孫翠翠 宋尚橋 馬圍圍 鄭 福 曾素先 李 鑫 嚴 瑾 黎宗強*

(1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧，530005；2.南寧市江南區(qū)沙井街道辦事處水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站，南寧，530033)

Ghrelin最早是由日本科學(xué)家Kojima[1]等人于1999年從大鼠胃組織中提取得到的一種含28個氨基酸殘基的多肽。Ghrelin是一種腦腸肽[2]，主要分布在動物的消化系統(tǒng)、中樞系統(tǒng)中，周圍組織如心臟、腎臟、睪丸、卵巢等也有分布。消化系統(tǒng)中的ghrelin陽性細胞主要集中在胃[3]，腸道中也被發(fā)現(xiàn)分布于十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸，且從十二指腸往后分布濃度逐漸減低；肝、胰腺等消化腺中也有少量分布。研究發(fā)現(xiàn)，ghrelin除了能調(diào)節(jié)GH的分泌，還能參與調(diào)節(jié)攝食與能量代謝，促進胃腸功能等多種生物學(xué)作用[4-6]。本研究通過免疫組織化學(xué)技術(shù)系統(tǒng)觀察研究ghrelin在成年食蟹猴(Macacafascicularis)消化系統(tǒng)中的分布定位情況，為進一步闡明ghrelin在食蟹猴消化系統(tǒng)中的生理功能提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4周歲成年雄性食蟹猴1只，由廣西合法正規(guī)養(yǎng)猴場提供。

1.2 實驗試劑

一抗為兔抗人ghrelin的多克隆抗體(ab87484，abcam)，購自廣西南寧科贊生物科技有限公司；山羊抗兔SABC免疫組化染色試劑盒(SA1022)、DAB顯色試劑盒(AR1022)均購自武漢博士德生物公司；多聚賴氨酸(P2100)、蘇木素染色液(G1140)均購自北京Solarbio公司。

1.3 組織取材與固定

將食蟹猴按0.3 mg/kg進行速眠新臀部肌肉注射麻醉，分離出一側(cè)頸動脈，剪開一個“V”形小口放血，待血液放掉大約1/3后，用生理鹽水從頸動脈進行灌注沖洗，同時將同側(cè)頸靜脈也剪開，待頸靜脈流出的液體呈清亮透明時，再換用4%中性多聚甲醛灌注固定，直至觸摸動物的四肢及腹部內(nèi)臟僵硬為止。然后對灌注后的動物進行組織取材，將采集到的樣品繼續(xù)置于4%中性多聚甲醛溶液里進行固定12—24 h，4 ℃冰箱中保存。

1.4 制作石蠟切片

取出固定完全的組織，常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片，隔5取2。分為兩組，一組用作免疫組化染色，另一組用作陰性對照。

1.5 免疫組化SABC法操作流程

切片常規(guī)脫蠟至水；熱修復(fù)抗原：將切片浸入0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液中，微波爐加熱至沸騰后調(diào)至低檔保持10 min，斷電，室溫冷卻后，PBS浸洗2 min×3次；封閉內(nèi)源性過氧化氫酶：3% H2O2室溫孵育10 min，PBS浸洗2 min×3次；滴加5% BSA封閉液：37 ℃孵育30 min，甩去多余液體，不洗；滴加一抗(用PBS將一抗1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜，PBS浸洗2 min×3次；滴加二抗：37 ℃孵育1 h，PBS浸洗2 min×3次；滴加試劑SABC：37 ℃孵育30 min，PBS浸洗5 min×4次；DAB顯色5—10 min；蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察并拍照。陰性對照組用PBS代替一抗，其余步驟同上。

1.6 圖像采集及統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 Ghrelin陽性細胞在消化系統(tǒng)中的分布定位

免疫組化結(jié)果表明，ghrelin陽性細胞在食蟹猴的胃、十二指腸、空腸、胰腺中均有分布(圖1：1—14)。Ghrelin陽性細胞在胃中分布最多，其定位于黏膜層內(nèi)，從胃腺的頸部至底部均有分布，其中以底部居多(圖1：1)。腸道中，ghrelin陽性細胞主要分布在十二指腸至空腸中段，其含量要少于胃，且分布濃度由前至后逐漸降低(圖1：6—10)。腸道中的ghrelin免疫陽性細胞主要分布黏膜層的小腸腺中，少量分布于腸絨毛上。在十二指腸段，也可散在分布于十二指腸腺中(圖1：8)。此外，胰腺中也有少量ghrelin免疫陽性細胞存在，主要分布于胰腺的內(nèi)分泌部、腺泡、小葉內(nèi)導(dǎo)管和小葉間導(dǎo)管周圍(圖1：11—14)。對照組實驗僅見淡染的背景色，未見有陽性細胞分布(圖1：15)。在消化系統(tǒng)的其他組織中，如口腔、咽、食管、空腸后端至直腸、肝臟、唾液腺等均未發(fā)現(xiàn)有g(shù)hrelin免疫陽性細胞的存在。

2.2 Ghrelin陽性細胞在消化道系統(tǒng)不同部位的分布特點

由上述研究結(jié)果可知，ghrelin陽性細胞在消化系統(tǒng)中分布于胃的賁門腺區(qū)、胃底腺區(qū)、幽門腺區(qū)，十二指腸，空腸前段和中段以及胰腺中，其他部位則未發(fā)現(xiàn)ghrelin陽性細胞分布。圖像放大400倍單位視野面積下，各陽性區(qū)域中g(shù)hrelin陽性細胞分布特點如下。

2.2.1 Ghrelin陽性細胞在不同組織結(jié)構(gòu)中分布數(shù)量的比較分析

由表1可知，單位視野面積下，ghrelin陽性細胞在胃的賁門腺區(qū)、胃底腺區(qū)及幽門腺區(qū)分布數(shù)量分別為4.78±1.09、14.11±3.52、4.89±1.69個，十二指腸、空腸前段及中段的分布數(shù)量分別為3.33±1.12、1.78±0.44、1.22±0.44個，胰腺中g(shù)hrelin陽性細胞的分布數(shù)量為1.11±0.33個。

如圖2所示，在消化系統(tǒng)中，ghrelin陽性細胞在胃底腺區(qū)中的分布數(shù)量最高，與其他組織部位的差異均極顯著(P<0.01)。賁門腺區(qū)和幽門腺區(qū)的分布數(shù)量也較高，且幽門腺區(qū)稍高于賁門腺區(qū)，二者在統(tǒng)計學(xué)上差異不顯著(P>0.05)。腸道中的ghrelin陽性細胞分布數(shù)量比胃少，且從十二指腸往后逐漸降低。十二指腸與賁門腺區(qū)的差異不顯著(P>0.05)，與幽門腺區(qū)和空腸前段差異顯著(P<0.05)，與空腸后段和胰腺差異極顯著(P<0.01)?？漳c前段的分布數(shù)量與胃的三大腺區(qū)差異均極顯著(P<0.01)，與空腸后段和胰腺差異不顯著(P>0.05)。空腸后段和胰腺的分布數(shù)量接近，二者與其他組織部位的差異均極顯著(P<0.01)。

分布部位Tissues陽性細胞數(shù)Numbers of positive cells平均直徑/μmDiameter mean平均光密度Density mean陽性細胞面積/μm2Cells area占單位視野面積百分比/%Percentage賁門腺區(qū)Cardiac gland4.78±1.09Bab7.99±0.71BCbc0.52±0.05Bab242.28±57.10BCb0.39±0.09BCb胃底腺區(qū)Fundus gland14.11±3.52A7.94±0.50BCbc0.54±0.04Bab714.55±152.62A1.16±0.23A幽門腺區(qū)Pyloric gland4.89±1.69Ba9.13±0.80Ba0.57±0.08Ba323.71±120.08Ba0.52±0.19Ba十二指腸Duodenum3.33±1.12BCb8.51±0.89BCab0.55±0.05Bab186.37±55.48CDb0.30±0.09CDb空腸前段Anterior segment jeju-num1.78±0.44CDc8.13±0.93BCbc0.51±0.03Bb95.32±33.71DEc0.15±0.06DEc空腸中段Middle segment jejunum1.22±0.44Dc7.42±0.70Cc0.36±0.07C51.54±13.70Ec0.09±0.04Ec胰腺Pancreas1.11±0.33Dc10.19±1.41A0.67±0.06A89.77±24.04DEc0.14±0.04DEc

注：組間比較，小寫字母不同為差異顯著P<0.05；大寫字母不同表示差異極為顯著P<0.01

Note：Different small letter indicated significant different(P<0.05)，while different capital letter indicated extremely significant(P<0.01)compared between groups

圖1 Ghrelin免疫陽性細胞在食蟹猴消化系統(tǒng)中的分布定位Fig.1 Ghrelin immunoreactive cells distribution and localization in cynomolgus monkey digestive systemA封閉型細胞Closed cell；B開放型細胞Open cell；←陽性細胞Positive cells。1.賁門腺區(qū)Cardiac gland(×100)；2.賁門腺區(qū)胃黏膜上皮Gastric epithelium from the cardia gland(×400)；3.賁門腺區(qū)Cardiac gland(×400)；4.胃底腺區(qū)Fundus gland(×400)；5.幽門腺區(qū)Pyloric gland(×400)；6.十二指腸小腸腺Duodenal small intestinal gland(×400)；7.十二指腸腸絨毛Duodenal villi(×400)；8.十二指腸腺Duodenal gland(×400)；9.空腸小腸腺Jejunal small intestinal gland(×400)；10.空腸腸絨毛Intestinal villi(×400)；11.胰腺內(nèi)分泌部Pancreatic endocrine department(×400)；12.胰腺腺泡Pancreatic acini(×400)；13.胰腺小葉內(nèi)導(dǎo)管Intralobular catheter of the pancreas(×400)；14.胰腺小葉間導(dǎo)管Pancreatic interlobular duct(×400)；15.對照組The control group(×400)

圖2 Ghrelin陽性細胞在不同組織結(jié)構(gòu)中分布數(shù)量的比較分析Fig.2 Comparison analysis of the numbers of ghrelin positive cells in different tissues

2.2.2 Ghrelin陽性細胞在不同組織結(jié)構(gòu)中平均直徑的比較分析

由表1可知，單位視野面積下，ghrelin陽性細胞在賁門腺區(qū)、胃底腺區(qū)和幽門腺區(qū)的平均直徑分別為(7.99±0.71)μm、(7.94±0.50)μm、(9.13±0.80)μm，十二指腸、空腸前段和中段的平均直徑分別為(8.51±0.89)μm、(8.13±0.93)μm、(7.42±0.70)μm，胰腺中的ghrelin陽性細胞平均直徑大小為(10.19±1.41)μm。

由圖3所示，幽門腺區(qū)的ghrelin陽性細胞直徑大于其他兩個腺區(qū)，且差異顯著(P<0.05)。賁門腺區(qū)與胃底腺區(qū)細胞大小接近，差異不顯著(P>0.05)。腸道中的ghrelin陽性細胞直徑從十二指腸往后逐漸降低。十二指腸中的細胞直徑小于幽門腺區(qū)，但大于另外兩個腺區(qū)，其與三大腺區(qū)在統(tǒng)計學(xué)上均差異不顯著(P<0.05)。空腸前段的ghrelin陽性細胞直徑小于幽門腺區(qū)和十二指腸，但大于賁門腺區(qū)、胃底腺區(qū)和空腸中段。其與幽門腺區(qū)差異顯著(P<0.05)，與消化道的其他部位均差異不顯著(P>0.05)?？漳c中段的ghrelin陽性細胞直徑最小，其與幽門腺區(qū)差異極顯著(P<0.01)，與十二指腸差異顯著(P<0.05)，與賁門腺區(qū)、胃底腺區(qū)和空腸前段差異不顯著(P>0.05)。胰腺中的ghrelin陽性細胞直徑比消化道的大，其與消化道各段相比，差異均極顯著(P<0.01)。

2.2.3 Ghrelin陽性細胞在不同組織結(jié)構(gòu)中平均光密度值的比較分析

由表1 可知，單位視野面積下，賁門腺區(qū)、胃底腺區(qū)和幽門腺區(qū)的ghrelin陽性細胞光密度值(OD值)分別為0.52±0.05、0.54±0.04、0.57±0.08，十二指腸、空腸前段和中段的OD值分別為0.55±0.05、0.51±0.03、0.36±0.07，胰腺中的ghrelin陽性細胞OD值為0.67±0.06。

由圖4所示，在消化系統(tǒng)中，空腸中段的ghrelin陽性細胞OD值最小，其與消化系統(tǒng)的其他區(qū)域差異均極顯著(P<0.01)。胰腺中的ghrelin陽性細胞OD值最大，也與消化系統(tǒng)的其他區(qū)域差異均極顯著(P<0.01)。在胃組織中，幽門腺區(qū)的ghrelin細胞OD值>胃底腺區(qū)>賁門腺區(qū)，但3個區(qū)域在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異(P>0.05)。腸道中的ghrelin陽性細胞OD值從十二指腸往后逐漸降低。十二指腸的細胞OD值低于幽門腺區(qū)，但均高于消化道的其他組織，其與三大胃腺及空腸前段差異均不顯著(P>0.05)。空腸前段的陽性細胞OD值與幽門腺區(qū)差異顯著(P<0.05)，與賁門腺區(qū)、幽門腺區(qū)及十二指腸差異均不顯著(P>0.05)。

2.2.4 Ghrelin陽性細胞在不同組織結(jié)構(gòu)中所占單位視野面積百分比的比較分析

由表1可知，單位視野面積下，ghrelin陽性細胞在賁門腺區(qū)、胃底腺區(qū)、幽門腺區(qū)所占的面積百分比分別為(0.39±0.09)%、(1.16±0.23)%、(0.52±0.19)%，在十二指腸、空腸前段和中段所占比例為(0.30±0.09)%、(0.15±0.06)%、(0.09±0.04)%，在胰腺中所占比例為(0.14±0.04)%。

圖3 Ghrelin陽性細胞在不同組織結(jié)構(gòu)中平均直徑的比較分析Fig.3 Comparison analysis of the diameter of ghrelin positive cells in different tissues

圖4 Ghrelin陽性細胞在不同組織結(jié)構(gòu)中平均光密度值的比較分析Fig.4 Comparison analysis of the OD value of ghrelin positive cells in different tissues

如圖5所示，單位視野面積下，ghrelin陽性細胞所占的面積百分比在胃底腺區(qū)最高，其與消化系統(tǒng)的其他組織相比差異均極顯著(P<0.01)。賁門腺區(qū)和幽門腺區(qū)的面積百分比也較高，且幽門腺區(qū)高于賁門腺區(qū)，二者差異顯著(P<0.05)。腸道中的ghrelin陽性細胞面積百分比從十二指腸往后逐漸降低。十二指腸中的面積百分比低于三大胃腺，其與賁門腺區(qū)差異不顯著(P>0.05)，與空腸前段差異顯著(P<0.05)，與胃底腺區(qū)、幽門腺區(qū)和空腸中段差異均極顯著(P<0.01)?？漳c前段與胰腺的面積百分比接近，二者與三大胃腺差異極顯著(P<0.01)，與十二指腸差異顯著(P<0.05)，與空腸中段差異不顯著(P>0.05)?？漳c中段的面積百分比在整個消化系統(tǒng)中最低，其與三大胃腺及十二指腸差異極顯著(P<0.01)，與空腸前段和胰腺差異不顯著(P>0.05)。

圖5 Ghrelin陽性細胞在不同組織結(jié)構(gòu)中所占單位視野面積百分比的比較分析Fig.5 Comparison analysis of the percentage of the unit field area of ghrelin positive cells in different tissues

3 討論

3.1 Ghrelin陽性細胞在消化系統(tǒng)中的分布定位

Ghrelin最早是從大鼠胃組織中分離得到的[1]，它是一種具有刺激攝食和促進GH釋放的多肽，在人和大鼠的研究中表明，ghrelin在胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)均有分布，屬于一種腦腸肽[2]。胃腸道是ghrelin的主要來源，其中胃組織中g(shù)hrelin的含量最高，約占總體的20%[7]。本研究結(jié)果表明，ghrelin陽性細胞在食蟹猴消化系統(tǒng)中主要分布在胃組織中，與此結(jié)果保持一致。腸道中的ghrelin陽性細胞只分布在十二指腸、空腸前段和中段，空腸后段到直腸間的各段腸管則未見分布。而有研究表明，在青紫藍家兔(Oryctolaguscuniculus)[8]的十二指腸到直腸均有g(shù)hrelin陽性細胞分布；在山羊[9]的胃腸道中，ghrelin陽性細胞主要分布在皺胃、十二指腸到結(jié)腸段。這些結(jié)果均與本研究結(jié)果存在一定的差異。已有多項研究表明，ghrelin及其受體在嚙齒類動物和人的胰腺中也有少量表達[10-11]，這一研究結(jié)果與本研究一致。本研究還發(fā)現(xiàn)ghrelin陽性細胞在食蟹猴的口腔黏膜、食管及肝臟中沒有表達，而在其他物種，如大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)[12]、雞[13]、魚[14]等的肝臟組織中則均有表達。

3.2 Ghrelin陽性細胞在消化系統(tǒng)不同部位分布定位和含量的特點

Date等[7]通過原位雜交證實，表達Ghrelin mRNA的細胞主要分布于胃底黏膜泌酸腺的體部和底部，腸道中的ghrelin細胞主要分布于腸腺上皮及腸絨毛上皮內(nèi)。Sakata等[3]發(fā)現(xiàn)，大鼠胃組織中的ghrelin細胞主要存在于胃底腺的體部和底部，少量分布于胃底腺的頸部。腸道中的ghrelin細胞主要存在于腸腺上皮中，少量分布于腸絨毛上皮之中。

本研究結(jié)果表明，ghrelin免疫陽性細胞在食蟹猴胃中主要分布于胃腺的體部和底部，少量分布于腺體頸部和黏膜上皮中。腸道中的ghrelin陽性細胞分布濃度比胃低，且從十二指腸往后逐漸降低，其主要分布于小腸腺和腸絨毛上皮中，此外，在十二指腸腺中也發(fā)現(xiàn)有少量陽性細胞分布。這些研究結(jié)果均與大鼠[7]、鴕鳥(Struthiocamelus)[15]、兔[16]、鵝[17]等研究結(jié)果保持一致。

Ghrelin免疫陽性細胞在胰腺中的分布也有大量研究，Date等[18]最先報道，ghrelin可存在于成年大鼠和人的胰島α細胞中，Volante等[19]認為ghrelin只在胰島β細胞中表達。Wierup等[20]則認為在胎兒、新生兒和成人胰島內(nèi)均有g(shù)hrelin的表達，其中在胰島中表達ghrelin的細胞不是胰島α細胞，而是一種新類型的胰島內(nèi)分泌細胞。這種細胞在成人胰島內(nèi)呈單個分布在胰島周圍，少量分布于胰腺外分泌部、導(dǎo)管和胰腺神經(jīng)節(jié)等處。Prado等[21]將小鼠胰島內(nèi)分泌ghrelin的新型內(nèi)分泌細胞按目前胰島細胞命名法，將其稱之為“ε細胞”。方富貴等[22]報道，在皖西白鵝胰腺的外分泌部和內(nèi)分泌部均有g(shù)hrelin表達，外分泌部表達ghrelin的陽性細胞為腺泡細胞，內(nèi)分泌部細胞胞質(zhì)中均可表達ghrelin。陽性細胞在胰腺的分布不均，內(nèi)分泌部數(shù)量比外分泌部多。

本研究表明，胰腺中的ghrelin免疫陽性細胞在外分泌部和內(nèi)分泌部均有分布，細胞呈單個存在。外分泌部的細胞主要分布在腺泡、小葉內(nèi)導(dǎo)管和小葉間導(dǎo)管附近，且外分泌部的含量比內(nèi)分泌部多，這一結(jié)論與Wierup等[20]在人類中的研究結(jié)果相一致，與方富貴等[22]在皖西白鵝中的研究存在一定的差異。提示ghrelin陽性細胞在胰腺中的分布存在種屬差異。

3.3 Ghrelin陽性細胞在消化系統(tǒng)不同部位的細胞形態(tài)特征

Sakata等[3]發(fā)現(xiàn)胃腸道內(nèi)的ghrelin陽性細胞根據(jù)其游離面是否到達腔面，可分為“開放型”和“封閉型”。開放型細胞多呈三角形或長條形，細胞頂端到達腺體腔面；封閉型細胞多小而圓，胞質(zhì)頂端未到達腺體腔面。胃中主要為封閉型，腸道中存在封閉型和開放型兩種類型。魏鳳梅等[13]報道，在雞腺胃腺小葉基底部的ghrelin陽性細胞胞體呈小球形，少數(shù)呈長條形，胞核圓形或卵圓形，細胞多為封閉型。小腸腺中的陽性細胞胞體呈球形或三角形，胞核圓而透亮；腸粘膜上皮中陽性細胞多呈長條形，胞核淺染，胞質(zhì)染色較深。因此腸道中均含有封閉型和開放型兩種細胞，且從十二指腸往后封閉型的比例逐漸降低。

本研究結(jié)果表明，食蟹猴胃腸道內(nèi)的ghrelin細胞形態(tài)多樣。胃中g(shù)hrelin陽性細胞多呈圓形、卵圓形，少量呈梭形、錐體形及其他不規(guī)則形，其主要為封閉型細胞(圖1：2A)。在腸道中，小腸腺上皮中的陽性細胞多為卵圓形、錐體形，腸絨毛上皮中的陽性細胞多為錐形、長條形。十二指腸中存在封閉型和開放型兩種類型，空腸中則主要為開放型細胞(圖1：10B)。Ghrelin免疫陽性細胞被染為棕色到棕黑色，細胞界限不清晰，在有些細胞的中央或邊緣位置可見半透亮的細胞核，表明ghrelin陽性染色物質(zhì)位于細胞質(zhì)中，且分布不均。這些研究結(jié)果與雞[13]、兔[16]、山羊[9]、非洲鴕鳥[23]等保持一致。

綜上所述，ghrelin在食蟹猴消化系統(tǒng)中的胃、十二指腸、空腸前段到中段、胰腺中均有表達，而在口腔黏膜、食管、空腸后段到直腸、肝臟中均無表達。與其他動物在體內(nèi)分布部位的相似，提示ghrelin在進化上的保守性，物種之間具有差異性。

4 結(jié)論

免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，ghrelin陽性細胞在食蟹猴的消化系統(tǒng)中有分布；ghrelin細胞在胃腺中主要分布于腺體的體部和底部，腺體的頸部和胃黏膜上皮中分布極少。腸道中的ghrelin細胞主要分布在小腸腺，少量分布于腸絨毛上皮中。根據(jù)細胞頂端是否到達腺體腔面，可將胃腸道中的ghrelin細胞分為“開放型”和“封閉型”，ghrelin免疫陽性細胞被染為棕色到棕黑色，細胞界限不清晰，在有些細胞的中央或邊緣位置可見半透亮的細胞核，說明ghrelin陽性物質(zhì)分布在細胞質(zhì)中，且陽性產(chǎn)物在胞質(zhì)中的分布不均一。