羅斐斐喻 博韓 芳＊石玉秀

(1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理與病理生理學(xué)研究所,沈陽(yáng)110001;2中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室,沈陽(yáng)110001;3中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)外科,沈陽(yáng) 110004)

PTSD促進(jìn)大鼠中縫背核細(xì)胞色素c表達(dá)

羅斐斐1,2喻 博3韓 芳1,2＊石玉秀1,2

(1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理與病理生理學(xué)研究所,沈陽(yáng)110001;2中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室,沈陽(yáng)110001;3中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)外科,沈陽(yáng) 110004)

目的 研究創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(PTSD)大鼠中縫背核神經(jīng)元細(xì)胞色素C(Cyt-c)的表達(dá)變化。方法 應(yīng)用無(wú)連續(xù)單一刺激(SPS)方法建立PTSD大鼠模型,隨機(jī)分為SPS刺激后1d、4d、7d和對(duì)照組,應(yīng)用酶組織化學(xué)法和RT-PCR方法觀察中縫背核神經(jīng)元Cyt-c的表達(dá)變化。結(jié)果 光鏡酶細(xì)胞化學(xué)法和RT-PCR法顯示中縫背核神經(jīng)元Cyt-c染色陽(yáng)性細(xì)胞于SPS刺激后1d明顯高于對(duì)照組,4d逐漸增高,并于7d達(dá)到高峰。電鏡下顯示Cyt-c陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物主要分布在中縫背核神經(jīng)元線粒體膜,SPS刺激后可見(jiàn)Cyt-c釋放到胞漿中。結(jié)論 SPS刺激引起Cyt-c在PTSD大鼠中縫背核神經(jīng)元呈過(guò)表達(dá)。

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙; 中縫背核; 細(xì)胞色素C; 酶組織化學(xué); RT-PCR

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(posttraumatic stress disorder,PTSD)是指由于異常威脅性或?yàn)?zāi)難性心理創(chuàng)傷延遲出現(xiàn)和長(zhǎng)期持續(xù)的精神障礙,其臨床表現(xiàn)以再度體驗(yàn)創(chuàng)傷為特征,并伴有情緒的易激惹和回避行為[1],其生物學(xué)機(jī)制主要包括以下三個(gè)方面:皮質(zhì)類固醇激素受體功能下調(diào),去甲腎上腺素能及加壓素能系統(tǒng)的興奮,以及5-HT能系統(tǒng)的缺陷[2]。5-HT能陽(yáng)性細(xì)胞廣泛分布于中縫核各部,尤以中縫背核部位密集[3],因此中縫背核可能在 PTSD的發(fā)病中起重要作用。

中縫背核(dorsal raphe nucleus,DRN)位于腦橋上部向上至中腦動(dòng)眼神經(jīng)核尾側(cè)部,在中央灰質(zhì)的腹側(cè)。目前有報(bào)道表明:PTSD患者存在腦橋體積的縮小及灰質(zhì)密度的減少[4]。為此,本文旨在研究中縫背核神經(jīng)元線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵點(diǎn)-細(xì)胞色素C(cytochrome c,Cyt-c)的表達(dá)變化,以揭示PTSD后腦橋體積的縮小及灰質(zhì)密度的減少是否由于存在中縫背核神經(jīng)元的凋亡。

以往,由于缺乏理想的動(dòng)物模型,使 PTSD的基礎(chǔ)研究受到了很大限制。SPS模型[9]作為PTSD動(dòng)物模型的確認(rèn),為深入研究應(yīng)激障礙的發(fā)病機(jī)制提供了行之有效的方法。本實(shí)驗(yàn)即采用國(guó)際公認(rèn)的SPS模型作為PTSD動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的模型。

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及大鼠模型的建立

用6周-7周齡雄性Wistar大鼠(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)40只,實(shí)驗(yàn)起始體重(180±20)g,12h光亮/黑暗條件、22℃-25℃環(huán)境溫度,分隔喂養(yǎng),食物和水可自由攝取;隨機(jī)分為4組,即連續(xù)單一刺激(single prolonged stress,SPS)的 1d、4d、7d組及正常對(duì)照組。

PTSD樣大鼠模型的建立:采用日本文部省召開(kāi)的“基礎(chǔ)和臨床的研究進(jìn)展”的會(huì)議[9]確定的關(guān)于PTSD模型SPS刺激后無(wú)干擾喂養(yǎng)的方法。SPS刺激是指將大鼠連續(xù)進(jìn)行下述步驟處理,即:大鼠禁錮2后,立即強(qiáng)迫游泳20min(水深40cm,水溫25℃)。經(jīng)過(guò)15min的恢復(fù),乙醚麻醉至意識(shí)喪失,在籠子中不再給予任何刺激,常規(guī)飼養(yǎng)直至取材。

2.Cyt-c酶組織化學(xué)染色

灌流取材:分別取SPS 1d、4d、7d及正常對(duì)照組大鼠進(jìn)行灌流固定。大鼠經(jīng)2%戊巴比妥腹腔注射麻醉后,暴露心臟,左心室插管,剪開(kāi)右心耳,先以生理鹽水 300ml快速灌沖,再灌注 0.25%戊二醛與2%多聚甲醛的混合液(0.01mol/L PBS配制)進(jìn)行固定,取出中縫背核組織,并浸人同種固定液中繼續(xù)固定 1h,然后浸于 Holt’液(30%蔗糖,0.1mol/L PBS配制)中至沉瓶底。于恒冷箱冰凍切片機(jī)中行冠狀切片,片厚14μm,實(shí)驗(yàn)前,切片用梯度遞減蔗糖緩沖液脫糖。

孵育液的配制:采用 Seligman法配制,細(xì)胞色素C 10mg;過(guò)氧化氫酶 1mg;0.2mol/L PBS 5ml;DAB[5]10mg;蒸餾水 5ml。

酶組織化學(xué)染色:將各組切片分別置于上述孵育液中,37℃振動(dòng)恒溫水浴箱中孵育1h,中間換一次液,孵育反應(yīng)后,用雙蒸水漂洗2-3次,充分洗凈后甘油明膠封片,OL YMUPS光鏡下鏡檢、攝片。

酶活性圖像分析:使用LUZEXF計(jì)算機(jī)圖像分析儀(日本)測(cè)Cyt-c的活性,進(jìn)行定量分析。每組隨機(jī)抽取切片8張,每張切片測(cè)3個(gè)視野,測(cè)量表示酶反應(yīng)強(qiáng)度的積分光密度值。測(cè)定視野越亮,所測(cè)值越大,酶活性越小,反之,酶活性越大。最后,對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3.電鏡酶化學(xué)術(shù)觀察Cyt-c的釋放

切片孵育后用二甲胂酸鈉緩沖液漂洗,1%OsO44℃固定30-60 min,常規(guī)脫水,包埋,經(jīng)半薄切片、超薄切片厚70μm,JEM1200EX透射電鏡下觀察。

4. RT-PCR 檢測(cè)

將各組大鼠麻醉后斷頭取腦,分離中縫背核,加入1ml Trizol溶液(TaKaRa)裂解,按 Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。以DNA/RNA測(cè)定儀測(cè)定RNA的純度和濃度。按逆轉(zhuǎn)錄合成試劑盒說(shuō)明合成cDNA待用。β-actin作為內(nèi)參照,目的片段為542bp,引物序列為 :5’-GTC ACCCACACTGTGCCCATC-3’( 上游);5’-ACAGAGTACTTGCGCTCAGCAG-3’(下游)。Cyt-c 的目的片段為 683bp,引物序列為 :5’-GCCTACCCATTCCA ACTTGGTC-3’( 上 游 );5 ’-AA TTA TTGAAGCAG ATCAGTTTTCG-3’(下游)。在自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀成像并分析。mRNA相對(duì)表達(dá)=樣品掃描值/β-actin掃描值。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)使用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用(±s)表示,采用ANOVA法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.中縫背核Cyt-c陽(yáng)性細(xì)胞的光鏡變化

Cyt-c的反應(yīng)產(chǎn)物為棕黃色顆粒,結(jié)果顯示,于正常對(duì)照組(圖1A)大鼠中縫背核神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)呈均勻分布,胞核反應(yīng)陰性,細(xì)胞輪廓清晰可見(jiàn)。與正常對(duì)照組相比,SPS1d(圖 1B)、4d(圖 1C)、7d(圖1D)的中縫背核神經(jīng)元Cyt-c陽(yáng)性細(xì)胞逐漸增多,光密度逐漸增強(qiáng),因此Cyt-c的活性表達(dá)增強(qiáng)(表1),于SPS 7d時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞最多(圖1D,P<0.05),Cyt-c陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物彌散分布于胞質(zhì)中。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)中縫背核Cyt-c表達(dá)情況(±s)Table 1 DRN Cyt-c expression at different time(IOD)(±s)

表1 不同時(shí)間點(diǎn)中縫背核Cyt-c表達(dá)情況(±s)Table 1 DRN Cyt-c expression at different time(IOD)(±s)

注:＊與Cyt-c正常組比較(compared with Cyt-c control group)P<0.05。

組(Group) IOD Control 72.7380 ±5.9737 SPS1d 90.3020 ±9.1195＊SPS4d 114.1500 ±9.7309＊SPS7d 131.0900 ±9.1487＊

圖1 PTSD大鼠不同時(shí)間點(diǎn)中縫背核Cyt-c的表達(dá)變化。×400Fig.1 DRN Cyt-c expression at different time in PTSD rats. ×400

2.透射電鏡觀察中縫背核神經(jīng)元Cyt-c的變化

對(duì)照組中縫背核神經(jīng)元線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)保持良好,陽(yáng)性產(chǎn)物主要分布在線粒體內(nèi)(圖2A)。SPS刺激后可見(jiàn)線粒體腫脹,空泡變形,嵴斷裂,外膜破裂,Cyt-c陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物從線粒體內(nèi)外膜釋放到細(xì)胞漿中(圖 2B)。

圖2 中縫背核神經(jīng)元線粒體的超微結(jié)構(gòu)。2A:正常組,2B:SPS-7dFig.2 The ultramicrostructure ofmitochondria in DRN by TEM.2A:control group,2B:SPS-7d

3.RT-PCR結(jié)果

以β-actin(圖3)作為內(nèi)參照,Cyc-c在分子水平呈現(xiàn)對(duì)照組、SPS-1d組、SPS-4d組和 SPS-7d組表達(dá)逐漸增高,于SPS-7d達(dá)到高峰,并維持較高水平(表 2,圖 3)。

圖3 PTSD大鼠不同時(shí)間點(diǎn)中縫背核β-actin和Cyt-c mRNA的表達(dá)變化Fig3.β-actin mRNA expression and Cyc-c mRNA expression in DRN of PTSD-like rats by RT-PCR

表2 模型組和對(duì)照組Cyc-c mRNA表達(dá)分析結(jié)果Table 2 Analysis of Cyc-c mRNA in the model group and control group

討 論

近年來(lái),隨著戰(zhàn)爭(zhēng)、社會(huì)暴力事件、重大交通事故和自然災(zāi)害等創(chuàng)傷意外的不斷增多,PTSD發(fā)病率越來(lái)越高,嚴(yán)重影響了患者生活質(zhì)量和社會(huì)穩(wěn)定。不同于一般的應(yīng)激反應(yīng)及其它精神疾病,PTSD以神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的改變?yōu)橹饕攸c(diǎn),主要包括血中糖皮質(zhì)激素濃度異常低下和兒茶酚氨水平增高[6,7]。5-HT功能低下導(dǎo)致去甲腎上腺素能系統(tǒng)活性增高,從而出現(xiàn) PTSD的警覺(jué)性增高、焦慮、驚跳反應(yīng)[8]。中縫背核作為腦內(nèi)5-HT能細(xì)胞的主要集中地,其功能失調(diào)在PTSD發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。

線粒體呼吸鏈Cyt-c既參與線粒體能量代謝,釋放到胞漿中又直接參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。大量實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)Cyt-c從線粒體釋放到細(xì)胞漿是多種細(xì)胞凋亡的共同表現(xiàn),而Cyt-c基因敲除的細(xì)胞能對(duì)刺激因素誘導(dǎo)的凋亡具有明顯的耐受性,Cyt-c是線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中不可缺少的重要因子,在凋亡過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[10]。

本研究利用光電鏡酶組織化學(xué)技術(shù)及RT-PCR方法,研究了PTSD大鼠SPS模型Cyc-c的表達(dá)變化,從結(jié)果表明Cyc-c的表達(dá)呈現(xiàn)1d,4d和7d逐漸升高的趨勢(shì),即在凋亡高峰出現(xiàn)Cyt-c的釋放達(dá)到最多.電鏡觀察到SPS7d組,線粒體Cyt-c大量釋放。Cyt-c釋放到細(xì)胞漿中后與凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)的梭基端WD-40重復(fù)序列結(jié)合,同時(shí)胞漿中的dATP和(或)A TP與Apaf-1的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合,從而促進(jìn)Apaf-1構(gòu)象變化并發(fā)生同源寡聚化。Apaf-1與procaspase-9結(jié)合而使procaspase-9募集。Cyt-c,dATP,Apaf-1和 procaspase-9組成聚合體,稱為凋亡體(apoptosome)。凋亡體使procaspase-9激活,procaspase-9一旦激活就能激活其下游的procaspase-3進(jìn)人內(nèi)源性和外源性凋亡途徑的最后通路,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[11]。

綜上所述,本研究觀察到SPS刺激后大鼠中縫背核神經(jīng)元線粒體Cyt-c的釋放增多,可以提示PTSD大鼠中縫背核神經(jīng)元可能存在細(xì)胞凋亡,從而導(dǎo)致中縫背核功能失調(diào),產(chǎn)生了PTSD不同的精神癥狀,為揭示PTSD的發(fā)病機(jī)制提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本文觀察從蛋白和分子水平觀察到線粒體Cyt-c的釋放,為繼續(xù)研究 PTSD大鼠中縫核神經(jīng)元的線粒體凋亡通路提供了依據(jù)。

[1]劉婷婷,丁金蘭,劉寧宇,等.杏仁核與創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性.解剖科學(xué)進(jìn)展,2009,15(3):329-332

[2]H.M. van Praag. The cognitive paradox in posttraumatic stress disorder:a hypothesis.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,2004,28:923-935

[3]羅振國(guó),韓慶國(guó),張小云.大鼠腦中縫核的免疫細(xì)胞化學(xué)特性研究.深圳大學(xué)學(xué)報(bào),2000,17(1):63-64

[4]Carrion VG,Weems CF,Watson C,et al.Converging evidence for abnormalities of the prefrontal cortex and evaluation of midsagittal structures in pediatric posttraumatic stress disorder:An MRI study.Psychiatry Research Neuroimaging,2009,172:226-234

[5]肖冰,韓芳,石玉秀.創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙模型大鼠杏仁核COX及Caspase 3 mRNA表達(dá)的變化.解剖科學(xué)進(jìn)展,2009,15(4):353-356

[6]Harvey BH,Brand L,Jeeva Z,et al.Cortical/hippocampal monoamines,HPA-axis changes and aversive behavior following stress and restress in an animal model of post-traumatic stress disorder.Physiol Behav,2006,87(5):881-890

[7]Sapolsky RM.Glucocorticoids and hippocampal atrophy in neuropsychiatric disorders.Arch Gen Psychiatry,2000,57(10):925-935

[8]Southwick SM,Krystal J H,Bremner JD,et al.Noradrenergic and serotonergic function in postttaumatic stress disorder.Arch Gen Psychiatry,1997;54:749-758.

[9]肖冰,韓芳,石玉秀.PTSD樣行為異常大鼠杏仁核Ca2+/CaM的改變.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2009,18(4):359-363

[10]Li K,Li Y,Shelton JM,et al.Cytochrome c deficiency cause sembryonic lethality and attenuates sterss-induced apoptosis.Cell,2000,101(4):389-399

[11]Mronga T,Stahnke T,Goldbaum O.Mitochondrial pathway is involved in hydrogen-peroxide-induced apoptotic cell death ofoligodendrocytes.Glia,2004,46(4):446-455

PTSD promotes expression of cytochrome c in the dorsal raphe nucleus of the rats

Luo Feifei1,2,Yu Bo3,Han Fang1,2,Shi Yuxiu1,2＊

(Department ofHistology and Embryology,College of B asic Medical Sciences,China Medical University,S henyang110001,China)

Objective To study the expression of cytochrome c(Cyt-c)in the dorsal raphe neurons of posttraumatic stress disorder(PTSD)-like rats.Methods Forty normal adult male Wistar rats were randomized into:normal control group and single prolonged stress(SPS)group(1d,4d,and 7d).Enzymohistochemistry and RT-PCR techniques were used to detect the expression of Cyt-c in the dorsal raphe neurons.Results The activity of Cyt-c was observed by light microscopy.The expression of cyt-c mRNA in the dorsal raphe neurons gradually increased at 1d,4d and 7d after exposure to SPS compared with that of the control group,reaching the maximum at 7d.Cyt-c products were found to be distributed mainly in the mitochondria membrane,but more Cyt-c products were found in the cytoplasm at 7d after SPS stimulation by transmission electronmicroscopy.Conclusion SPS stimulation causes the overexpression of Cyt-c in the dorsal raphe neurons.

Posttraumatic stress disorder; Dorsal raphe neuron; Cytochrome c; Enzymohistochemistry; RT-PCR

R329

A

10.3870/zgzzhx.2011.01.009

2010-10-10

2010-11-01

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30600341);教育部博士點(diǎn)基金資助項(xiàng)目(20092104110016)

羅斐斐,女(1985年),漢族,碩士研究生。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)