張景華李 慢石玉秀＊韓芳＊

(1中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室,沈陽 110001;2沈陽軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,沈陽 110016)

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠前額內(nèi)側(cè)皮質(zhì)MR表達(dá)的變化

張景華1,2李 慢1石玉秀1＊韓芳1＊

(1中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室,沈陽 110001;2沈陽軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,沈陽 110016)

目的 觀察創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(PTSD)樣大鼠前額內(nèi)側(cè)皮質(zhì)(medial prefrontal cortex,mPFC)神經(jīng)元核受體-鹽皮質(zhì)激素受體(Mineralocorticoid receptors,MR)表達(dá)的變化。方法 采用國際認(rèn)定的單一連續(xù)應(yīng)激(single prolonged stress,SPS)方法建立 PTSD大鼠模型,取成年健康雄性Wistar大鼠90只,隨機(jī)分為 PTSD模型1d、7d、14d、28d和正常對(duì)照組。采用免疫組化、免疫印跡和RT-PCR方法分別進(jìn)行各組mPFC神經(jīng)元MR表達(dá)變化的觀察及檢測,進(jìn)行圖像分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果 PTSD大鼠mPFC神經(jīng)元MR的表達(dá)在SPS-1d時(shí)高于對(duì)照組,隨后下降,SPS-14d最低,SPS-28d恢復(fù)性上調(diào),但仍然低于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論 PTSD模型大鼠經(jīng)SPS處理后,mPFC中出現(xiàn)MR表達(dá)的變化,該變化可能參與PTSD的下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic pituitary adren axis,HPA)軸的變化機(jī)制。

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙; 前額內(nèi)側(cè)皮質(zhì); 鹽皮質(zhì)激素受體; 大鼠

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(posttraumatic stress disorder,PTSD)患者及模型動(dòng)物有下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic pituitary adren axis,HPA)軸的功能障礙[1],同時(shí)血中糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid,GC)處于低水平狀態(tài)[2]。因此研究 HPA軸的功能對(duì)于PTSD患者極為重要,GC對(duì) HPA軸的負(fù)反饋是通過其高密度皮質(zhì)類固醇激素受體(corticosteroid receptor,CsRs)完成的[3]。腦內(nèi) CsRs可分為 I型和Ⅱ型。I型對(duì)皮質(zhì)酮有高親和力并與人類鹽皮質(zhì)激素受體(Mineralocorticoid Receptors,MR)相似,而Ⅱ型對(duì)皮質(zhì)酮親和力低,相當(dāng)于人的糖皮質(zhì)激素受體 (Glucocorticoid Receptors,GR)[4]。MR及GR均參與了 HPA軸的生理調(diào)節(jié),MR參與基礎(chǔ)水平 HPA軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié),它介導(dǎo) HPA軸基礎(chǔ)活性的維持且與中樞應(yīng)激反應(yīng)閾值及敏感性有關(guān)[5]。由于腦內(nèi)的MR的作用與大部分外周的作用不同,對(duì)于腦內(nèi)的MR特別是mPFC的研究較少,因此,我們研究了PTSD大鼠mPFC-MR的變化,為進(jìn)一步揭示PTSD的HPA軸改變機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

成年健康Wistar品系雄性大白鼠90只,體重150-180g(中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。實(shí)驗(yàn)室條件飼養(yǎng),于實(shí)驗(yàn)前在動(dòng)物房內(nèi)正常喂養(yǎng)一周后,隨機(jī)分為5組,對(duì)照組、SPS后無干擾地靜養(yǎng)1d、7d﹑14d和28d組,每組18只,每組中6只做免疫組化,6只做免疫印跡,6只做RT-PCR。

2.SPS(single prolonged stress)動(dòng)物模型的建立

采用2005年日本文部省召開的國際PTSD科學(xué)會(huì)議確定的關(guān)于大鼠PTSD模型-SPS建立的方法,其具體方法是將大鼠連續(xù)進(jìn)行下述步驟處理:

2.1 Immobilization(禁錮刺激)2 h,要求僅尾部能活動(dòng)其他全身各處均不能活動(dòng);

2.2 Forced swimming(強(qiáng)迫游泳)20min(水深40cm,水溫25℃)之后休息15min;

2.3 Ether anesthesia(乙醚麻醉 )意識(shí)喪失后停止麻醉;

2.4 Undisturbed(無干擾喂養(yǎng))常規(guī)喂養(yǎng)。

3.MR免疫組織化學(xué)SABC法染色

分別取各組大鼠依次麻醉(用2%戊巴比妥腹腔內(nèi)注射),4%的多聚甲醛灌流固定,取大腦,于同種固定液中繼續(xù)固定3h,梯度酒精脫水,二甲苯透明,浸蠟,石蠟包埋,切片5μm厚。根據(jù)鼠腦圖譜確定mPFC的位置[6]。然后依次經(jīng) 3%H2O2-dH2O10min,5%BSA封閉20min后,滴加兔多克隆抗體MR(工作濃度為 1∶500,Santa Cruz Biotechnology),0.01mol/L PBS代替一抗作陰性對(duì)照,4℃孵育過夜,滴加生物素化山羊抗兔 IgG37℃、30min,滴加 SABC37℃、20min,以上各步間均用0.01mol/LPBS 漂洗 ,之后 DAB(武漢博士德)顯色,酒精系列上升梯度脫水(酒精85%5min、90%5min、95%5min、100%10min、100% 10min),二甲苯透明(10min、10min),中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡(OL YM PUS,BX60,Japan)下觀察 mPFC中 GR的表達(dá),攝片。

4.免疫印跡(Western blot)檢測mPFC中MR的表達(dá)

冰上直接斷頭快速取出正常及SPS模型處理后1d、7d、14d和 28d的 mPFC組織,組織經(jīng)勻漿,超聲粉碎后高速低溫離心,12000rmp/min,取上清;采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度3mg/ml,10%SDS-PAGE凝膠電泳,濃縮膠90v,分離膠110v;轉(zhuǎn)印,剪裁目的條帶,5%脫脂奶粉封閉2h,鼠多克隆抗體MR(工作濃度1:1000),4℃過夜;TBST洗4×10min,HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG(工作濃度1:5000)孵育2h,TBST洗4次×10min,ECL顯色。應(yīng)用 Fluorchem Ⅴ2.0系統(tǒng)進(jìn)行吸光度測定,以目的條帶與內(nèi)參照β-actin的平均吸光度的比值表示蛋白水平,進(jìn)行分析。

5.RT-PCR檢測mPFC的 MR-mRNA

5.1 總 RNA提取:如上法取 50-100mg的mPFC組織.加入1ml Trizol溶液(TaKaRa)充分混勻,室溫放置5min使其充分裂解;12000rpm離心5min,棄沉淀;加入200μl氯仿,振蕩混勻后室溫放置15min;4℃12000rpm離心15min;吸取上層水相,至另一離心管中;加入0.5m1異丙醇混勻,室溫放置 10min;4℃12000rpm離心 10min,棄上清,RNA沉于管底;加入lml 75%乙醇,溫和震蕩離心管,懸浮沉淀;4℃8000rpm離心5min,盡量棄上清;室溫干燥 30min;用 50μl的 0.1%DEPC水溶解RNA樣品;提取的RNA保存于-80℃超低溫冰箱中,或立即用于逆轉(zhuǎn)錄,測量OD260/OD280,定量,電泳鑒定RNA質(zhì)量。

5.2 總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA:在微量離心管內(nèi)配制下列反應(yīng)液,包括①模板 RNA溶液1μg,5×RT Buffer 4μ1, ③dNTP Mixture(lOmM each)2μ1,④Oligo(dT)18 Primer 20U, ⑤AMV Reverse Transcriptase 10U,⑥0.1%DEPC 水調(diào)體積至20μl。輕輕攪拌;室溫放置10min后移入42℃恒溫水浴中;42℃保溫1h,在冰水中冷卻2min。所得到的反應(yīng)液可用于PCR反應(yīng)。

5.3 PCR擴(kuò)增:引物序列,見附表。擴(kuò)增體系①TaKaRa Taq(5U/μ1)0.25μ1, ② 10 X PCR Buffer 5μ1,30dNTP Mixture(lOmM each)2μ1 ④模板 cDNA 2.5ng⑤引物 1(20uM)1μ1,⑥引物 2(20μM)1μ1,⑦滅菌蒸餾水調(diào)體積至 50μl。擴(kuò)增條件:循環(huán)1,94℃4min,循環(huán)2,94℃45s,60℃45s,72℃50s,共36個(gè)循環(huán),循環(huán)3,72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后,擴(kuò)增產(chǎn)物5μL經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,采用凝膠成像系統(tǒng)成像并分析記錄。mRNA相對(duì)表達(dá)=樣品掃描值/β-actin掃描值。

表1 MR和內(nèi)參的引物序列Table 1 The sequence of MR andβ-actin

6.圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析系統(tǒng),免疫組化結(jié)果為每只大鼠選取3張切片,在相應(yīng)的mPFC內(nèi)測量每高倍鏡(10×40倍)視野內(nèi)MR的吸光度,即分光密度值(OD),每張切片選3-5個(gè)視野,計(jì)算每張切片每個(gè)視野的OD值,取平均值作為本只大鼠的OD值,然后根據(jù)每只大鼠的OD值,計(jì)算每組大鼠的平均OD值,數(shù)據(jù)用(±s)表示,所測數(shù)據(jù)采用 SPSS13.0 for windows軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各組之間ANOVA法進(jìn)行方差分析,P<0.05表示有差異。Western blot和 RT-PCR的結(jié)果進(jìn)行圖像掃描后分析各條帶的平均灰度值,計(jì)算各組大鼠的平均灰度值,數(shù)據(jù)用(±s)表示,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法處理同上。

結(jié) 果

1.免疫組化結(jié)果

高倍鏡觀察 MR分布于 mPFC(圖1):對(duì)照組(圖1A)MR分布于神經(jīng)元的胞體;SPS-1d組(圖1B)與對(duì)照組相比,MR的陽性表達(dá)增強(qiáng),陽性神經(jīng)元數(shù)量也增多;SPS-7d組(圖1C)和 SPS-14d組(圖1D)MR的陽性表達(dá)逐漸降低,陽性神經(jīng)元數(shù)目也減少,均低于正常對(duì)照組,SPS-28d組(圖1E)陽性表達(dá)恢復(fù)性增加,但仍低于對(duì)照組(P<0.05),分析結(jié)果見(圖1F)。

圖1A 對(duì)照組MR的表達(dá),免疫組織化學(xué)染色可見大量棕黃色的陽性細(xì)胞 ;圖1B SPS刺激1d后MR的表達(dá),免疫組織化學(xué)染色可見大量棕黃色的陽性細(xì)胞;圖1C SPS刺激7d后MR的表達(dá),免疫組織化學(xué)染色可見大量棕黃色的陽性細(xì)胞;圖1D SPS刺激14d后MR的表達(dá),免疫組織化學(xué)染色可見大量棕黃色的陽性細(xì)胞;圖1E SPS刺激28d后MR的表達(dá),免疫組織化學(xué)染色可見大量棕黃色的陽性細(xì)胞;圖1F模型組和對(duì)照組免疫組化MR分光密度值的分析結(jié)果,、■、▲、◆均代表與對(duì)照組相比兩者之間的差異(P<0.05).Fig.1A At normal control,MR positive cell brow;Fig.1B At 1d after SPS,MR positive cell brown;Fig.1C At 7d after SPS,MR positive cell brown;Fig.1D At 14d after SPS,MR positive cell brown;Fig1E At 28d after SPS,MR positive cell brown;Fig1F,Immunohistochemistry analysis of MR protein in the model groups and control group, 、■、▲、◆P＜0. 05.

2.MR-mRNA免疫印跡的結(jié)果

β-actin和MR的分子量分別為42kb和112kb,結(jié)果顯示SPS后1dmPFC的MR的表達(dá)增加,7d和14d大鼠mPFC的MR的表達(dá)逐漸下調(diào),28d組MR表達(dá)恢復(fù)性上調(diào),但仍然高于低于對(duì)照組(圖2)。蛋白表達(dá)隨時(shí)間變化與免疫組化結(jié)果OD值隨時(shí)間變化一致。

圖2 A:mPFC的MR的Western blot分析;B:MR各組條帶的灰度值,、■、▲、◆均代表與對(duì)照組相比較兩者之間差異(P<0.05)。Fig.2 A:Western blot analysis of MR in mPFC of PTSD rats.B: 、■、▲、◆P<0.05 vs control group.

3.RT-PCR 結(jié)果

β-actin和 MR在 mPFC都表達(dá),以β-actin作為內(nèi)參照(圖3)。與正常對(duì)照組相比,SPS-1d MR的表達(dá)上調(diào),4d和7d表達(dá)急劇下調(diào)。28d有所回調(diào),但仍低于正常。各組隨時(shí)間變化趨勢與Western blotting一致。

討 論

以往的研究對(duì)于大鼠的MR在中樞的作用較GR研究少,以往認(rèn)為MR主要是在上皮細(xì)胞中起調(diào)節(jié)水鹽平衡的作用,目前認(rèn)為MR在腦內(nèi)組織存在,尤其是海馬大量存在,并且GR和MR可共存于一些腦區(qū),如海馬的 CA1、CA2、CA3亞區(qū)和齒狀回[7]。海馬內(nèi)MR與上皮細(xì)胞中MR對(duì)鹽皮質(zhì)激素(醛固酮)的選擇作用不同。受到刺激后,GC同時(shí)與 GR和MR兩套受體結(jié)合,而且,皮質(zhì)酮與MR結(jié)合親合力約是與 GR的10倍。低水平 GC首先與MR結(jié)合,只有高水平 GC才能在MR飽和后與GR結(jié)合。MR是高親和力和低容量的 GC受體系統(tǒng),而 GR為低親和力和高容量的 GC受體系統(tǒng)[8]。

圖3 A:mPFC的MR的RT-PCR分析;B:MR各組條帶的灰度值,、■、▲、◆均代表與對(duì)照組相比兩者之間的差異(P<0.05).Fig.3 A:RT-PCR analysis of MR in mPFC of PTSD rats. B: 、■、▲、◆P<0.05 vs control group.

皮質(zhì)酮通過MR介導(dǎo)的效應(yīng),也受到 GR的調(diào)節(jié)。GR在應(yīng)激后的 GC的生理節(jié)律上升期不斷被占領(lǐng)結(jié)合,GC再通過負(fù)反饋效應(yīng)作用于PVN(下丘腦室旁核)。MR活動(dòng)占優(yōu)勢時(shí),海馬維持著興奮性,并經(jīng)跨突觸抑制性投射至 PVN,抑制基礎(chǔ)性HPA活動(dòng)。相反,隨著 GC濃度的上升,激活的 GR抑制了海馬的信號(hào)輸出,導(dǎo)致PVN神經(jīng)元的去抑制。兩類受體調(diào)節(jié)的功能是相互關(guān)聯(lián)的[9]。MR缺陷將使皮質(zhì)酮反應(yīng)更快速地出現(xiàn),并產(chǎn)生更明顯的GR介導(dǎo)效應(yīng)。上述資料說明,MR和GR介導(dǎo)的效應(yīng)均衡性在 HPA調(diào)節(jié)中的重要性。因此,越來越多的研究支持受體介導(dǎo)作用的平衡學(xué)說,認(rèn)為MR主要維持GC的作用,而 GR主要參與 GC的負(fù)反饋?zhàn)饔肹10]。由于MR對(duì) GC的親合力比 GR的高,故在HPA軸激活初期或基礎(chǔ)水平,GC首先與海馬的MR結(jié)合,維持 HPA的基礎(chǔ)活動(dòng),稱為興奮前反饋(proactive feedback)。當(dāng) GC濃度繼續(xù)升高,高濃度GC不斷與 GR結(jié)合,通過 GR的負(fù)反饋抑制HPA軸活動(dòng),稱為反應(yīng)性反饋(reactive feedback)[11]。GC通過MR、GR介導(dǎo)的兩種反饋模式使HPA活動(dòng)處于適當(dāng)?shù)乃?MR/GR介導(dǎo)作用失衡將導(dǎo)致疾病的發(fā)生。長期異常的皮質(zhì)類固醇激素水平,不僅影響海馬細(xì)胞反應(yīng),而且在事實(shí)上危害細(xì)胞生存[12]。因此,海馬同樣作為 HPA軸的一個(gè)調(diào)控部位起作用。

有研究證實(shí)除海馬外前額內(nèi)側(cè)皮質(zhì)同樣有MR存在,在小鼠前腦選擇性的敲除MR,會(huì)損傷小數(shù)的空間學(xué)習(xí)能力,相反,在前腦選擇性的過表達(dá)MR,會(huì)導(dǎo)致小鼠應(yīng)激后焦慮樣行為減少[9],說明在腦內(nèi)海馬外區(qū)同樣有MR的存在,但其作用機(jī)制尚不明確,在本實(shí)驗(yàn)中可以在mPFC觀察到有MR的表達(dá),而且主要在胞質(zhì)中表達(dá),考慮尚未進(jìn)入核內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)錄的作用,在SPS后出現(xiàn)MR的快速上調(diào),7天后即出現(xiàn)下調(diào),說明在應(yīng)激時(shí)不僅有海馬部位 GR的反饋調(diào)節(jié)性的增高,同樣有 mPFC的 MR改變,此后MR表達(dá)逐漸減低,至28天時(shí)又有所恢復(fù),但仍與實(shí)驗(yàn)前有差別,說明mPFC的MR在 HPA軸的調(diào)節(jié)中有變化,在PTSD的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中有時(shí)間性的改變,但是mPFC中MR的變化是 HPA軸變化的結(jié)果,還是 MR的改變導(dǎo)致 HPA軸的變化,由于MR作用與 GR密切相關(guān),即使在相同細(xì)胞中也可起到不同的作用,因此仍需大量的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)MR的改變機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)利用免疫組化和免疫印跡等技術(shù)從蛋白水平揭示了mPFC-MR的存在,并且在 PTSD實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中有量的變化,為揭示PTSD的發(fā)病機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。對(duì)進(jìn)一步探討相關(guān)作用機(jī)制與有效干預(yù)措施,揭示 PTSD神經(jīng)生物學(xué)致病機(jī)制、開辟治療新途徑可能有重要意義。但是本實(shí)驗(yàn)僅局限于對(duì)PTSD樣大鼠mPFC-MR受體的研究,關(guān)于其他部位受體變化及其對(duì)HPA-axis的影響有待于進(jìn)一步研究。

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Change in expression of mineralocorticoid receptors in medial prefrontal cortex of rats with posttraumatic stress disorder

Zhang Jinghua1,2,Li Man1,Shi Yuxiu1＊,Han Fang1＊

(1Department ofHistology and Embryology,College of B asic Medical Sciences,China Medical University,S henyang110001,Department of Neurology,The General Hospital of S hengyang Military Region,S henyang110016,China)

Objective To observe the expression of mineralocorticoid receptors(MR)in the medial prefrontal cortex(mPFC)of rats with posttraumatic stress disorder(PTSD).Methods The single prolonged stress(SPS)method was used to set up the rat PTSD models.A total of 90 male Wistar rats were randomly divided into 1d,7d,14d,28d of SPS groups and normal control group.Immunohistochemistry,Western blotting,RT-PCR,image analysis and statistical analysis were used to detect the activity of MR.Results The activity of MR in mPFC neurons increased at 1d after exposure to SPS compared with that of the control group,then gradually decreased,reached the minimum at 14d,and restored to 28d,but still lower than that of the control group(P<0.05). Conclusion The expression of MR may be related to the pathogenesis of HPA.

Posttraumatic stress disorders; Medial prefrontal cortex; Mineralocorticoid receptors; Rat

R332.8

A

10.3870/zgzzhx.2011.01.002

2010-08-12

2010-11-23

國家自然科學(xué)基金資助(30600341)

張景華,女(1970年),漢族,博士研究生。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)