李茂榮劉正湘

(1北京航天總醫(yī)院心血管內(nèi)科,北京 100076;2華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院心血管內(nèi)科,武漢 430030)

C反應(yīng)蛋白真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建、表達及其對小鼠血管平滑肌細胞 TNF-α表達的影響

李茂榮1劉正湘2＊

(1北京航天總醫(yī)院心血管內(nèi)科,北京 100076;2華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院心血管內(nèi)科,武漢 430030)

目的 構(gòu)建小鼠C-反應(yīng)蛋白基因重組質(zhì)粒pIRES-CRP,觀測其對血管平滑肌細胞 TNF-α表達的影響。方法用RT-PCR法,以小鼠肝組織RNA為模板,擴增獲得編碼C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)的全長基因。將CRP基因克隆入真核表達質(zhì)粒pIRES中,構(gòu)建重組真核表達質(zhì)粒pIRES-CRP。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HeLa細胞,通過 RT-PCR法檢測CRPmRNA的表達,Western blot檢測CRP蛋白的表達。將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠血管平滑肌細胞,通過Western blot檢測CRP對 TNF-α表達的影響。結(jié)果 經(jīng)酶切鑒定、PCR和測序分析結(jié)果表明,所克隆的CRP基因與報道結(jié)果完全一致,重組體的連接方向正確,閱讀框與預(yù)期完全一致,真核表達質(zhì)粒pIRES-CRP構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒pIRES-CRP瞬時轉(zhuǎn)染 Hela細胞,通過RT-PCR和Western blot證實CRP基因得到表達。將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠血管平滑肌細胞,TNF-α的表達明顯高于空白對照組和空載體組(P<0.01)。結(jié)論 成功構(gòu)建小鼠CRP基因重組質(zhì)粒pIRES-CRP,CRP基因能在人子宮頸癌Hela細胞中正常轉(zhuǎn)錄和翻譯,表達的蛋白能與CRP的特異抗體反應(yīng)。CRP能明顯上調(diào)小鼠血管平滑肌細胞 TNF-α的表達,這為解釋CRP在冠狀動脈的形成過程中起著促炎作用提供了新的實驗依據(jù)。

小鼠肝細胞 ; 小鼠血管平滑肌細胞; C-反應(yīng)蛋白; TNF-α; 基因表達

C-反應(yīng)蛋白(CRP)是一種非特異性全身炎癥標志物,與許多慢性疾病的發(fā)病機制有關(guān),包括糖尿病(DM)、癌癥、老年癡呆癥、心血管(CV)疾病。事實上,全身循環(huán)高靈敏度C反應(yīng)蛋白的測量一直作為動脈粥樣硬化、充血性心力衰竭、房顫、心肌炎、主動脈瓣疾病和心臟移植預(yù)后的一種指標。CRP主要由肝細胞合成,受白介素,TNF等炎癥因子的調(diào)節(jié)。正常血漿水平低于5mg/L。當機體有創(chuàng)傷、感染、缺血壞死、炎癥及惡性腫瘤等刺激時,發(fā)生急相反應(yīng)。病變部位激活的細胞產(chǎn)生胞內(nèi)信號多肽-細胞因子,刺激急相反應(yīng)蛋白的生成。CRP是最主要的急性期蛋白,在急性反應(yīng)期其血清水平迅速升高,可達正常水平的數(shù)百倍,乃至上千倍[1-2]。但迄今為止,人們對CRP的具體功能尚未完全認識,其生理作用有待進一步研究。另外CRP在心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中是因還是果也有待研究[1,3]。

近年的研究表明,CRP不僅是一種炎性標志物,而且也調(diào)節(jié)其他炎性細胞因子的表達。TNF-α是與動脈粥樣硬化發(fā)病有關(guān)的主要炎性介質(zhì)。為此我們采用 RT-PCR技術(shù)將小鼠CRP基因擴增出來,利用基因工程技術(shù)將其克隆入真核表達載體pIRES中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pIRES-CRP,觀察其在真核細胞的表達及對TNF-α表達的影響,為深入研究該蛋白的生理功能及其與心血管疾病的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1.菌株與實驗動物

大腸埃希菌DH5α,pIRES質(zhì)粒,人子宮頸癌(Hela)細胞由本室保存。8周齡BALB/c小鼠購于同濟醫(yī)學院實驗動物學部。

2.酶與主要試劑

限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自 Takara公司,DNA聚合酶、DNA Marker購自華美生物工程公司,Trizol試劑為上海華舜生物工程公司產(chǎn)品,逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑是 Toyobo公司產(chǎn)品。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自 Invitrogen公司,兔抗小鼠CRP和 TNF-α單克隆抗體購自北京天為時代生物工程公司,羊抗兔酶標二抗購自武漢博士德生物工程有限公司,抗 GAPDH購自 Santa Cruz Biotechnology公司,細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基 DMEM(高糖)、胎牛血清購自 HYCLONE公司。

3.重組質(zhì)粒pIRES-CRP的構(gòu)建

采用TRIzol試劑從小鼠新鮮肝組織中提取總RNA,通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA,再以此cDNA為模板,利用CRP基因的上、下游引物(上游引物:5′-TTTCGCTA GCA TGGAGAAGCTACTCTGG-3′;下游 引物 :5′-GAACGAA TTCTCAGGACCACAGCTGCG-3′;上游引物 5’端引入 N heⅠ酶切位點,下游引物 5’端引入 EcoRⅠ酶切位點)擴增出CRP基因。將上述擴增的CRP基因及質(zhì)粒pIRES分別用 N heⅠ和 EcoRⅠ雙酶切后,回收大片段,利用T4 DNA連接酶連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài) E-.coli DH5α,接種于含有氨芐青霉素 (100μg/ml)的LB平板上篩選,隨機挑選4個陽性克隆進行菌落PCR鑒定,提取質(zhì)粒DNA進行 N heⅠ/EcoRⅠ雙酶切鑒定及測序鑒定。

4. RT-PCR和Western blot檢測CRP在 Hela細胞的表達

按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書,先將處于對數(shù)生長期的 Hela細胞按4×105/每孔 的密度置入六孔板,24h后將重組質(zhì)粒pIRES-CRP轉(zhuǎn)染 Hela細胞,同時設(shè)立陰性對照(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pIRES)及空白對照(未轉(zhuǎn)染的 Hela細胞)。轉(zhuǎn)染后每孔加入1 ml TRIzol,提取總RNA。以總RNA為模板,加入CRP上下游引物和人β-Actin上下游引物各10pmol/μl,進行 RT-PCR擴增,產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的 Hela細胞離心后去上清,加入2×上樣緩沖液,凍融2次,煮沸5min,進行 SDS-PAGE蛋白電泳。在上樣孔分別加入轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細胞,轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細胞和未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的細胞的裂解液,并且加入分子量Marker進行 SDS-PAGE蛋白電泳,將蛋白質(zhì)從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上,封閉,依次加入兔抗鼠CRP一抗和羊抗兔酶標二抗,然后用ECL顯色。內(nèi)參為 GAPDH。

5.血管平滑肌細胞的培養(yǎng)與鑒定

采用改良貼壁法,選擇體重為 20g左右的BALB/c小鼠,用拉頸法處死動物,無菌條件下取出主動脈,用DMEM高糖培養(yǎng)基洗2次以除凈血液,置于培養(yǎng)皿中,迅速撕除外膜并棄之。在培養(yǎng)液中將血管剪成約1mm的組織,移入2ml培養(yǎng)瓶,加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置37℃,5%CO2孵箱內(nèi)靜置培養(yǎng)4d后換液,待細胞長滿瓶底后用0.25%胰蛋白酶消化傳代。實驗采用3-5代細胞。

血管平滑肌細胞的鑒定:光鏡下細胞呈谷峰樣生長,特異性平滑肌α-肌動蛋白單克隆抗體免疫細胞化學染色見胞漿呈陽性染色。

6.Western blot檢測CRP對血管平滑肌細胞TNF-α表達的影響

按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書,先將處于對數(shù)生長期的血管平滑肌細胞按4×105/每孔的密度置入六孔板,24h后將重組質(zhì)粒pIRESCRP轉(zhuǎn)染血管平滑肌細胞,同時設(shè)立陰性對照(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pIRES)及空白對照(未轉(zhuǎn)染的血管平滑肌細胞)。轉(zhuǎn)染后細胞離心后去上清,加入2×上樣緩沖液,凍融 2次,煮沸 5min,進行 SDS-PAGE蛋白電泳。在上樣孔分別加入轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細胞,轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細胞和未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的細胞的裂解液,并且加入分子量Marker進行 SDS-PAGE蛋白電泳,將蛋白質(zhì)從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上,封閉,依次加入兔抗鼠 TNF-α一抗和羊抗兔酶標二抗,然后用 ECL顯色。內(nèi)參為 GAPDH。實驗重復(fù)3次,計算機軟件分析灰度值。

7.統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1.重組質(zhì)粒pIRES-CRP的鑒定

挑選陽性克隆進行擴增,提取質(zhì)粒pIRESCRP,用 N heⅠ/EcoRⅠ雙酶切可得到長約678bp小片段--即CRP,進行菌液 PCR擴增也得到了相應(yīng)條帶,表明重組質(zhì)粒pIRES-CRP構(gòu)建成功,(見圖1,2)。使用通用引物對插入片段進行兩個方向測序,雙向測序結(jié)果相吻合,測序結(jié)果經(jīng)BLAST分析,與小鼠CRP基因序列相吻合(見圖3)。

2.重組質(zhì)粒pIRES-CRP在子宮頸癌 Hela細胞中的表達鑒定

2.1 RT-PCR檢測CRP的表達

圖1 重組質(zhì)粒pIRES-CRP的雙酶切鑒定M1:1 kb Marker;M2:100bpMarker Lane1:1.pIRESCRP雙酶切鑒定 (N heI+EcoRI)Fig.1 Restriction enzymes maps of recombinant plasmid pIRES-CRPM:1 kb Marker;M2:100bpMarkerLane1:restriction enzymes map of pIRES-CRP(NheI+EcoRI),

圖2 重組質(zhì)粒pIRES-CRP的PCR鑒定M:100bp Marker;Lane1:重組質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物;Lane 2:含重組質(zhì)粒的菌液PCR產(chǎn)物Fig.2 PCR amplification ofrecombinantplasmid pIRES-CRPM:100bp Marker;Lane1:PCR amplification of pIRES-CRP;Lane 2:PCR amplification of Bacilli containing recombinant plasmid

以空質(zhì)粒pIRES轉(zhuǎn)染和不進行轉(zhuǎn)染的 Hela細胞作為對照,提取轉(zhuǎn)染細胞的RNA進行RT-PCR鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒pIRES-CRP的Hela細胞可擴增出大小約700bp CRP基因片段,對照組未擴增出相應(yīng)的基因片段。(見圖4)。

圖4 pIRES-CRP在 Hela細胞中表達的RT-PCR鑒定M:100bp Marker;Lane1:pIRES-CRP轉(zhuǎn)染 Hela細胞(內(nèi)參為β-actin);Lane2:pIRES質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的 Hela細胞(內(nèi)參為β-actin);Lane3:未轉(zhuǎn)染的 Hela細胞(內(nèi)參為β-actin);Fig.4 CRP expression of pIRES-CRP in Hela cells identified by RT-PCRM:100bp Marker;Lane1:Hela cells transfected with pIRES-CRP;Lane 2:Hela cells transfected with pIRES;Lane 3:Hela cells untransfected

圖3 CRP的測序鑒定(通過BLAST正反測序,得到下列圖譜,其中有一處是兩次測序結(jié)果拼接而成)Fig.3 Sequencing of CRP

2.2 Western blot檢測CRP蛋白的表達

重組質(zhì)粒pIRES-CRP轉(zhuǎn)染 Hela細胞后,收集細胞進行裂解,離心收集上清,按常規(guī)方法進行SDSPAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,加入兔抗鼠CRP一抗和羊抗兔酶標二抗,然后用ECL顯色。結(jié)果顯示:pIRES-CRP轉(zhuǎn)染的Hela細胞檢測到CRP的表達,對照組未檢測到CRP的表達,表明重組質(zhì)粒pIRES-CRP能在 Hela細胞表達。(見圖5)。

圖5 CRP在 Hela細胞中表達的Western blot分析Lane1:未轉(zhuǎn)染的 Hela細胞 ;Lane2:pIRES質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的 Hela細胞;Lane3:pIRES-CRP轉(zhuǎn)染 Hela細胞Fig5 CRP expression of pIRES-CRP in Hela cells identified by Western blotLane1:Hela cells untransfected;Lane 2:Hela cells transfected with pIRES;Lane 3:Hela cells transfected with pIRES-CRP

2.3 重組質(zhì)粒pIRES-CRP對血管平滑肌細胞TNF-α表達的影響

重組質(zhì)粒pIRES-CRP轉(zhuǎn)染血管平滑肌細胞后,收集細胞進行裂解,離心收集上清,按常規(guī)方法進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,依次加入兔抗鼠TNF-α一抗和羊抗兔酶標二抗,然后用 ECL顯色。計算機軟件分析灰度值。結(jié)果表明,pIRES-CRP轉(zhuǎn)染組,pIRES空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染質(zhì)?？瞻讓φ战M的 TNF-α與 GAPDH蛋白表達灰度植分別為0.496 ±0.08,0.184 ±0.03,0.113 ±0.027。pIRESCRP轉(zhuǎn)染組 TNF-α的表達水平顯著高于其它各組(P<0.01)。

圖6 pIRES-CRP質(zhì)粒對 TNF-α表達的影響Lane1:pIRES-CRP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的血管平滑肌細胞;Lane2:pIRES質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的血管平滑肌細胞;Lane3:未轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染的血管平滑肌細胞Fig.6 Effect of pIRES-CRP Plasmid on the expression of TNF-αLane1:mouse aortic smooth muscle cells transfected with pIRES-CRP;Lane 2:mouse aortic smooth muscle cells transfected with pIRES;Lane 3:mouse aortic smooth muscle cells untransfected

討 論

CRP是一種炎癥反應(yīng)時的急性時相蛋白,因其能與肺炎雙球菌細胞壁上的C多糖結(jié)合而得名。屬結(jié)構(gòu)上非常保守的穿透素蛋白家族成員,由5個完全相同的非糖基化亞單位通過非共價鍵相連,每個亞單位由206個氨基酸組成,分子量23kD。它不僅是炎癥標志物,而且本身直接參與炎癥過程[3-4]。當感染和組織損傷時可激活巨噬細胞和其他白細胞等,這些細胞產(chǎn)生白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1(IL-1)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細胞因子。這些細胞因子和其他介導物質(zhì)到達肝臟,刺激肝細胞和上皮細胞合成CRP,外周血淋巴細胞亦能合成少量CRP[3]。它通過經(jīng)典途徑激活補體,釋放炎癥介質(zhì),促進粘附和吞噬細胞反應(yīng),使靶細胞溶解;作用淋巴細胞和單核細胞受體,致淋巴細胞壞死、增生,促進淋巴因子生成,并促進抑制性 T淋巴細胞增生,也增強了吞噬細胞的吞噬作用;抑制血小板的聚集和釋放反應(yīng),還能妨礙血小板引起血管收縮;刺激單核細胞表面的組織因子表達和其它免疫調(diào)控功能。此外,CRP濃度的增高是導致心血管疾病的直接因素,它的增高不僅僅是一種伴隨現(xiàn)象,研究表明在糾正了其他危險因子后,CRP濃度的增高仍是心血管疾病的獨立危險因子[1,6,7]。

CRP原本是一個非特異的炎性標志物,但最近的許多研究提示CRP可能在冠狀動脈的形成、發(fā)展和演變過程中起著直接的病理生理作用[8-9],其機制包括:刺激內(nèi)皮細胞分泌 E-選擇素、細胞間粘附分子、血管粘附分子、血小板趨化因子、白細胞介素-6;調(diào)節(jié)動脈壁內(nèi)多種細胞及循環(huán)中單核細胞,促進炎性因子的分泌;調(diào)節(jié)巨噬細胞攝取低密度脂蛋白,然后變?yōu)榕菽毎?增強其他炎性介質(zhì)的炎性效應(yīng);促進血管內(nèi)皮細胞增生、遷移、動脈內(nèi)膜增厚,抑制內(nèi)皮細胞的生存與分化,參與動脈硬化的發(fā)生發(fā)展過程。CRP也是急性冠脈綜合癥斑塊破裂的決定因素。即使沒有血脂異常、高血壓、吸煙史、糖尿病和冠心病家族史,CRP也是冠心病的獨立預(yù)測因子和心肌梗死的危險因子。檢測CRP可提高傳統(tǒng)危險因子的預(yù)測價值[10-12]。近期的研究表明,CRP通過刺激IL-6的產(chǎn)生,抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ表達,在動脈粥樣硬化形成中具有促炎作用[13]。

但迄今為止,人們對CRP的具體功能尚未完全認識,因此深入研究其生理作用具有十分重要的意義。是CRP水平的升高引起了心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展,還是心血管疾病的產(chǎn)生引起了CRP水平的升高也有待研究[3],CRP與其他炎性細胞因子的關(guān)系亦有待研究。為了深入研究CRP的作用機制,研究采用重組DNA技術(shù),將編碼CRP蛋白基因克隆入真核表達載體pIRES中,構(gòu)建成真核表達質(zhì)粒pIRES-CRP。將重組質(zhì)粒pIRES-CRP瞬時轉(zhuǎn)染Hela細胞,通過 RT-PCR和 Western blot證實 C-反應(yīng)蛋白基因得到表達,表達的蛋白能與CRP的特異抗體反應(yīng)。

TNF-α具有多種生物學作用,一方面參與機體的免疫防御功能,維持機體的穩(wěn)態(tài)及抵御各種致病因子,可選擇殺傷腫瘤細胞;另一方面 TNF-α的異常分泌又可介導休克、炎癥反應(yīng)、組織損傷等病理生理反應(yīng),參與細胞的凋亡過程。在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中,TNF-α作為炎性細胞因子可能扮演了重要角色,但 TNF-α與CRP的關(guān)系并不十分清楚。以前人們認為當感染和組織損傷時,巨噬細胞和其他白細胞分泌 TNF-α及其他細胞因子,刺激肝細胞和上皮細胞合成CRP。但我們的實驗發(fā)現(xiàn),CRP可刺激血管平滑肌細胞表達TNF-α,表明CRP水平升高可加速 TNF-α的產(chǎn)生,促進炎癥反應(yīng),從而為解釋CRP在冠狀動脈病變的形成、發(fā)展和演變過程中起著直接的病理生理作用提供了新的實驗依據(jù)。

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Construction and exprerssion of mouse C-reactive protein eukaraotic plasmid and its effect on TNF-αexpression in mouse aortic smooth muscle cells

Li Maorong1Liu Zhengxiang2﹡

(1Department of Cardiology,Beijing Aerospace General Hospital,Beijing100076;2Department of Cardiology,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,W uhan430030,China)

Objective To obtain the full length gene of C-reactive protein(CRP)from mouse liver cells,to construct the recombination plasmid pIRES-CRP and to investigate its effect on TNF-αExpression in mouse aortic smooth muscle cells.Methods CRP genes were obtained by RT-PCR with total RNA of mouse as the template and cloned into the eukaryotic expression plasmid pIRES to construct the recombinant plasmid pIRES-CRP.After the recombinant plasmid pIRES-CRP was transfected into Hela cells,the expression of CRP genes was detected by using RT-PCR and Western blot. The expression of TNF-α genes was detected by using Western blot when the recombinant plasmid pIRES-CRP was transfected into mouse aortic smooth muscle cells.Results Restriction enzyme analysis,PCR and sequencing results showed that the recombinant plasmid pIRES-CRP was constructed successfully.After the recombinant plasmid pIRESCRP was transfected into Hela cells,the expression of CRP genes could be detected by RT-PCR and Western blot. The expression of TNF-α genes was significantly higher than that in the control group and the vector group(P<0.01)when the recombinant plasmid pIRES-CRP was transfected into mouse aortic smooth muscle cells.Conclusion The eukaryotic expression plasmid pIRES-CRP was constructed successfully and CRP genes of mice were expressed in Hela cells by this vector. The expression of TNF-α genes of mouse aortic smooth muscle cells can be promoted by CRP,which provides new evidence for the pro-inflammatory action of CRP in atherogenesis.

Mouse liver cell; Mouse aortic smooth muscle cell; C-reactive protein;TNF-α;Gene expression

R329

A

10.3870/zgzzhx.2011.01.003

2010-10-10

2010-12-01

李茂榮,男(1968年),漢族,碩士,副主任醫(yī)師

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)