熊 敏 朱桂金

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心,武漢 430030)

小鼠pDsRed-Meis1真核表達載體構建及子宮內表達的鑒定

熊 敏 朱桂金＊

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心,武漢 430030)

目的 構建小鼠Myeloid ectropic viral integration site 1(Meis1)基因和紅色熒光蛋白(Red fluorescence protein,RFP)真核表達質粒,為進一步研究Meis1在生殖系統(tǒng)中的功能提供基礎。方法 設計引物,擴增含Meis1片段的克隆質粒中的meis1基因片段,將其插入真核表達載體pDsRed-N1,重組質粒經(jīng)酶切鑒定后測序,并轉染至小鼠子宮;用Western blot及免疫組織化學方法鑒定外源基因Meis1的表達。結果 酶切和測序結果表明,構建的pDsRed-Meis1重組質粒正確;Western blot結果顯示,外源性Meis1高表達于孕D2的小鼠子宮;轉染后冰凍切片結果顯示,帶紅色熒光蛋白的陽性產(chǎn)物表達于孕D4的小鼠子宮內膜及全層;免疫組織化學結果顯示,Meis1陽性產(chǎn)物主要表達于孕小鼠子宮上皮、腺體和基質細胞內。結論 正確構建了pDsRed-Meis1真核表達質粒,并成功轉染及高表達于小鼠子宮,為進一步探討Meis1在生殖系統(tǒng)中的功能提供了有利工具。

meis1基因; 重組質粒; 宮腔內轉染

哺乳動物的胚胎著床是一個極其復雜的過程。胚胎的成功植入需要發(fā)育良好的胚胎,具有容受性的子宮內膜以及胚胎與子宮內膜之間的交互過程。HOX genes是調節(jié)子宮發(fā)育和胚胎著床的重要分子,Meis1作為HOX genes的輔助因子近年被發(fā)現(xiàn)在胚胎著床方面也發(fā)揮重要作用。為研究Meis1在胚胎著床方面的調節(jié)功能和分子間相互作用,我們構建了小鼠pDsRed-Meis1真核表達載體。

材料和方法

1.材料

高保真PCR反應試劑盒購于transgene公司,限制性內切酶EcoRI,KpnI和T4 DNA連接酶購于fermentas公司,膠回收試劑盒購于OMIGA公司。引物由上海英駿公司合成,測序由北京諾賽生物有限公司完成。Meis1山羊多克隆抗體,鼠抗β-actin單克隆抗體購于Santacruz公司,opti-MEM培養(yǎng)基Lipofectamine TM2000試劑購于invetrogen公司,免疫組化試劑盒購于博士德公司。BCA蛋白濃度檢測試劑盒和ECL發(fā)光試劑盒為PIERCE公司產(chǎn)品。Meis1 cDNA購于廣州復能基因有限公司。pDsRed-N1由華中科技大學同濟醫(yī)學院李和教授惠贈。

2.實驗動物

購于同濟醫(yī)院動物實驗中心,清潔級,成熟未育的昆明種小鼠,8-10周齡,體重25-35 g,適應性被飼養(yǎng)7d后,進入實驗,自然光照,自由取水和攝食,將雌雄小鼠按2:1的比例合籠,次日9時檢查,發(fā)現(xiàn)陰栓定為妊娠第1d(D1)。

3.pDsRed-Meis1質粒構建

根據(jù) meis1基因全序列 (Genebank:BC023689.1)設計 PCR 擴增引物,上游:5’TATAGAATTCATGGCGCAAAGGTACG 3’;下游:5’GTTAGGTACCTTTACCAGGCAGCAGC 3’PCR反應條件:95℃5min,95℃30s,58℃40s,72℃120s,35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后在紫外光下切下目的條帶,用omiga膠回收試劑盒回收純化,經(jīng) EcoRI和 KpnI雙酶切30min,酶切回收后16℃T4 DNA連接酶連接過夜,用DH5a感受態(tài)細菌轉化,挑取單克隆菌小提質粒,酶切鑒定條帶位置正確后送諾賽基因有限公司測序鑒定。測序正確的質粒大量制備。

4.小鼠宮腔內轉染重組質粒

取pDsRed-N1-Meis1重組質粒及空白質粒pDsRed-N1各 l-2μl,脂質體 2μl分別加入 25μl無血清培養(yǎng)基(Opti-MEM)中,混合這兩種溶液,使DNA和脂質體終濃度分別為16g/ml和40 g/ml,在室溫下孵育20 min,即配制為DNA/脂質體復合物。取妊娠第2d(D2)的小鼠,腹腔注射1%戊巴比妥充分麻醉后固定,作背部正中切口,暴露雙側卵巢及子宮,使用微量注射器分別從近卵巢側子宮角部向官腔內注入25μl DNA/脂質體復合物,左側子宮注射空白質粒/脂質體復合物,右側子宮注射重組質粒/脂質體復合物。用4-0絲線縫合腹腔和皮下。實驗小鼠12只。

5.Western blot:轉染后Meis1蛋白表達檢測:

質粒轉染后48-72h,取小鼠子宮標本,150μl三去污裂解液冰上裂解小鼠子宮內膜組織20 min,4℃12,000 r/min離心15min,取上清,BCA法測定蛋白濃度。60g蛋白樣品溶解于5×SDS凝膠加樣緩沖液后行10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPA GE),后將蛋白條帶轉移至 PVDF膜。羊抗鼠Meisl多克隆抗體濃度為1:100,羊抗鼠-actin單克隆抗體濃度為1:5000,4℃孵育過夜。用增強化學發(fā)光(ECL)進行顯色,KODA K Image成像系統(tǒng)western blotting成像。

6.熒光顯微鏡觀察冰凍切片:Meisl-Red蛋白表達的檢測

質粒轉染后48-72h,取小鼠子宮標本,常規(guī)冰凍切片,切片(厚度8μm)。立即熒光顯微鏡下觀察紅色熒光表達。

7.免疫組織化學染色:Meisl蛋白表達的檢測

質粒轉染后48-72h,取小鼠子宮標本,固定,包埋。切片(厚度5μm)常規(guī)脫蠟、入水,免疫染色程序嚴格按試劑盒說明進行。主要步驟:3%H2O2:甲醛封閉內源性過氧化物酶,微波修復抗原,依次加入Meisl的一抗(羊抗鼠多克隆抗,1:150),二抗(兔抗羊多克隆抗體,1:50),辣根過氧化酶鏈親和素(1:200),DAB顯色,蘇木素復染。

結 果

1.表達質粒pDsRed-N1-Meis1的構建及鑒定

質粒構建后,用含陽性克隆的細菌大提質粒,進行PCR,EcoRI和 KpnI雙酶切鑒定,結果可見meis1條帶(見圖1),提示質粒構建正確。送菌液測序,結果顯示插入序列無突變(測序圖未列出)。

圖1 重組質粒pDsRed-Meis1的PCR及酶切鑒定。a:重組質粒pDsRed-Meis1的 PCR鑒定;b:重組質粒pD-sRed-Meis1的酶切鑒定Fig.1 The analysis of the recombinant plasmid pDsRed-Meis1 with PCR(a)and digested by restriction enzyme(b)

2.質粒轉染小鼠子宮后Meis1蛋白表達western blotting鑒定

質粒pDsRed-Meis1和空pDsRed-N1質粒轉染圍著床期小鼠子宮,提取組織總蛋白進行Western blot檢測Meis1蛋白的表達,可見構建的pD-sRed-Meis1質?？梢栽谛∈笞訉m高效表達(見圖2)。

圖2 重組質粒pDsRed-Meis1和空白質粒pDsRed-N1轉染小鼠子宮western blot鑒定Fig.2 the expressions of Meis1 protein in pDsRed-Meis1 plasmid and pDsRed-N1 transferred uterus in mice

3.熒光顯微鏡觀察Meis1-Red融合蛋白的表達

冰凍切片立即熒光顯微鏡下觀察Meis1-紅色熒光融合蛋白的表達情況?？梢娙诤系鞍壮晒Ρ磉_于小鼠子宮內膜及全層(見圖3)。

圖3 A白光下觀察轉染pDsRed-Meis1小鼠子宮;B紅色熒光蛋白激發(fā)光下觀察轉染pDsRed-Meis1小鼠子宮;放大倍數(shù)×100;S:漿膜;L:腔上皮Fig.3 A:transferred pDsRed-Meis1 plasmid uterus in mice under white light;B:transferred pDsRed-Meis1 plasmid uterus in mice under fluorescent light;magnification:×100.S:serosa;L:luminal epithelia.

4.質粒轉染小鼠子宮后Meis1蛋白表達免疫組化鑒定

免疫組織化學結果:Meisl表達于子宮內膜腺體、腔上皮和基質細胞。腺體、腔上皮和基質細胞核中均可見褐色顆粒。重組質粒DsRed-Meis1轉染組及空白組(見圖4)。

圖4 重組質粒pDsRed-Meis1和空白質粒pDsRed-N1轉染小鼠子宮Meis1的表達.a:重組質粒pDsRed-Meis1轉染小鼠子宮Meis1的表達;b:空白質粒pDsRed-N1轉染小鼠子宮Meis1的表達Fig.4 murine endometrial Meis1 expression with recombinant pDsRed-Meis1 and empty vector transferred.a:murine endometrial Meis1 expression with recombinant pDsRed-Meis1 transferred;b:murine endometrial Meis1 expression with empty vector pDsRed-N1 transferred.

討 論

目前,全世界10-15%的育齡夫婦受到不孕癥的困擾,不孕癥已成為危害人類身心健康最常見的疾病之一。輔助生殖技術(Assisted reproductive technologyART)經(jīng)過近30年的發(fā)展,超排卵新藥物及方案的采用和胚胎體外培養(yǎng)技術的完善,使得IVF治療中獲得胚胎的數(shù)量和質量得到了保證,但胚胎著床率和臨床妊娠率仍未有突破。胚胎植入的相關分子也逐步成為研究熱點。眾多學者利用基因芯片及基因敲除技術,篩選出一系列與胚胎著床相關的因子。[2]Hoxa10和 Hoxa11是 HOX genes家族中A簇的成員,在子宮的發(fā)育和胚胎著床方面發(fā)揮重要的作用,是公認的子宮內膜容受性的生物學標志分子。[3]Meis1作為 HOX genes的輔助因子,能與其形成異源二聚體,增加與靶基因的親和力從而增加轉錄效率。[4]

有研究表明Meis1在人生理周期子宮內膜上均有表達,且在分泌中期表達最強。在Meis1表達下調的小鼠子宮,胚胎著床率顯著下降,表明Meis1在胚胎著床過程中發(fā)揮了重要作用。[1]Meis1作為血液系統(tǒng)重要的調節(jié)因子[5],新近被發(fā)現(xiàn)在視覺系統(tǒng)的形成過程中也發(fā)揮了重要作用[6],然而在生殖系統(tǒng)中的研究卻較少。為了進一步研究Meis1在生殖系統(tǒng)中的作用及其與HOX基因相互作用的分子機制,我們構建了pDsRed-Meis1真核表達載體,可通過熒光顯微鏡直接觀Meis1在生殖系統(tǒng)中的表達,及用激光共聚焦顯微鏡觀察Meis1與其它相關蛋白的結合情況;DsRed還可以通過免疫共沉淀,為進一步研究蛋白之間的相互作用提供便利工具。

[1]Bei Xu,Dirk Geerts,Kun Qian,et al.Myeloid ecotropic viral integration site 1(MEIS)1 involvement in embryonic implantation.Human Reproduction,23(6):1394-1406

[2]Hanna Achache and Ariel Revel.Endometrial receptivity markers,the journey to successful embryo implantation.Human Reproduction Update,2006.12(6):731-746

[3]Taylor HS.The role of HOX genes in human implantation.Hum Reprod Update,2000,6(1):75-79

[4]Thorsteinsdottir U,Kroon E,Jerome L,et al.Defining roles for HOX and MEIS1 genes in induction of acute myeloid leukemia.Mol Cell Biol,2001,21(1):224-234

[5]Argiropoulos B,Yung E,Humphries PK.Unraveling the crucial roles of Meis1 in leukemogenesis and normal hematopoiesis.Genes Dev,2007,21(22):2845-2849

[6]Erickson T,French CR,Waskiewicz AJ.Meis1 specifies positional information in the retina and tectum to organize the zebrafish visual system.Neural Dev,2010,5:22

Construction of pDsRed-Meis1 expression vector and its expression in murine uterus

Xiong Min,Zhu Guijin

(Reproductive Center,Tongij Hospital,Huazhong University of Science and Technology,W uhan430030,China)

Objective To construct the recombinant plasmid pDsRed-Meis1 and detect its expression in the murine uterus.Methods The full sequence of Meis1 was obtained by PCR.After enzyme digestion by EcoRI and KpnI,ligation overnight by T4 DNA ligase and transformation by DH5a,we obtained the recombinant plasmid of pDsRed-Meis1,which was identified by enzyme digestion and DNA sequencing.The recombinant plasmid was transfected into the murine uterus,and detected by Western blot.Results The recombinant plasmid pDsRed-Meis1 was identified to be correct by PCR,enzyme digestion and DNA sequencing.Western blot and immunohistochemisty revealed that Meis1 expression was significantly increased in pDsRed-Meis1 transfection than in empty vetor transfection.Conclusion The expression vector pDsRed-Meis1 is successfully constructed,which can express Meis1 protein in the murine uterus.

Meis1; Recombinant plasmid; Intrauterus transfection

R361

A

10.3870/zgzzhx.2011.01.007

2010-02-10

2010-04-01

國家973基金資助(2007-CB948104)

熊敏,女(1978年),漢族,博士研究生。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)