張 燕 武慶平 姚尚龍

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院麻醉科,武漢 430022)

周期性機(jī)械牽張對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞Cyr61表達(dá)的影響

張 燕 武慶平 姚尚龍＊

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院麻醉科,武漢 430022)

目的 研究周期性牽張肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞株A549細(xì)胞對(duì)Cyr61表達(dá)的影響。方法 對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞株A549細(xì)胞施加周期性機(jī)械牽張應(yīng)力。加載頻率0.5H z,加載時(shí)間2 h,加載應(yīng)力分別為5%,15%,30%。加載應(yīng)力為15%,加載頻率0.5Hz,加載時(shí)間分別0,15min,30min,60min,120min。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均設(shè)立空白對(duì)照即不給予機(jī)械應(yīng)力。用PCR法測(cè)定Cyr61mRNA的表達(dá),用western法測(cè)定Cyr61蛋白含量。結(jié)果 隨著加載應(yīng)力的增加和加載時(shí)間的延長(zhǎng),Cyr61蛋白含量和mRNA表達(dá)均增加(P<0.05);施加不同加載幅度后,Cyr61蛋白含量和mRNA表達(dá)均增加(P<0.05)。結(jié)論 肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞IL-8的產(chǎn)生和釋放與周期性的機(jī)械牽張應(yīng)力呈強(qiáng)度和時(shí)間依賴(lài)性。

周期性牽張; Cyr61; 肺泡上皮細(xì)胞

對(duì)于呼吸功能?chē)?yán)重受損的病人,機(jī)械通氣是一種必不可少的治療手段。但最近二十多年逐漸發(fā)現(xiàn),機(jī)械通氣治療其實(shí)是一把雙刃劍,在提供了一種有效的呼吸支持治療的同時(shí),還能導(dǎo)致肺部嚴(yán)重的損傷,即機(jī)械通氣所致的肺損傷(ventilator-induced lung injury,VILI)[1]。Cyr61 (cysteine-rich 61,CCN1)是PDEF或轉(zhuǎn)化因子刺激小鼠成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子,因富含半胱氨酸而被命名,它是CCN家族第一個(gè)被克隆的基因也是最具代表性的一員。近幾年研究表明,Cyr61與機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷密切相關(guān)[2]。本研究旨在通過(guò)研究周期性牽張對(duì)肺泡 Ⅱ型上皮細(xì)胞株 A549細(xì)胞Cyr61表達(dá)的影響,為進(jìn)一步研究Cyr61與機(jī)械通氣所致肺損傷的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1.材料和試劑

肺癌A549細(xì)胞由協(xié)和醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供;Cyr61單克隆抗體購(gòu)于RD公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)

肺癌A549細(xì)胞由協(xié)和醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供,置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,于恒溫恒濕CO2孵育箱內(nèi)孵育過(guò)夜。細(xì)胞貼壁并50%融合后,用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液洗3遍,并換成無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液,按照以下的設(shè)計(jì)方案進(jìn)行加載。

3.細(xì)胞牽張模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組

肺癌A549細(xì)胞在在37℃、5%CO2孵箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞拉伸加載裝置,該裝置加載原理是用一個(gè)真空泵抽吸由特制彈性硅膠膜制成的培養(yǎng)皿底部,形成負(fù)壓使培養(yǎng)皿底部產(chǎn)生拉伸變形,從而使附底生長(zhǎng)的細(xì)胞受機(jī)械牽張。細(xì)胞所受力值大小以培養(yǎng)皿底部硅膠膜拉伸應(yīng)變率(%)表示,拉伸率越大,表示細(xì)胞所受張力越大.方案一:加載頻率0.5Hz,加載時(shí)間2h,加載力分別為5%,15%,30%。方案二:加載應(yīng)力為 15%,加載頻率0.5Hz,加載時(shí)間分別為 15,30,60,120min。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均設(shè)立空白對(duì)照組即不給于機(jī)械牽張力,但細(xì)胞仍接種于包被I型膠原的6孔板上,進(jìn)行加載時(shí)與加載細(xì)胞放在同一細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。

4.半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)定Cyr61mRNA表達(dá)

消化、收集上述裂解細(xì)胞,提取細(xì)胞總 RNA。用cDNA合成試劑盒,按照操作說(shuō)明書(shū)合成cDNA。PCR反應(yīng)中,Cyr61引物序列為,上游引物:5’-TCGTCACCCTTCTCCACTT-3’,下游引物 5’-CGTCACA GACCCACTCCTC-3’,擴(kuò)增片段大小為113bp。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5min,94℃變性 40S,57.7℃40s,72℃60s,35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠顯色,紫外燈下觀察。圖像用 Foretix 1D軟件作灰度掃描,結(jié)果以Cyr61和內(nèi)參照 GAPDH113吸光光度值的比值來(lái)反映其相對(duì)含量。

5.免疫印記法(Western Blot)檢測(cè)Cyr61蛋白表達(dá)的變化

消化、收集上述細(xì)胞,RIPA法提取細(xì)胞總蛋白,采用Brad ford法檢測(cè)提取總蛋白濃度。將蛋白經(jīng)12%SDS-PAGF電泳分離后,電轉(zhuǎn)4h轉(zhuǎn)移至PVDF膜,37℃5%脫脂奶溶液封閉2h,然后與1:100一抗溶液(一抗為鼠抗人Cyr61單抗)反應(yīng)過(guò)夜,0.1%Tween20磷酸緩沖液漂洗后,再與1:1000辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(二抗為羊抗鼠 IgG/HRP)37℃孵育2h,洗膜后進(jìn)行顯色反應(yīng),顯色后以β-actin為內(nèi)參照,觀察Cyr61蛋白表達(dá)強(qiáng)度的變化。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以±s表示,組間及組內(nèi)比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.不同大小機(jī)械牽張力對(duì)肺癌 A549細(xì)胞Cyr61表達(dá)的影響。

半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(圖1)和Western Blot(圖2)結(jié)果顯示,隨著加載應(yīng)力的增加,肺癌A549細(xì)胞Cyr61表達(dá)隨著機(jī)械牽張力的增加而明顯增加。以 GAPDH為參照,加力2h后,Cyr61/GAPDH的相對(duì)光密度值,隨加載形變率的增大而明顯增大,各組間相互比較有顯著性差異 (P

圖1 牽張組周期牽張不同幅度A549細(xì)胞Cyr61 mRNA的表達(dá)變化Fig.1 Effect of different stretch strain on mRNA expression of Cyr61 of A549 cell.

圖2 牽張組周期牽張不同幅度A549細(xì)胞Cyr61蛋白的表達(dá)變化Fig.2 Effect of different stretch strain on protein expression of Cyr61 of A549 cell.

表1 不同大小牽張應(yīng)力作用下A549細(xì)胞Cyr61 mRNA和蛋白表達(dá)的相對(duì)光密度值Table 1 OD of different stretch strain on mRNA and protein expression of Cyr61 of A549 cell

2.不同牽張時(shí)間對(duì)肺癌A549細(xì)胞Cyr61表達(dá)的影響

半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(圖3)和Western Blot(圖4)結(jié)果顯示,以 GAPDH為參照,加載應(yīng)力為15%,加載頻率0.5Hz,Cyr61/GAPDH的相對(duì)光密度值,隨著加載時(shí)間的增加,在60min時(shí)達(dá)到高峰。各組間相互比較有顯著性差異 (P

圖3 牽張組周期牽張不同時(shí)間A549細(xì)胞Cyr61 mRNA的表達(dá)Fig.3 Effect of different stretch length of time on mRNA expression of Cyr61 A549 cell.

圖4 牽張組周期牽張不同幅度A549細(xì)胞Cyr61蛋白的表達(dá)變化Fig.4 Effect of different stretch length of time on protein expression of Cyr61 A549 cell.

討 論

機(jī)械通氣在危重病的救治過(guò)程中起著重要作用,但由于呼吸機(jī)使用不當(dāng)引起的呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷(ventilator-induced lung injury,VILI)又成為臨床常見(jiàn)而嚴(yán)重的并發(fā)癥。目前研究發(fā)現(xiàn),過(guò)度通氣的機(jī)械牽張可導(dǎo)致肺組織生物傷,加重肺損傷,其生物傷的主要表現(xiàn)以肺中性粒細(xì)胞滲透,以及支氣管肺泡盥洗液(BALF)中高水平促炎介質(zhì)上調(diào)為特征的炎癥反應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞受到機(jī)械力作用時(shí),通過(guò)影響即早基因(early response genes)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)如c-fos,c-jun,c-myc和Egr-I啟動(dòng)和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)酶的活性。已經(jīng)證明這些即早基因的順式調(diào)節(jié)序列中含有張力反應(yīng)元件(stretch-response elements),而在剪切力反應(yīng)元件(shear stress-responsive elements)區(qū)域含有不同基因結(jié)合位點(diǎn)。Copland等利用基因芯片、real-time PCR和激光纖維切割等技術(shù)研究證實(shí)無(wú)病變肺組織進(jìn)行高潮氣量而非損傷性機(jī)械通氣(V 25/ml,RR 30次/min,ZEEP=0)時(shí)即可較早的上調(diào) Egr-1、IL-l、Nur77、BTG2等 l0種基因和下調(diào)l2種基因的表達(dá),說(shuō)明機(jī)械通氣這可誘發(fā)肺內(nèi)的一些敏感基因較早發(fā)生變化【3】。研究報(bào)道,通過(guò)沉默張力敏感基因,抑制其效應(yīng)蛋白的合成,可以阻斷該類(lèi)蛋白對(duì)肺損傷作用,減輕VILI的程度。

表2 不同大小牽張時(shí)間作用下A549細(xì)胞Cyr61mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的相對(duì)光密度值Table 2 OD of different stretch length of time on mRNA and protein expression of Cyr6 of A549 cell

Cyr61是PDEF或轉(zhuǎn)化因子刺激小鼠成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。因富含半胱氨酸(含10%的半胱氨酸殘基)而被命名。它是CCN家族第一個(gè)被克隆的基因,也是最具代表性的一員。Cyr61廣泛存在于人類(lèi)各種組織器官中,如胎盤(pán)、心、肺、腦、胰腺和結(jié)締組織等,在胚胎腎組織中CYR61含量較高,而在胃腸道、前列腺、肝臟、腎臟中其表達(dá)相對(duì)較低。Cyr61處于細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游,調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的黏附、遷移與增殖,誘導(dǎo)血管發(fā)生,參與炎癥反應(yīng)、傷口愈合和組織重塑過(guò)程,研究表明,Cyr61表達(dá)與胚胎發(fā)育,新生血管形成,軟骨形成或創(chuàng)傷愈合的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮不同作用[4]。Tamas等研究發(fā)現(xiàn)給小鼠高潮氣量通氣時(shí),可較早上調(diào)Cyr61等十多種基因的表達(dá),說(shuō)明機(jī)械通氣這可誘發(fā)肺內(nèi)的一些敏感基因較早發(fā)生變化[5]。由此可見(jiàn),Cyr61是與機(jī)械性肺損傷密切相關(guān)的張力敏感基因,Cyr61的上調(diào)可能引發(fā)了一系列生物學(xué)反應(yīng),參與了肺損傷的進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)Cyr61與牽張相關(guān)生理病理過(guò)程有著密切的關(guān)系,機(jī)械牽張可通過(guò)影響Egr-1的轉(zhuǎn)錄迅速提高Cyr61在血管平滑肌細(xì)胞的表達(dá)水平,從而在血管生成早期發(fā)揮影響。機(jī)械牽張還誘導(dǎo)Cyr61在心肌組織的大量表達(dá),Cyr61是壓力超負(fù)荷心肌肥大的早期指標(biāo),機(jī)械牽張通過(guò) PKC,PI3K等多條等通路上調(diào)Cyr61在膀胱平滑肌細(xì)胞中的表達(dá),Cyr61是平滑肌細(xì)胞的分化的早期信號(hào)分子,可能與平滑肌細(xì)胞肥大的疾病進(jìn)程相關(guān)[6]。但是國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于牽張引起Cyr61在肺上皮細(xì)胞的表達(dá)研究較少。Lin等研究發(fā)現(xiàn),Cyr61可與細(xì)胞表面的整合素分子結(jié)合,激活下游的NF-κB通路[7]。NF-κB是細(xì)胞內(nèi)的一類(lèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子,它由P50和P65兩個(gè)亞基組成,在靜息細(xì)胞,NF-κB與抑制蛋白(IκB-)結(jié)合以三聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)細(xì)胞受到適當(dāng)刺激時(shí),IκB與NF-κB發(fā)生解離,NF-κB就激活由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核,與靶基因上的特異性序列結(jié)合,啟動(dòng)和調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄。細(xì)胞學(xué)的研究表明,肺上皮細(xì)胞受到機(jī)械牽拉時(shí)NF-κB顯著激活,上調(diào)多種致炎因子的表達(dá),而NF-κB抑制劑能顯著下調(diào)張力刺激引起的致炎因子的表達(dá),提示NF-κB可能在機(jī)械張力介導(dǎo)肺損傷中起著非常重要的作用。等研究表明,牽張肺癌 A549細(xì)胞,NF-κB與IκB-解離,激活由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核,并引起下游細(xì)胞因子IL-8的表達(dá)?？傊?NF-κB系統(tǒng)激活后調(diào)節(jié)致炎因子的表達(dá)可能是VILI致病機(jī)制的中心環(huán)節(jié)之一。由此可推斷,機(jī)械牽張肺上皮細(xì)胞導(dǎo)致Cyr61激活,Cyr61與細(xì)胞表面的整合素分子結(jié)合激活下游的 NF-κB通路。NF-κB系統(tǒng)激活后調(diào)節(jié)致炎因子的表達(dá),引起肺損傷。

機(jī)械應(yīng)力對(duì)細(xì)胞的影響與力的大小、頻率及持續(xù)時(shí)間有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞力學(xué)水平研究了周期性牽張對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞Cyr61表達(dá)的影響,結(jié)果表明機(jī)械牽張肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞時(shí),肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549細(xì)胞以牽張應(yīng)力的強(qiáng)度和時(shí)間依賴(lài)的方式產(chǎn)生和釋放Cyr61。這為機(jī)械通氣性肺損傷在細(xì)胞分子水平提供了理論依據(jù),阻斷Cyr61的表達(dá)可能阻斷其下游炎性介質(zhì)的產(chǎn)生,為機(jī)械通氣性肺損傷的治療提供了一個(gè)新的靶點(diǎn),這為進(jìn)一步研究Cyr61與機(jī)械性肺損傷的關(guān)系以及深入研究機(jī)械性肺損傷的機(jī)制和治療原則奠定了基礎(chǔ)。

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Effect of cyclic mechanical stretch on Cyr61 expression in typeⅡalveolar epithelial cells

Zhang Yan,Wu Qingping,Yao Shanglong＊

(Department of A nesthesiology of Union Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,W uhan430022,China)

Objective To investigate the effect of cyclic mechanical stretch of type Ⅱalveolar epithelial cells on the production and release of Cyr61.Methods The typeⅡalveolar epithelial cell line A549 cells were exposed to cyclic mechanical stretch.The experiment was performed in 2 parts.In part 1,A549 cells were exposed to different strains(5%,15%,30%)at the frequency of 0.5 HZfor 2 hours.In part 2,A549 cells were stretched for different lengths of time(15min,30min,60min,120min).RT-PCR and Western blot were used to assess the levels of Cyr61 mRNA and proteins.Results A549 cells subjected to cyclic stretch produced and released cyr61 mRNA and protein in a time and intensity de pendent manner(P<0.05).Conclusion Cyclic mechanical stretch o f typeⅡepithelial cells can induce mRNA and proteins to produce cyr61 in a time and intensity dependent manner.

Cyclic mechanical stretch; Cyr61; Alveolar epithelial cell

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

10.3870/zgzzhx.2011.01.010

2010-11-03

2010-12-06

張 燕,女(1982年),漢族,醫(yī)學(xué)博士。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)