白酶具有相似的識別位點而被稱為3C 樣蛋白酶(3C-like proteinase，3CLpro)。3CLpro 可以結(jié)合ORF1ab 上的11 個保守的Q-S 二肽位點從而水解產(chǎn)生12 個成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP5～NSP16)。研究表明，不同亞群病毒的3CLpro 底物結(jié)合部位具有很高的保守性，如SARS-CoV 的3CLpro 可以裂解TGEV 的底物[2]。

本實驗通過制備TGEV NSP5 蛋白單克隆抗體(MAb)并對其抗原表位進行鑒定，為TGEV NSP5 蛋白結(jié)構(gòu)及其相關(guān)功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒核酸、細胞及實驗動物 TGEV cDNA、SP2/0 骨髓瘤細胞和ST 細胞由本實驗室保存；大腸桿菌Trans5α 和BL21(DE3)感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；6 周齡～8 周齡BALB/c 小鼠購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心。

1.2 主要試劑 pGEX-6P-1 和pEGFP-C2 載體由本實驗室保存；質(zhì)粒DNA 小量試劑盒購自Axyprep 公司；EndoFree Plasmid Maxi Kit 和Attractene Transfection Reagent 購自QIAGEN 公司；Anti-GFP antibody購自Abcam 公司；弗式完全佐劑、弗式不完全佐劑、PEG1450、HAT 和HT 購自SIGMA 公司；HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG(IgG-HRP)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TMB 購自AMRESCO 公司；MAb亞類鑒定試劑盒SBA ClonotypingTMSystem/HRP 購自Southern Biotech 公司；IRDye700DX?兔抗豬IgG、IRDye700DX?綿羊抗兔IgG 和IRDye700DX?山羊抗鼠IgG 購自本研究所；蛋白質(zhì)Marker 購自Thermo公司。

1.3 TGEV NSP5蛋白的表達及純化 根據(jù)Gen-Bank 中EU074218.2 序列設(shè)計并合成2 對擴增TGEV nsp5 基因的引物，引物序列分別為：上游引物1：5'-GTGGATCCTCAGGTTTACGGAAAATGGC-3'(Bam HⅠ)；下游引物1：5'-GACTCGAGCTGAAG ATTTACACCATAC-3'(XhoⅠ)。上游引物2：5'-GT CTCGAGTCAGGTTTACGGAAAATGGC-3'(Xho Ⅰ)；下游引物2：5'-GAGGATCCCTGAAGATTTACACCA TAC-3'(Bam HⅠ)，引物由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司合成。以TGEV cDNA 為模板，PCR 擴增nsp5基因，將擴增的TGEV nsp5 基因、pGEX-6P-1 和pEGFP-C2 分別用Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切，用T4 DNA 連接酶16 ℃過夜連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEXNSP5 和pEGFP-NSP5。

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX-NSP5 轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達，離心，超聲破碎，分離上清液和沉淀。通過SDS-PAGE 分析重組蛋白(rNSP5-GST)的表達。利用谷胱甘肽樹脂對rNSP5-GST 進行純化，通過SDS-PAGE 分析其純度，超微量分光光度計測定蛋白濃度。

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-NSP5 轉(zhuǎn)化Trans5α 感受態(tài)細胞，用EndoFree Plasmid Maxi Kit 提取重組質(zhì)粒pEGFP-NSP5，按照Attractene Transfection Reagent說明書方法將重組質(zhì)粒pEGFP-NSP5 轉(zhuǎn)染ST 細胞以表達rNSP5-GFP 蛋白。

1.4 重組蛋白的western blot鑒定 以純化的rNSP5-GST 為抗原，抗TGEV 豬陽性血清為一抗，IRDye700DX?兔抗豬IgG(1∶5 000)為二抗，進行western blot 鑒定rNSP5-GST 的抗原性。收集并裂解轉(zhuǎn)染后24 h 的ST 細胞作為抗原，以抗GFP 標(biāo)簽的多抗為一抗，IRDye700DX?綿羊抗兔IgG(1∶5 000)為二抗，進行western blot 鑒定檢測rNSP5-GFP 的表達。

1.5 動物免疫 將純化的rNSP5-GST 蛋白與等體積的弗式不完全佐劑乳化后，按50 μg/只的劑量腹部皮下注射免疫6 周齡～8 周齡BALB/c 小鼠。間隔2 周免疫一次，共免疫3 次，第2 次和第3 次免疫時用rNSP5-GST 蛋白與等體積的弗式完全佐劑進行乳化，50 μg/只。第3 次免疫一周后，斷尾采血，間接ELISA 方法檢測小鼠抗體水平，選擇抗體水平最高的小鼠腹腔注射rNSP5-GST 蛋白50 μg/只加強免疫[3]，3 d 后取脾臟進行細胞融合。

1.6 細胞融合、MAb的制備以及MAb亞類鑒定按照常規(guī)方法進行融合[4]，以純化的rNSP5-GST 蛋白為包被抗原，建立間接ELISA 方法[5-6]，并用GST標(biāo)簽蛋白為包被抗原篩選掉針對GST 標(biāo)簽的雜交瘤細胞株[7]。取雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液進行檢測，抗TGEV NSP5 陽性血清作為陽性對照，未免疫小鼠的血清作為陰性對照。通過有限稀釋法對陽性雜交瘤細胞進行3 次克隆純化，直至篩選結(jié)果100 %為陽性[8]。按照MAb 亞類鑒定試劑盒說明書進行MAb亞類鑒定。

1.7 MAb結(jié)合活性鑒定 以純化的rNSP5-GST 蛋白和GST 標(biāo)簽蛋白為抗原，MAb 為一抗，IRDye 700DX?山羊抗鼠IgG(1∶5 000)為二抗，進行western blot 鑒定；以rNSP5-GFP 蛋白、GFP 標(biāo)簽蛋白及ST 細胞裂解物為抗原，MAb 為一抗，山羊抗鼠IgG-HRP(1∶3 000)為二抗，TMB 顯色后進行western blot 鑒定。

1.8 抗原表位的鑒定 根據(jù)TGEV 的nsp5 基因序列設(shè)計相互部分重疊覆蓋全長基因的5 對引物，每對引物上下游引入Bam HⅠ和XhoⅠ酶切位點。以pGEX-NSP5 為模板，經(jīng)PCR 擴增后將目的片段克隆于表達載體pGEX-6P-1 中構(gòu)建重組質(zhì)粒，分別命名為pGEX-NSP5-(1-5)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達，得到表達的各段多肽大小分別為34 ku(aa1～aa70)、34 ku(aa61～aa130)、34 ku(aa121～aa190)、35 ku(aa181～aa255)、33 ku(aa246～aa302)。以表達的各段多肽為抗原，MAb 為一抗，IRDye700DX?山羊抗鼠IgG(1∶5 000)為二抗，進行western blot 鑒定。對與MAb 反應(yīng)的多肽氨基酸序列繼續(xù)截短表達，設(shè)計相互部分重疊覆蓋該段多肽全長基因的4 對引物，同上述方法表達各段多肽并進行western blot 試驗，初步確定MAb 與NSP5 蛋白的反應(yīng)區(qū)域。

按照初步確定的與MAb 反應(yīng)區(qū)域的多肽氨基酸序列合成4 段多肽，以合成的4 條多肽為包被抗原，MAb 為一抗，山羊抗鼠IgG-HRP(1∶5 000)為二抗，利用間接ELISA 方法精確定位抗原表位序列。

2 結(jié)果

2.1 NSP5蛋白的表達及純化 重組質(zhì)粒pGEXNSP5 經(jīng)Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定得到兩個片段，與預(yù)期大小4 900 bp 和906 bp 相符(圖略)；pEGFP-NSP5 經(jīng)Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定得到兩個片段，與預(yù)期大小4 700 bp 和906 bp 相符(圖略)，測序結(jié)果正確。將pGEX-NSP5 轉(zhuǎn)化BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE 分析結(jié)果顯示，表達的重組蛋白約為60 ku，大小與預(yù)期相符(圖略)。

2.2 重組蛋白的western blot鑒定 western blot 結(jié)果顯示rNSP5-GST 可以與抗TGEV 豬陽性血清產(chǎn)生反應(yīng)，表明其具有良好的抗原性，并且正確表達rNSP5-GFP 和GFP-tag(圖1)。

圖1 原核rNSP5-GST 和真核rNSP5-GFP 細胞表達的重組蛋白western blot 鑒定Fig.1 Identification of the rNSP5-GST and rNSP5-GFP by western blot

2.3 陽性雜交瘤細胞株的制備、亞類鑒定及效價測定 融合后的細胞經(jīng)3 次克隆純化得到一株穩(wěn)定分泌抗TGEV NSP5 蛋白的雜交瘤細胞株，命名為5C3。經(jīng)MAb 亞類鑒定該細胞株分泌抗體類型為IgG1/κ。經(jīng)間接ELISA 方法測定這株陽性雜交瘤細胞上清液和其誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的腹水效價分別為1∶6 400 和1∶105。

2.4 MAb結(jié)合活性鑒定 利用western blot 鑒定MAb 5C3，結(jié)果顯示其與原核表達的rNSP5-GST 蛋白和真核表達的rNSP5-GFP 蛋白呈陽性反應(yīng)，在60 ku 處出現(xiàn)特異性條帶，而與GST 標(biāo)簽蛋白、GFP 標(biāo)簽蛋白和ST 細胞呈陰性反應(yīng)(圖2)，證明MAb 5C3 與原核和真核表達的NSP5 蛋白均具有結(jié)合活性。

2.5 抗原表位的鑒定 將NSP5 蛋白截短為5 段蛋白分別表達，以截短表達蛋白為抗原，MAb 5C3 為一抗，進行western blot 試驗，結(jié)果表明MAb 5C3與第5 段(aa246～aa302)反應(yīng)；將第5 段蛋白繼續(xù)截短為4 段蛋白分別表達，以表達蛋白為抗原，MAb 5C3 為一抗，進行western blot 試驗，結(jié)果表明MAb 5C3 與第4 段(aa276～aa302)反應(yīng)，初步確定MAb 5C3 識別的表位區(qū)為：276TILSYGSLCDEFTPTEVIRQ MYGVNLQ302(圖3)。將第4 段蛋白截為aa276-aa295和aa281～aa302 兩段合成多肽，以合成的多肽為包被抗原，MAb 5C3 為一抗進行間接ELISA 反應(yīng)，結(jié)果顯示MAb 5C3 與aa281～aa302 段多肽反應(yīng)；將aa281～aa302 段多肽繼續(xù)截為aa286～aa300 和aa288～aa302 兩段合成多肽，以合成的多肽為包被抗原，MAb 5C3 為一抗進行間接ELISA 反應(yīng)，結(jié)果顯示MAb 5C3 與aa286～aa300 段多肽反應(yīng)，即MAb 5C3 的表位氨基酸序列為286EFTPTEVIRQMYGVN300(圖4)。

圖2 MAb 結(jié)合活性鑒定Fig.2 Identification of the MAb

圖3 兩次截短表達后抗原表位鑒定western blot 分析Fig.3 Epitope mapping of the TGEV NSP5 with MAb 5C3 by western blot

3 討論

圖4 合成短肽的間接ELISA 分析Fig.4 Analysis of synthetic short peptides by indirect ELISA

TGE 是一種急性、高接觸性腸道傳染病，不同年齡和品種的豬均可感染，在寒冷季節(jié)常呈地方性暴發(fā)流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。隨著3CLpro 蛋白活性位點和結(jié)構(gòu)研究的深入，NSP5 被認為是抗SARS 和其他冠狀病毒藥物研究的重要靶點[9-10]。MAb 作為一種免疫學(xué)工具，在病原的生物學(xué)特性、免疫機制以及病原的預(yù)防治療等方面起著重要的作用。

本實驗中由于rNSP5-GST 蛋白以可溶性的方式表達，因此選擇過柱的方法對融合蛋白進行純化。以純化后的rNSP5-GST 蛋白作為抗原，抗TGEV 豬陽性血清為一抗，western blot 分析表明，rNSP5-GST 蛋白具有良好的抗原性，因而可以用于免疫小鼠及MAb 的篩選。與切膠純化法相比，過柱純化法為非變性純化，避免了對蛋白二級結(jié)構(gòu)的破壞，因而能夠篩選出與真核表達的rNSP5-GFP 蛋白反應(yīng)的MAb。本實驗中先對NSP5 蛋白截短表達，以截短表達的NSP5 蛋白為抗原，MAb 5C3 為一抗進行western blot 試驗，初步確定MAb 5C3 識別的表位區(qū)域，結(jié)果表明MAb 5C3 識別的表位區(qū)為：276TILS YGSLCDEFTPTEVIRQMYGVNLQ302。根據(jù)初步鑒定的表位區(qū)設(shè)計合成多肽，以合成多肽為包被抗原，MAb 5C3 為一抗進行間接ELISA 反應(yīng)，鑒定出TGEV NSP5 蛋白的一個線性表位為：286EFTPTEVIR QMYGVN300。

本研究通過TGEV NSP5 蛋白MAb 的制備及其抗原表位的鑒定，為TGEV NSP5 蛋白結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的進一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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