樊 超 鄭勁鋒 陳宏翔

(深圳市福永人民醫(yī)院,深圳 518103)

人外周血 Th細胞和 Tc細胞內(nèi) IFN-γ及IL-4表達水平與白塞病的關系

樊 超 鄭勁鋒 陳宏翔

(深圳市福永人民醫(yī)院,深圳 518103)

目的 檢測BD患者外周血Th細胞和Tc細胞內(nèi)INF-γ和IL-4的表達水平,探索BD患者體內(nèi)的免疫狀況。方法 采用流式細胞術檢測BD活動期患者(n=22),BD穩(wěn)定期(n=6)以及健康體檢者(n=22)外周血T細胞亞群INF-γ和IL-4的表達水平。結(jié)果 BD患者活動期外周血細胞 Th細胞和 Tc細胞經(jīng)過刺激后胞內(nèi)合成IFN-γ的水平明顯高于正常人水平(Th 細胞:22.45% ±7.33%vs. 16.32 ±4.96%,P<0.05;Tc 細胞:36.74% ±13.19%vs.28.67% ±11.56%,P<0.05),穩(wěn)定期患者 Th細胞和Tc細胞體外合成IFN-γ的能力與正常人相比無明顯差異;穩(wěn)定期患者 Th細胞和 Tc細胞胞內(nèi)合成 IL-4的能力相對于正常人均無明顯差異:(穩(wěn)定期 Th細胞:3.01%±1.38%vs.2.87%±1.46%,Tc細胞:1.14%±0.28%vs.1.07%±0.32%,P>0.05)。而活動期患者 Th細胞和 Tc細胞胞內(nèi)合成 IL-4的能力相對于正常人均存在明顯差異:(Th 細胞:3.54% ±1.62%vs. 2.87%±1.46%,Tc細胞:1.82% ±0.43%vs. 1.07% ±0.32%,P<0.05);導致 Th細胞和 Tc細胞有偏向 Th1及 Tc1的趨勢(Th細胞 IFN-γ/IL-4:6.34±3.24 vs. 5.69±4.72,p>0.05;Tc細胞 IFN-γ/IL-4:20.19±13.65 vs. 26.79±14.52,P>0.05)。結(jié)論 BD 患者外周血 INF-γ和 IL-4的表達水平明顯升高 ,并與疾病活動期存在一定程度相關,可能對白塞病患者的診斷具有重要的臨床意義。

白塞病; γ-干擾素; 白介素-4

白塞病(Behcet’s disease)又稱貝赫切特綜合征(Behcet’s syndrome),是一種病因未明的自身免疫性疾病,缺乏特異性的實驗室診斷指標和特殊的病理組織學改變,造成臨床上對該病診斷困難,部分病例甚至長期誤診。目前,BD的發(fā)病機制尚不清楚,但越來越多的研究表明,免疫因素在BD發(fā)病中起重要作用。國外研究表明外周血 T細胞亞群INF-γ和IL-4的表達水平與疾病的發(fā)展存在一定的相關性[1,2]。本研究對22例BD患者外周血T細胞亞群INF-γ和IL-4的表達水平與疾病發(fā)展的相關性進行了探討。

材料和方法

1.研究對象

2008年5月至2008年10月期間我院皮膚科門診BD患者22例(14例女性,8例男性),所有BD患者均符合日本白塞病研究委員會1987年修訂的診斷標準[6]。BD穩(wěn)定期患者6例,為前22例患者中經(jīng)治愈并已停藥3個月的病例。正常人(normal control,N)22例,均來自年齡和性別匹配的健康體檢者。

采集BD患者外周血標本時,有16例未接受任何治療,4例僅接受中成藥復方丹參針劑注射,還有2例接受復方丹參針劑注射和秋水仙堿治療。6例接受治療的患者在標本采集之前24小時均未進行任何治療。

2.實驗材料

2.1 儀器:FACSCalibur流式細胞儀(BD Biosciences, San Diego,CA);CO2細胞培養(yǎng)箱(購自美國Forma公司);離心機(購自美國Sigma公司)。

2.2 試 劑:抗人 CD3-APC(ebioscience,Cat.NO.17-0037),抗人 CD8-FITC(ebioscience,Cat.NO.11-0088),抗 人 IL-4-PE(ebioscience,Cat.NO.12-7049); 抗 人 IFN-γ-PE-CY7(ebioscience,Cat.NO.25-7319);細胞內(nèi)細胞因子固定劑與穿膜劑(ebioscience,Cat.NO:88-8823-88)

3.方法

FCM檢測 Th和 Tc細胞細胞內(nèi)細胞因子:分離人外周血單個核細胞(PBMC),調(diào)整細胞濃度至1×106個/ml,轉(zhuǎn)至24孔培養(yǎng)板,每孔1ml細胞懸液 ,并加入 PMA 50ng/ml、ionomycin 750ng/ml、brefeldin A 20ug/ml,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng);5h后收集體外刺激后的PBMC,1000 r/m離心10 min,棄上清,以5 ml PBS同法沖洗一次,加入100 μ1 PBS重懸細胞,然后加入20μ1的抗人CD3抗體和CD8抗體,室溫避光孵育30 min。以5 ml PBS同樣方法洗滌一次,盡量去除上清液,然后加入固定劑 500μ1,室溫避光孵育 15 min,以 3 ml含 0.1%NaN3和5%FBS的PBS同法洗滌一次,盡量去除上清液,再加入穿膜劑100μ1、適量抗人 IFN-γ和抗人IL-4或相應的同型抗體ⅠgG1及 IgG2a,室溫避光孵育30 min后,再以3 ml含0.1%NaN3和5%FBS的 PBS洗滌二次,最后用500μ1PBS懸浮后,上流式細胞儀進行檢測。檢測時,首先以 FSC及SSC設定淋巴細胞群 R1,然后以CD3和CD8分別設定CD3+CD8-細胞群 R2(Th細胞)及 CD3+CD8+細胞群R3(主要為 Tc細胞),并分別對R2和R3中的細胞同時檢測IFN-γ和IL-4的表達(圖1)。每個標本收集R1內(nèi)10000個細胞,結(jié)果均以 Th細胞或Tc中IFN-γ及IL-4表達的陽性百分率進行統(tǒng)計,并以同型對照抗體消除非特異性結(jié)合。

4.統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

BD患者及正常人外周血 Th細胞和 Tc細胞細胞內(nèi)IFN-γ及IL-4表達水平的檢測:圖1顯示了采用流式細胞術檢測正常人(右圖)和BD患者(左圖)外周血 Th和 Tc細胞細胞內(nèi) IL-4和IFN-γ表達水平的典型圖。結(jié)果顯示:BD患者活動期外周血細胞 Th細胞和 Tc細胞經(jīng)過刺激后胞內(nèi)合成 IFN-γ的水平明顯高于正常人水平(Th細胞:22.45%±7.33%vs. 16.32 ±4.96%,P<0.05;Tc 細胞 :36.74% ±13.19%vs. 28.67% ±11.56%,P<0.05),穩(wěn)定期患者(指皮損及癥狀完全消退,并全部停藥)Th細胞和Tc細胞體外合成IFN-γ的能力與正常人相比無明顯差異;穩(wěn)定期患者 Th細胞和Tc細胞胞內(nèi)合成IL-4的能力相對于正常人均無明顯差異,但總體水平卻略有上升趨勢:(穩(wěn)定期 Th細胞:3.01%±1.38%vs. 2.87%±1.46%, Tc細胞:1.14%±0.28%vs. 1.07% ±0.32%,P>0.05)。而活動期患者 Th細胞和 Tc細胞胞內(nèi)合成IL-4的能力相對于正常人均存在明顯差異:(Th細胞:3.54% ±1.62%vs. 2.87% ±1.46%,Tc細胞:1.82%±0.43%vs. 1.07%±0.32%, P<0.05)。

表1 BD患者及正常人外周血 Th細胞及 Tc細胞細胞內(nèi)IFN-γ及IL-4表達水平Table 1 Percentages of intracytoplasmic IFN-γand IL-4 expression in peripheral blood Th and Tc cells from patients with BD and normal individuals

圖1 人外周血 Th和 Tc細胞細胞內(nèi) IFN-γ及 IL-4表達水平的代表圖Fig.1 The expression of intracytoplasmic IFN-γ and IL-4 in peripheral blood Th and Tc cells from patients with BD

討 論

BD是一種累及皮膚粘膜、眼、滑膜、血管、腸道、肺和神經(jīng)系統(tǒng)等多系統(tǒng)的血管炎性疾患。目前BD的發(fā)病機制尚不清楚,但是越來越多的研究顯示,免疫因素在疾病發(fā)病中起重要作用。本實驗對有關BD的免疫學方面研究進行初步探討。在實驗中我們通過流式細胞術檢測了BD患者外周血 Th和 Tc細胞內(nèi)IFN-γ和 IL-4的表達水平,以此初步了解BD患者體內(nèi)細胞免疫的狀況。我們的實驗結(jié)果表明,BD患者體內(nèi)的確存在較嚴重的免疫功能的紊亂,主要表現(xiàn)在 CD8 T細胞比例上調(diào)導致CD4/CD8比值相對于正常人顯著降低。說明BD患者體內(nèi) T細胞處于過度活化狀態(tài),且免疫效應細胞的比例也大大增加,打破了體內(nèi)免疫平衡狀態(tài).

近年來,對BD患者進行了許多研究,報道了大量有關 Th細胞及 Tc細胞表達1型和2型細胞因子的結(jié)果。Th1型淋巴細胞產(chǎn)生被稱作趨化因子的促炎癥反應的調(diào)停者 ,如 IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18、TNF-α和 INF-γ百分比,它們在白塞病患者中均增高[1,4,5,]。這一發(fā)現(xiàn)被白塞病黏膜皮膚皮損趨化因子表達的分析所證實。將白塞病皮損與正常皮膚比較發(fā)現(xiàn)IL-8、單核細胞引誘物蛋白-1、IFN-γ和IL-12mRNA的表達大量增加,提示 Th1型淋巴細胞在白塞病的發(fā)病中起直接作用[6]。關于 Th2型淋巴細胞和細胞因子這一結(jié)果還存在爭議。一些研究顯示CD8+T淋巴細胞、IL-4和 IL-10的水平下降[2,7];而另外一些研究則顯示CD8+T淋巴細胞總數(shù)和IL-4、IL-6、IL-10和 IL-13在血清中的濃度都是上升的[8,9,10],表明循環(huán)CD4+/CD8+的比率下降。實驗研究發(fā)現(xiàn)CD4+/CD8+的比率與正常人相比明顯下降,證實了上述第二種觀點。隨著對BD研究的深入和檢測方法的改進,人們發(fā)現(xiàn)BD的免疫紊亂與疾病的臨床表現(xiàn)、嚴重程度以及檢測所用的方法密切相關。IFN-γ和 IL-4分別是具有代表性的1型和2型細胞因子,文獻報道有關 IFN-γ在BD病人中的表達水平明顯上調(diào)[1],而IL-4在BD病人中的表達水平,結(jié)果差異比較大,分別有上調(diào)和下降等說法[2,7,8,9]。進一步分析BD患者外周血CD4和CD8 T細胞胞內(nèi)IFN-γ和IL-4的表達水平,了解患者體內(nèi) Th 1/Th2及 Tc1/Tc2的比例變化。研究結(jié)果表明,BD患者活動期外周血細胞 Th細胞和Tc細胞經(jīng)過刺激后胞內(nèi)合成 IFN-γ的水平明顯高于正常人水平 (Th 細胞:22.45% ±7.33%vs.16.32 ±4.96%,P<0.05;Tc 細胞:36.74% ±13.19%vs. 28.67% ±11.56%,P<0.05),穩(wěn)定期患者 Th細胞和 Tc細胞體外合成 IFN-γ的能力與正常人相比無明顯差異;穩(wěn)定期患者 Th細胞和Tc細胞胞內(nèi)合成IL-4的能力相對于正常人均無明顯差異,但總體水平卻略有上升趨勢:(穩(wěn)定期 Th細胞:3.01% ±1.38%vs. 2.87% ±1.46%,Tc細胞:1.14% ±0.28%vs. 1.07% ±0.32%,P>0.05)。而活動期患者Th細胞和Tc細胞胞內(nèi)合成IL-4的能力相對于正常人均存在明顯差異:(Th細胞:3.54% ±1.62%vs. 2.87% ±1.46%,Tc 細胞:1.82% ±0.43%vs. 1.07% ±0.32%,P<0.05);因此,BD穩(wěn)定期患者,與正常人相比外周血Th細胞和 Tc細胞表達1型和2型細胞因子的平衡無明顯的偏倚。由于BD活躍期患者 Th細胞和 Tc細胞胞內(nèi)合成 IFN-γ的能力明顯增強,導致 Th細胞和Tc細胞有偏向 Th1及 Tc1的趨勢(Th細胞IFN-γ/IL-4:6.34 ±3.24 vs. 5.69 ±4.72,P>0.05;Tc 細 胞 IFN-γ/IL-4:20.19 ±13.65 vs.26.79±14.52,P>0.05)。綜上實驗結(jié)果表明 ,BD患者外周血INF-γ和IL-4的表達水平明顯升高,并與疾病活動期存在一定程度相關,可能對白塞病患者的診斷具有重要的臨床意義。

[1]ssenblatt RB,Gery I,Weiner HL,et al:Treatment of uveitis by oral administration of retinal antigens:results of a phase I/II randomized masked trial.Am J Ophthalmol 1997,123:583-592

[2]Houman H,Hamzaoui A,Ben Ghorbal I,et al:Abnormal expression of chemokine receptors in Behc et’s disease:relationship to intracellular Th1/Th2 cytokines and to clinical manifestations.J Autoimmun 2004,23:267-273

[3]Revised Japanese criteria for Behcet’s disease.Behcet’s disease reseach committee of Japan 1987 congress news of the 6th SEAPAL congress of rheumatology 1988

[4]Tunc R,Saip S,Siva A,Yazici H:Cerebral venous thrombosis is associated with major vessel disease in Behcet’s syndrome.Ann Rheum Dis 2004,63:1693-1694

[5]Carletto A,Pacor M,Biasi D,et al:Changes of neutrophil migration without modification of in vitro metabolism and adhesion in Behc et’s disease.J Rheumatol 1997,24:1332-1336

[6]Bouloumie A,Schini-Kerth VB,Busse R.Vascular endothelial growth factor up-regulates nitric oxide synthase expression in endothelial cells.Cardiovasc Res 1999,41:773-780

[7]Mantas C,Direskeneli H,Eks ioglu-Demiralp E,Akoglu T:Serum levels of Th2 cytokines IL-4 and IL-10 in Behcet’s disease.J Rheumatol 1999,26:510-512

[8]Hamzaoui K,Hamzaoui A,Guemira F,et al:Cytokine profile in Behc et’s disease patients.Relationship with disease activity.Scand J Rheumatol 2002,31:205-210

[9]Houman H,Hamzaoui A,Ben Ghorbal I,et al:Tc1/Tc2 ratio in the inflammatory process in patients with Behc et’s disease.Mediators Inflamm 2004,13:247-253[10]Raziuddin S,al-Dalaan A,Bahabri S,et al:Divergent cytokine production profile in Behcet’s disease.Altered Th1/Th2 cell cytokine pattern.J Rheumatol 1998,25:329-333.

Relatiaonship between expression level of IFN-γand IL-4 expression in peripheral blood Th and Tc cells and Behcet’s disease

Fan Chao,Zheng Jinfeng,Chen Hongxiang

(Fu Yong Hospital of S henzhen,S henzhen518103,China)

Objective To detect the percentages of intracytoplasmic IFN-γand IL-4 expression in peripheral blood Th and Tc cells from patients with BD,and to study the immunological condition of the BD patient. Methods Flow cytometry was used to detect the percentages of intracytoplasmic IFN-γand IL-4 expression in peripheral blood Th and Tc cells from patients with BD(active n=22,stable n=6)and normal individuals(n=22),respectively. Results The percentages of intracytoplasmic IFN-γ expression in patients with BD(active)was higher than those of normal individuals(Th cell:22.45% ±7.33%vs. 16.32±4.96%,P<0.05;Tc cell:36.74% ±13.19%vs. 28.67% ±11.56%,P<0.05),but they were insignificent between stable BD and normal controls.The percentages of intracytoplasmic IL-4 expression in patients with BD(active)was also higher(Th cell:3.54% ±1.62%vs. 2.87% ±1.46%,Tc cell:1.82% ±0.43%vs. 1.07% ±0.32%,P<0.05),but they were insignificent between stable BD and normal controls. (Th cell:3.01% ±1.38%vs. 2.87% ±1.46%,Tc cell:1.14% ±0.28%vs. 1.07% ±0.32%,P>0.05);so that Th and Tc cells deflect to Th1 and Tc1(Th cell IFN-γ/IL-4:6.34 ±3.24 vs. 5.69 ±4.72,p>0.05;Tc cell IFN-γ/IL-4:20.19 ±13.65 vs. 26.79 ±14.52,p>0.05). Conclusion The percentages of intracytoplasmic IFN-γand IL-4 expression in peripheral blood Th and Tc cells from patients with active BD is significantly increased,which may be significant in the diagnosis of BD.

Behcet’s disease; γ-interferon; Interleukin-4

R329

A

10.3870/zgzzhx.2011.01.005

2010-02-10

2010-04-01

深圳市寶安區(qū)科技計劃項目(2008166)

樊超,男(1968年),漢族,醫(yī)學博士。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)