李曉明 陳洪軍 毛擁軍 (青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 青島 266003)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)是多種遺傳因素相互作用所致的多基因疾病，已成為當(dāng)今世界威脅人類健康的主要疾病之一。其病理基礎(chǔ)主要是病變血管管腔狹窄或阻塞導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺血性損傷。年齡、肥胖、高血脂、吸煙、高血壓等傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素已獲得較為詳盡的研究證據(jù)。而基因多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度的相關(guān)性研究也成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)對(duì)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因G894T多態(tài)性進(jìn)行分析，探討青島地區(qū)老年人eNOS基因多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈病變程度的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇冠心病患者100例，年齡＞60歲，平均(70.28±6.465)歲，均為2011年2月～11月在本院入住并行冠脈血管成像(CTA)檢查的患者。入選患者均為竇性心律，心率55～65次/min(心率快者應(yīng)用倍他樂克控制達(dá)標(biāo))，節(jié)律齊。患者無心力衰竭，肝腎功不全，哮喘等禁忌證。入選病人詢問有無高血壓、糖尿病、高脂血癥病史及冠心病家族史;詢問有無吸煙的生活習(xí)慣，檢測(cè)血壓、血脂、血糖等。

1.2 方法

1.2.1 多層螺旋CT 全部應(yīng)用通用電氣公司生產(chǎn)的寶石能譜螺旋CT行冠狀動(dòng)脈CTA檢查，將患者心率控制在55～65次/min，指導(dǎo)患者靜臥并于一次屏氣中完成掃描。將掃描圖像傳遞給工作站，由相關(guān)工作人員計(jì)算冠脈鈣化積分(CACS)及圖像后續(xù)處理。主要選取左冠脈主干(LMA)、左回旋支(LCX)、左前降支(LAD)、右冠狀動(dòng)脈(RCA)進(jìn)行CACS分析。CACS測(cè)定應(yīng)用國際公認(rèn)的Agaston積分方法，鈣化積分條件為CT值＞130 Hu、鈣化面積＞1 mm2，鈣化積分為鈣化面積與鈣化灶CT峰值記分的乘積。其中130～199 Hu為1分，200～299 Hu為2分，300～399 Hu為3分，≥400 Hu為4分。計(jì)算出選取的四支冠脈血管各自的鈣化積分，相加得出鈣化總積分。并按照鈣化總積分分為冠狀動(dòng)脈病變低危組(CACS=0～10)，中危組(CACS=11～400)，高危組(CACS＞400)。三組年齡、性別、高血壓病史、冠心病家族史比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;主要危險(xiǎn)因素(高脂血癥病史、糖尿病病史、吸煙史)比較總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

1.2.2 eNOS基因多態(tài)性測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)本制備 抽取受檢者肘靜脈血2～3 ml，用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，充分混勻。

1.2.2.2 儀器設(shè)備 上海百傲科技有限公司提供的BaiO-BE系列基因芯片檢測(cè)儀，BE-2.0生物芯片識(shí)讀儀及分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)設(shè)備如:離心機(jī)TGL-16B，PCR擴(kuò)增儀TC-25/H，恒溫培養(yǎng)箱DHP030，移液器，水溶鍋，打印機(jī)等。

1.2.2.3 方法步驟 低滲法裂解紅細(xì)胞，分離白細(xì)胞，飽和酚/氯仿法抽提白細(xì)胞基因組DNA，加Tirs-EDTA液(TE)溶解DNA，－20℃保存。利用PCR擴(kuò)增eNOS基因的特異片段，PCR反應(yīng)體系為25 μl，反應(yīng)條件為94℃熱啟動(dòng)5 min，再94℃變性25 s，56℃退火 25 s，72℃ 延伸 25 s，反復(fù) 40 個(gè)循環(huán)，最后 72℃延伸5 min，進(jìn)而冷卻至4℃。在雜交倉中將基因芯片與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混勻雜交，加入顯色溶液，后置于BaiO基因生物芯片識(shí)讀儀上檢測(cè)，圖像Array Doctor軟件分析可自動(dòng)生成檢測(cè)結(jié)果，最后檢測(cè)出eNOS基因多態(tài)性位點(diǎn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件，基因型及等位基因頻率采用直接計(jì)數(shù)法，比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。組間人群基因分布應(yīng)用χ2檢驗(yàn)是否符合Hardy-Weinberg平衡，以P＞0.05表明樣本具有群體代表性。計(jì)量資料均采用±s表示，組間均數(shù)比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，采用多因素多分類Logistic回歸分析，應(yīng)用多元線性回歸分析多個(gè)影響冠脈病變因素與CACS之間的線性數(shù)量關(guān)系。

2 結(jié)果

三組等位基因、基因型分布進(jìn)行基因多態(tài)性遺傳平衡檢驗(yàn)，兩組間基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P＞0.05)，表明樣本具有群體代表性。

2.1 三組eNOS基因G894T突變位點(diǎn)基因型及等位基因分布

低危組31例研究對(duì)象中GG基因型29例(93.5%)，GT基因型2例(6.5%)，TT基因型0例;G等位基因頻率96.8%，T等位基因頻率3.2%;中危組38例研究對(duì)象中GG基因型32例(84.2%)，GT基因型5例，TT基因型1例，GT+TT基因型占15.8%，G等位基因頻率90.8%，T等位基因頻率9.2%;高危組31例研究對(duì)象中GG基因型14例(45.2%)，GT基因型14例，TT基因型3例，GT+TT基因型占54.8%，G等位基因頻率67.7%，T等位基因頻率32.3%。經(jīng)χ2檢驗(yàn)得出高危組GT+TT基因型、T等位基因明顯高于低、中危組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.907、20.173，P=0.000)。見表 2。

表1 三組一般臨床資料比較(n)

表2 eNOS基因G894T突變位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率分布〔n(%)〕

2.2 多因素多分類Logistic回歸分析 將CACS低、中、高危組作為因變量，eNOS基因G894T多態(tài)性、年齡、性別、是否有高血壓病史、糖尿病史、冠心病家族史、高脂血癥病史、吸煙史等作為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析。結(jié)果顯示:似然比檢驗(yàn)說明整個(gè)模型檢驗(yàn)具有顯著意義(P=0.002)。eNOS基因G894T多態(tài)性和是否吸煙對(duì)CACS有影響(P=0.001，P=0.043)。年齡，性別，高血壓病史，冠心病家族史，糖尿病史，高脂血癥病史無影響(P＞0.05)。擬合優(yōu)度檢驗(yàn)示 P=0.316，P=0.357，可見Pearson法和Deviance法均顯示擬合效果良好。參數(shù)估計(jì)以各變量的最高水平為基線類，CACS分組以高危組為基線類，吸煙史以1=“有吸煙史”為基線類，eNOS基因多態(tài)性以1=“GT+TT基因型”為基線類。以“年齡＞80歲、性別=男、高血壓、糖尿病、高脂血癥病史、冠心病家族史、吸煙史”為基線類。OR值表示關(guān)于基線類的優(yōu)勢(shì):在低危組、中危組中eNOS基因G894T突變位點(diǎn)為GG基因型的傾向分別是高危組的13.154倍、5.487倍。低、中危組無吸煙史的傾向分別是高危組的5.759倍、5.493倍。說明eNOS的GT+TT基因型及有吸煙史是CACS高的危險(xiǎn)因素。見表3。

2.3 多元線性回歸分析 見表4，表5，圖1。將CACS分值作為因變量，將eNOS基因G894T多態(tài)性、年齡、性別、是否有高血壓病史、糖尿病史、冠心病家族史、高脂血癥病史、吸煙史等作為自變量，進(jìn)行多元線性回歸分析。全變量回歸分析，對(duì)方程檢驗(yàn)，F(xiàn)=8.746，P=0.000，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。參數(shù)估計(jì)如下，由標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)可見，8個(gè)自變量對(duì)因變量CACS值的影響從大到小依次為eNOS基因型、吸煙史、高脂血癥病史、冠心病家族史、糖尿病史、年齡、高血壓病史、性別。一般回歸方程為:CACS值 =－110.823+270.325eNOS基因 G894T多態(tài)性 +114.255吸煙史(有)+113.991高脂血癥病史(有)+86.572冠心病家族史(有)+63.169糖尿病史(有)+2.573年齡 －23.647高血壓病史(有)－14.241性別(男)。對(duì)方程內(nèi)各自變量單獨(dú)檢驗(yàn)，自變量“eNOS基因型、吸煙史、高脂血癥病史”對(duì)因變量有顯著影響，P值分別為0.000，0.038，0.017。逐步回歸分析示，對(duì)方程檢驗(yàn)，F(xiàn)=21.163，P=0.000，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。參數(shù)估計(jì)如下，由標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)可見，影響CACS的自變量從大到小依次為eNOS基因型、高脂血癥病史、吸煙史?；貧w方程為:CACS值 =94.631+300.439eNOS基因 G894T多態(tài)性 +123.803高脂血癥病史(有)+107.309吸煙史(有)。P-P概率圖可直觀推斷本數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布。

表3 多分類Logistic回歸分析

表4 多元線性回歸(全變量回歸分析)

表5 多元線性回歸(逐步回歸分析)

圖1 P-P正態(tài)概率累積概率圖

3 討論

自Tanenhaum〔1〕首次報(bào)道用超高速CT檢測(cè)冠狀動(dòng)脈鈣化間接推斷冠心病以來，高速CT臨床應(yīng)用的研發(fā)逐漸增多。目前，新一代的多層螺旋CT在心臟掃描方面有突破性進(jìn)展，由于整合了心電門控、螺旋CT可利用數(shù)字化式心電圖儀來跟蹤心動(dòng)周期，并把心電圖波紋以模擬信號(hào)的形式轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)傳遞給CT機(jī)，使門控CT的螺距、床速以及球管旋轉(zhuǎn)速度調(diào)整到與病人心率一致，并抓住心肌舒張R-R間期的80%時(shí)間段觸發(fā)及完成掃描。雖然冠脈造影一直是診斷冠狀動(dòng)脈病變的金標(biāo)準(zhǔn)，但作為有創(chuàng)檢查，它有一定的操作并發(fā)癥，并且不能用于碘過敏試驗(yàn)陽性的患者，適應(yīng)性較窄。64層螺旋CT冠狀動(dòng)脈成像是目前有效可靠的冠心病診斷方法之一，能準(zhǔn)確地顯示冠狀動(dòng)脈病變，其敏感度為97% ～99%，特異度約83% ～94%〔2〕。國內(nèi)已有人對(duì)150例行64層螺旋CT冠狀動(dòng)脈成像的患者進(jìn)行回顧性分析，定量評(píng)價(jià)CACS與冠狀動(dòng)脈狹窄的關(guān)系，結(jié)論為CACS可反映冠狀動(dòng)脈病變的程度及范圍，對(duì)患者冠脈狹窄有較高的診斷準(zhǔn)確性〔3〕。將來冠狀動(dòng)脈CTA這種無創(chuàng)簡便的檢查方法有望替代診斷性冠狀動(dòng)脈造影。

目前國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)多種基因多態(tài)性與冠脈病變發(fā)生的危險(xiǎn)增加密切相關(guān)，但各家報(bào)道不一致，至今尚未確認(rèn)出冠狀動(dòng)脈病變的相關(guān)基因。NOS通過精氨酸-NOS-瓜氨酸途經(jīng)合成一氧化氮(NO)，是該途徑中惟一的限速酶，是決定血管壁NO基礎(chǔ)水平的關(guān)鍵酶。已報(bào)道的人類NOS基因分3型，即eNOS、神經(jīng)元型(nNOS)和誘生型(iNOS)。其中，eNOS主要存在于全身各級(jí)動(dòng)脈血管壁內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、心內(nèi)膜和心肌細(xì)胞內(nèi);eNOS基因編碼位于染色體7q35-36區(qū)，由26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子組成，長度21 kb，主要在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，系鈣調(diào)素依賴性。在心血管系統(tǒng)中，NO具有擴(kuò)張血管、抑制血小板黏附與聚集、抑制平滑肌細(xì)胞增殖等重要生理功能。eNOS是心血管系統(tǒng)中合成NO的主要酶，在冠心病的發(fā)病中具有重要作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，敲除eNOS基因的小鼠易患動(dòng)脈粥樣硬化，導(dǎo)致冠心病的發(fā)生。抑制NOS可加速早期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成〔4〕。eNOS基因第7外顯子第78位堿基即編碼序列第894位堿基發(fā)生G→T突變(G 894 T)，導(dǎo)致第298位氨基酸殘基發(fā)生谷氨酸被天門冬氨酸代替(Glu 298 Asp)。Rossi、Colombo分別在高加索地區(qū)人群及意大利人群中進(jìn)行病例對(duì)照研究〔5，6〕，表明Glu 298 Asp變異與冠心病及急性心肌梗死的發(fā)生顯著相關(guān);但也有研究顯示，該變異與冠心病的發(fā)病無相關(guān)關(guān)系〔7〕。目前國內(nèi)研究eNOS基因較少，而且結(jié)論多不一致。由于人種差異，國外的eNOS基因多態(tài)性研究對(duì)中國人可能不適用。

本研究發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈病變高危組人群eNOS基因的GT+TT基因型頻率高于低、中危組，且TT基因型僅存在于中、高危組，提示GT、TT基因型、T等位基因與冠狀動(dòng)脈病變的發(fā)生可能相關(guān)。冠脈病變的發(fā)生可能與eNOS基因G894T多態(tài)性有關(guān)，這種突變可能與冠脈病變的傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素如吸煙史、高血脂、高血糖有密切聯(lián)系。進(jìn)一步的多分類Logistic回歸分析顯示eNOS基因GT+TT型、吸煙是冠狀動(dòng)脈病變的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。將CACS作為因變量作多元線性回歸分析示，eNOS基因GT+TT型、吸煙、高脂血癥病史是影響CACS的主要因素，其中影響最大的為eNOS基因G894T多態(tài)性。研究發(fā)現(xiàn)吸煙與eNOS基因G894T多態(tài)性既作為獨(dú)立危險(xiǎn)因素也互相作用影響冠狀動(dòng)脈病變，高血脂也與eNOS基因G894T多態(tài)性、吸煙共同參與冠狀動(dòng)脈病變的發(fā)生，但非獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本實(shí)驗(yàn)由于樣本量等其他因素限制不能完全明確冠脈病變的影響因素，冠狀動(dòng)脈病變作為一類受遺傳和環(huán)境共同影響的復(fù)雜疾病，特別是遺傳因素需要更進(jìn)一步的大樣本流行病學(xué)研究。

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