周 利 張曉艷 張紅星 鄒 燃 劉銀妮 王 瓊

缺血性腦損傷可以觸發(fā)腦內(nèi)分子和細胞修復機制,誘發(fā)神經(jīng)干細胞的增殖分化,引起成年腦神經(jīng)元再生。新生的神經(jīng)元還可以遷移到病灶區(qū)代替一部分死亡的神經(jīng)元而發(fā)揮一定的功能[1]。通過適當?shù)耐獠扛深A措施放大這種神經(jīng)再生就有可能促進腦損傷后的自我修復。本實驗采用線栓法制作大鼠大腦中動脈閉塞模型,通過觀察DG區(qū)BrdU陽性細胞和BrdU/NeuN雙標陽性細胞的表達,驗證頭針能誘導內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖和分化,并減少其隨時間增殖而衰減。從而借此探討頭針治療腦缺血的理論依據(jù),為臨床治療腦缺血奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

健康wistar雌性大鼠(SPF級)100只(考慮實驗中有死亡及剔除的大鼠),體重為(200±20)g,由湖北省實驗動物中心提供(SCXK(鄂)2004-0007)。甲醛溶液,水合氯醛(上海試劑一廠),cy3羊抗兔IgG和FITC羊抗鼠IgG購自三鷹生物科技有限公司,hoechst33258和防淬滅劑封片購自碧云天生物技術研究所,5-溴脫氧尿核苷(BrdU)液購自美國sigm a公司,BrdU單克隆抗體、神經(jīng)元核性蛋白(NeuN)購自美國santa cruz公司;LH 202H型韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(北京華威有限公司生產(chǎn))。

1.2 動物模型制備及鑒定

1.2.1 動物模型制備 參照Longa等報道的線栓法[2],并加以改進;以10%水合氯醛(30 m g/kg體重)腹腔麻醉后,在大鼠頸部正中切口暴露右側(cè)頸總動脈(CCA),分離出頸內(nèi)動脈(ICA),頸外動脈(ECA);以動脈夾阻斷CCA血流,再在ECA殘端剪0.2mm的小口,插入直徑約0.22mm、長為 60 mm的尼龍線;輕推尼龍線端經(jīng)CCA分叉部沿ICA入顱,至大腦中動脈(MCA),遇阻即止,尼龍線插入深度約(18±0.5)mm;結(jié)扎ECA殘端口,縫皮;缺血1 h后輕輕向外拉尼龍線,至有阻力感時提示尼龍線頭部已離開ICA而位于ECA殘端,將體表外的尼龍線剪斷,恢復大腦中動脈的血供,實現(xiàn)再灌注;假手術組則不插線栓,不做再灌注;縫合切口后大鼠保溫喂養(yǎng),并觀察造模大鼠生命指征。

1.2.2 動物模型鑒定 觀察造模大鼠清醒后行為學改變,按Zea Longa五級評分標準[2]進行神經(jīng)功能缺損評分。0分為無神經(jīng)缺損癥狀;1分為不能伸展對側(cè)前爪;2分為行走時向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分為向偏癱側(cè)傾倒;4分為不能自發(fā)行走,意識喪失。本實驗剔除其中0分及4分者。

1.3 動物分組

在實驗過程中造模后的大鼠死亡18只,剔除12只。將成功模型鼠隨機分為2組：模型組和治療組(均設7、14、28 d時間點,各時間點n=10)。假手術組10只(設7、14、28 d時間點,各時間點 n分別為 4、3、3 只)。

1.4 治療

1.4.1 所有模型組和假手術組大鼠造模后常規(guī)飼養(yǎng),不予任何治療。

1.4.2 頭針組造模后即可行頭針治療。頭針選穴依據(jù)《頭針國際標準化方案》,選取頂顳后斜線,頂顳前斜線。大鼠穴位定位根據(jù)華氏等介紹的大鼠穴位圖譜[3],模擬人體經(jīng)穴定位。30號1寸“瑞琪爾”(NATURA L)牌一次性無菌針灸針,進針深度約0.5 cm,進針后接韓氏治療儀,疏密波,頻率2 H z/100 Hz,強度2m A,每次20m in,每天1次。

1.5 BrdU標記法

將BrdU用生理鹽水配制成5mg/m l的溶液。各組大鼠于處死前1 d腹腔注射BrdU(50mg/kg),每2 h注射1次,共注射4次,最后1次注射結(jié)束24 h后處死大鼠。

1.6 標本的采集與處理

標本采集：各組大鼠于再灌注后各時間點將大鼠用100 g/L水合氯醛腹腔注射(300mg/kg)麻醉,用多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定,取腦后固定24 h,待用。

免疫熒光檢測：選擇含海馬齒狀回的腦組織連續(xù)6μm冠狀切片,(1)常規(guī)脫蠟至水;(2)切片入3%H2 O2-甲醇室溫下孵育30 min;(3)微波修復;(4)10%羊血清濕盒內(nèi)37℃下孵育30 min;(5)分別用一抗為兔抗的BrdU(1∶100)和一抗為鼠抗的NeuN(1∶100)混合液滴加于標本上進行孵育,濕盒內(nèi)4℃過夜;(6)cy3羊抗兔IgG和FITC羊抗鼠IgG混合液,濕盒內(nèi)37℃孵育45 min;(7)hoechst 33258染核。上述各步驟除羊血清孵育后不洗外,其他各步驟均用0.01 M PBS震蕩漂洗5 min×3次;(8)防淬滅劑封片;(9)每只大鼠隨機選取海馬3張切片,高倍物鏡下取缺血側(cè)海馬6個非重疊視野,計數(shù)其中BrdU、BrdU/NeuN陽性細胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 頭針對神經(jīng)功能缺損評分的影響 假手術組無行為學改變,故與模型組、頭針組在各時相上的NSS比較均有顯著性意義(P＜0.01);頭針組與模型組在各時相上的NSS比較,28 d組有顯著性差異(P＜0.05)(表1)。

2.2 BrdU單標 各組大鼠的DG均可見BrdU陽性細胞,在缺血再灌注后DG區(qū)BrdU陽性細胞數(shù)增加更明顯,7 d達到峰值,14 d后逐漸減少,28 d時明顯下降。模型組、頭針組各時間點陽性細胞數(shù)較假手術組明顯增加,差異有顯著性(P＜0.01);頭針組的BrdU陽性細胞各時間點較模型組亦明顯增加,差異有顯著性(P＜0.01)(表2)。2.3 BrdU/NeuN陽性細胞數(shù) 假手術組中海馬僅存在少量BrdU/NeuN陽性細胞,而缺血再灌注后則可見BrdU/NeuN陽性細胞數(shù)有顯著變化(P＜0.01),海馬的陽性細胞開始增加,28d達到峰值。頭針組陽性細胞數(shù)相對于模型組也有顯著差異(14、28d組 P＜0.01)(表3)(圖1～9)。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較(±s)

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較(±s)

注：與相同時間點的假手術組比較,*P＜0.01;與相同時間點的模型組比較,▲P＜0.05

組別 NSS 7d 14d 28d假手術組 - - -模型組 2.80±0.42* 2.70±0.48* 2.60±0.52*頭針組 2.60±0.70* 2.20±0.79* 1.80±0.79*▲

表2 各組BrdU陽性細胞數(shù)比較(±s)

表2 各組BrdU陽性細胞數(shù)比較(±s)

注：與相同時間點的假手術組比較,*P＜0.01;與相同時間點的模型組比較,▲P＜0.01

組別 BrdU陽性細胞數(shù)7d 14d 28d假手術組 40.00±2.58 39.33±3.06 40.00±2.00模型組 105.30±4.11* 88.50±4.25* 76.30±5.17*頭針組 136.70±4.06*▲ 94.60±3.95*▲ 85.90±4.18*▲

圖1 假手術7d組Brdu/NeuN陽性細胞表達水平(×400倍)

圖2 模型7d組Brdu/NeuN陽性細胞表達水平(×400倍)

圖3 頭針7d組Brdu/NeuN陽性細胞表達水平(×400倍)

圖4 假手術14d組Brdu/NeuN陽性細胞表達水平(×400倍)

圖5 模型14d組Brdu/NeuN陽性細胞表達水平(×400倍)

圖6 頭針14d組Brdu/NeuN陽性細胞表達水平(×400倍)

圖7 假手術28d組Brdu/NeuN陽性細胞表達水平(×400倍)

圖8 模型28d組Brdu/NeuN陽性細胞表達水平(×400倍)

圖9 頭針28d組Brdu/NeuN陽性細胞表達水平(×400倍)

表3 各組大鼠BrdU/NeuN陽性細胞數(shù)比較(±s)

表3 各組大鼠BrdU/NeuN陽性細胞數(shù)比較(±s)

注：與相同時間點的假手術組比較,*P＜0.01;與相同時間點的模型組比較,▲＜0.01

組別 BrdU/NeuN陽性細胞數(shù)7d 14d 28d假手術組 2.75±1.26 2.33±0.56 2.67±0.58模型組 7.00±2.11* 13.70±2.98* 22.80±2.62*頭針組 7.80±3.01* 19.20±3.05*▲ 32.70±3.33*▲

3 討 論

神經(jīng)干細胞是一組具有自我更新和多分化潛能的細胞。成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)多個部位存在神經(jīng)干細胞,其中側(cè)腦室壁的腦室下區(qū)(subventricularzone,SVZ)和DG是神經(jīng)干細胞的主要分布區(qū)[4]。這些有分化潛能的干細胞通常處于“靜止”狀態(tài)只有在某些特殊因素作用下或者受到損傷刺激時才被激活,重新進入細胞增殖周期,并進一步分化為特定功能的神經(jīng)細胞[5]。腦缺血可激活NSCs的增殖分化,為腦缺血的自我修復帶來了希望。但是僅靠腦缺血調(diào)動內(nèi)源性NSCs是遠遠不夠的,一方面NSCs的數(shù)量不足;另一方面調(diào)節(jié)增生、遷移、分化、神經(jīng)元修復和突觸形成的因子也不足[6]。頭針在臨床上治療缺血性腦卒中已經(jīng)取得了明顯療效,且頭針可明顯縮小腦梗死的面積,減少壞死灶周圍的水腫和炎癥反應[7],能使多種神經(jīng)營養(yǎng)因子(如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、堿性成纖維生長因子等)的分泌增多,而腦缺血后神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達上調(diào)又是神經(jīng)干細胞增殖、遷移、分化、網(wǎng)絡化的重要因素[8]。因此我們推測頭針治療缺血性腦卒中可能促進了內(nèi)源性NSC參與腦缺血的修復。

BrdU是一種胸腺嘧啶脫氧核苷類似物,在細胞增殖周期的S期嵌入細胞核的DNA,因而BrdU陽性細胞被看作具有增殖活性的細胞,是自體神經(jīng)干細胞增殖的標記物[9]。Iw ai等利用沙鼠全腦缺血/再灌注模型發(fā)現(xiàn),模型動物5 d后海馬的BrdU陽性細胞開始增加,10 d左右達到高峰,20 d時降至對照組水平[10]。李常新等發(fā)現(xiàn)電針治療促使梗死灶邊緣、對側(cè)鏡區(qū)BrdU陽性細胞增多,隨著治療時間增加,細胞增多更明顯,提示電針治療可促使神經(jīng)前體NSC增殖及遷移[11]。本研究結(jié)果顯示,正常成年大鼠腦組織中只有少量 BrdU陽性細胞存在,腦缺血再灌注后BrdU陽性細胞表達增強,7 d達到峰值,然后開始遞減,經(jīng)頭針刺激后BrdU陽性細胞表達明顯高于模型組,故可以認為頭針治療能夠促進NSCs的增殖。

神經(jīng)元核心抗原(neuron-specific p rotein/neural nuclei,NeuN)是一種可溶的核蛋白,是神經(jīng)元的標記蛋白,其免疫反應性在神經(jīng)元分化成熟后即開始出現(xiàn)[12],因此BrdU/NeuN陽性細胞是向神經(jīng)元方向分化的神經(jīng)干細胞。本研究免疫熒光結(jié)果顯示BrdU/NeuN陽性細胞數(shù)在再灌注后14 d明顯增加,28 d后達到高峰,這說明腦缺血后增殖的神經(jīng)干細胞14 d后開始分化為神經(jīng)元,頭針組28 d BrdU/NeuN陽性細胞數(shù)明顯高于模型組,提示頭針對增殖后的NSCs分化為神經(jīng)元也起到促進作用。

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