霍亞飛，許傳田，崔言順，楊少華，黃慶華，張 琳，黃艷艷，李建亮，胡北俠*，張秀美*

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東 濟南 250100；2.山東農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，山東 泰安 271018)

雞傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis，IB)是由禽傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的一類急性、高度接觸性傳染病。IBV 基因組為單股正鏈RNA，長約27.6 kb，基因組5' 端約2.0 kb 為復制酶基因，包含兩個開放性閱讀框(Opening reading frame，ORF)ORF 1a 和1b，分別編碼440 ku 和300 ku 的多聚蛋白，并可以通過核糖體移碼作用產(chǎn)生700 ku 的多聚蛋白1ab。1a 和1ab 多聚蛋白可以水解生成15 種非結構蛋白(Nonstructural proteins，nsps)，在IBV 轉錄與復制中發(fā)揮重要作用[1-2]?；蚪M3' 端編碼4 種結構蛋白-纖突蛋白(Spike，S)、膜蛋白(Membrane，M)、核蛋白(Nucleocapsid，N)和囊膜蛋白(Envelope，E)，此外還編碼4 種非結構蛋白[1]。

目前，進行弱毒活疫苗免疫是防控該病的主要措施之一。由于不斷出現(xiàn)IBV 變異株，對該病的有效防控造成嚴峻挑戰(zhàn)。研究顯示，我國近年來雞群中分離的IBV 株50 %以上為QX 基因型，而目前廣泛應用的Mass 基因型弱毒疫苗株H120 對該類流行株的免疫效果并不理想[3-6]。本實驗室篩選了1 株具有廣泛抗原譜的QX 基因型IBV 株SDZB0808[7]，并通過雞胚連續(xù)傳100 代進行毒力致弱(命名為P100)，初步免疫效力試驗結果顯示P100 對同源和異源QX基因型IBV 流行株具有良好的免疫保護效果(另文報道)。本研究對P100 進行了致病性試驗和全基因組測序，并與其親本強毒株SDZB0808 進行了序列比較，以研究IBV 致弱的主要分子機制。

1 材料和方法

1.1 病毒株、SPF雞胚及實驗動物 SDZB0808(KF853202)山東IBV 分離株由本實驗室分離并保存；P100 為SDZB0808 株在9～11 日齡SPF 雞胚連續(xù)傳100 代獲得的子代病毒；SPF 雞胚和SPF 雞購自山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所SPF 雞研究中心。

1.2 主要試劑 TRIzol Reagent RNA 抽提試劑、One-Step RT-PCR 試劑盒和DNA Marker DL 2000 均購自山東賽恩斯科技有限公司。

1.3 引物設計與合成 參考GenBank 中登錄的IBV全基因組序列，設計25 對引物用于擴增P100 全基因組(表略)，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.4 P100致病性試驗

1.4.1 實驗雞分組 3 日齡SPF 雞60 只，隨機分成3 組，分別編號為A、B 和C 組，每組20 只。A、B 組分別采用P100 和SDZB0808 進行滴鼻點眼病毒接種，劑量均為105.0EID50/只。C 組用0.01 mL 無菌0.01 M(pH7.2)PBS 緩沖液滴鼻點眼。各組實驗雞分別于不同隔離器中飼養(yǎng)。每天觀察實驗雞精神、食欲情況(14 d)，統(tǒng)計發(fā)病死亡情況，病死雞進行剖檢。

1.4.2 實驗雞病毒接種后排毒檢測 于病毒接種后第4 d、7 d、10 d 及14 d 迫殺各組實驗雞各3 只，觀察病理變化，將氣管和腎臟置于10 %福爾馬林中，以備制作組織切片，同時取氣管、肺臟、腎臟、法氏囊、腺胃、脾臟、肝臟、心臟、喉頭和泄殖腔棉拭進行病毒RT-PCR 檢測，每次3 只。

1.5 P100全基因組序列測定與分析 按TRIzol 試劑盒說明方法提取病毒基因組RNA，反轉錄制備cDNA。利用通用引物PCR 擴增后經(jīng)1.2 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將鑒定正確的cDNA 由上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。采用分子生物學軟件DNAStar 將P100 各基因片段序列進行拼接，獲得其全基因序列，并與SDZB0808 基因組進行比對分析。

2 結果

2.1 P100致病性試驗結果

2.1.1 實驗雞臨床癥狀和病理變化 B 組經(jīng)SDZB0808 攻毒后2 d 個別雞只出現(xiàn)食欲下降，精神沉郁、縮頸、羽毛松亂和氣管啰音等臨床癥狀，于3 d～10 d 病死8 只，第14 d 存活實驗雞精神、食欲基本恢復正常。剖檢顯示病死雞主要表現(xiàn)氣管環(huán)出血、腎臟腫大(花斑腎)。A 組實驗雞經(jīng)P100 攻毒后在14 d 觀察期內精神、食欲均正常，與對照組(C組)相比無明顯臨床癥狀和病理變化。

2.1.2 實驗雞病毒接種后排毒檢測 于病毒接種后不同時間點對實驗雞喉頭和泄殖腔樣品進行檢測，結果顯示，A、B 組實驗雞喉頭和泄殖腔樣品在攻毒后4 d～14 d 均可以檢測到病毒，正常對照組檢測結果均為陰性(表1)。

內臟組織病毒檢測結果顯示：A 組實驗雞經(jīng)P100 攻毒后4 d～14 d 氣管和法氏囊組織均可以檢測到病毒，肺臟(4 d 和14 d)、腺胃(4 d)和脾臟(7 d和10 d)僅在個別時間點檢測到病毒，腎臟、肝臟和心臟在4 d～14 d 病毒檢測均為陰性。B 組實驗雞經(jīng)SDZB0808 攻毒后，氣管、肺臟和腎臟等組織在第4 d～14 d 均可以檢測到病毒(表1)，病毒檢出率和存在時間均明顯高于A 組。對照組(C 組)實驗雞組織排毒檢測均為陰性。

病理組織觀察結果顯示：A 組實驗雞氣管和腎臟無明顯的組織病變，B 組實驗雞氣管纖毛脫落，出血；腎臟腫大，間質內炎性細胞浸潤(圖1)。

表1 實驗雞攻毒后喉頭、泄殖腔棉拭和內臟組織病毒檢測結果Table 1 Virus detection from swabs and tissues of chickens inoculated with P100 and SDZB0808

圖1 實驗雞接種后7 d 氣管和腎臟組織病理組織學變化(蘇木精-伊紅染色，1 000×)Fig.1 Gross lesions and histopathologic analysis(hematoxylin and eosin staining,1,000×)of tissues from chickens infected with P100 or SDZB0808

2.2 P100全基因組測序結果 將P100 各基因片段測序結果進行拼接，獲得了其除5' 端Cap 和3' 端Poly(A)之外的基因組序列(27 647 bp)，并登錄至GenBank，序列號為KM586818。

與親本株SDZB0808 進行全基因組序列比對分析顯示，P100 共有3 個位點發(fā)生有義堿基突變(A9664C、A20596T 和C24300A)，導致ORF 1a(I3047L)、S蛋白(N76Y)和E 蛋白(L29I)氨基酸發(fā)生了替換(表2)。

表2 致弱前后不同位點的變化Table 2 Changes of different bases in SDZB0808 and P100

P100 基因組在3 244～3 277 缺失了30 個核苷酸，導致ORF 1a 缺失了10 個氨基酸(906VKESV EKPTG915)。對不同代次進行ORF 1a 序列比對：55代之前序列未發(fā)生變化，之后出現(xiàn)個別位點的變化，在第62 代開始出現(xiàn)30 bp 堿基全部缺失(圖2)。

圖2 不同代次ORF 1a 序列變化情況Fig.1 Gene sequence of ORF 1a in different passage

3 討論

IB 弱毒苗是由IBV 分離株在雞胚連續(xù)傳代獲得的，H120、MA5 和2886 等多種IB 弱毒活疫苗用于該病的免疫預防，但這種由強毒變?yōu)槿醵镜闹氯鯔C理目前尚未明確。本研究中致病性試驗結果表明：P100 主要在SPF 雞氣管和法氏囊組織內復制，在肺臟、腺胃和脾臟內增殖時間較短，在腎臟、肝臟和心臟組織內不能夠增殖。與SDZB0808 株相比，P100 在SPF 雞體內的組織分布較少，特別是其失去了在雞腎臟組織內的復制能力，這可能是導致IBV毒力下降的主要因素之一。

Phillips 等對多株IBV 與其致弱后病毒基因組進行序列比對分析，結果顯示37.08 %～43.66 %的氨基酸替換發(fā)生在病毒基因組5' 端非結構蛋白nsp3上，并且這一區(qū)域還有8～10 個氨基酸缺失，因此認為IBV 非結構蛋白nsp3 的氨基酸變化與病毒致弱有關[8]。在本研究中，P100 與其親本強毒株SDZB 0808 相比在基因組3 244～3 273 位缺失30 個核苷酸，導致其ORF 1a 缺失10 個氨基酸(906VKESVEK PTG915)，缺失位點也位于nsp3 蛋白上。此外，P100在第9 664 位的堿基突變導致ORF 1a I3047L 氨基酸替換。由于ORF 1a 編碼的多聚蛋白可以水解成多個功能性蛋白，參與IBV 的復制，其氨基酸的突變或缺失可能影響IBV 在宿主細胞內的復制。

在3'端結構蛋白和非結構蛋白基因中，P100 與SDZB0808 在S 蛋白(N76Y)和E 蛋白(L29I)發(fā)生了氨基酸替換。S 蛋白與IBV 的組織嗜性密切相關[9]，E蛋白與M 蛋白協(xié)同作用，在病毒裝配和出芽中發(fā)揮重要作用[10-11]，因此這兩個蛋白的氨基酸序列變化也可能與病毒的致弱有關。Wang 等對某病毒株及其致弱株的3' 端7.3 kb 基因進行測序顯示：S1 蛋白、S2 蛋白和M 蛋白的氨基酸序列出現(xiàn)變化，而N 蛋白部分未發(fā)生變化[12]；Geerligs 對某病毒株及其致弱株的S1 蛋白高變區(qū)進行測序，結果顯示，1 424 個核苷酸中有4 個位點發(fā)生變化，2 個氨基酸發(fā)生突變[13]。本研究發(fā)生的氨基酸殘基變異位點與之前研究均不一致，推測病毒株致弱可能是多途徑的，不同病毒株的致弱過程并不一樣。

本研究結果表明QX 基因型IBV 分離株SDZB0808 毒力致弱與其基因組多個位點的基因突變和缺失有關，對這些關鍵位點進行功能驗證對于闡明IBV 的致病機制和疫苗研發(fā)均具有重要的理論指導意義。

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