劉建偉 葉 玲 劉 靜 李小鷹 (解放軍總醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所，北京 100853)

有研究證實(shí)，高血壓、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和吸煙等為周圍動(dòng)脈硬化閉塞癥(peripheral arterial occlusive disease，PAOD)的主要危險(xiǎn)因素〔1〕，載脂蛋白E(ApoE)參與調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝，其基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)〔2〕。本研究采用多重四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR法(multiplex tetra-primer amplification refractory mutation system polymerase chain reaction，multiplex T-ARMS PCR〔3〕)，對(duì)北京市萬(wàn)壽路社區(qū)健康老年人、老年原發(fā)性高血壓(essential hypertension，EH)、老年周圍動(dòng)脈硬化閉塞癥(PAOD)和老年EH伴PAOD病例中ApoE基因多態(tài)性進(jìn)行分析，探討這一基因變異與EH和PAOD的關(guān)系，以期闡明遺傳易感因素在其發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選自“2002年北京市萬(wàn)壽路社區(qū)老年周圍動(dòng)脈硬化閉塞癥流行病學(xué)調(diào)查”人群(2 124例)。健康老年人(NC組)100例，漢族，男50例，女50例，年齡60～81〔平均(66.3±4.4)〕歲;老年EH組100例，漢族，男50例，女50例，年齡60～82〔(平均67.2±4.2)〕歲;老年 PAOD組83例，漢族，男28例，女55例，年齡60～86〔平均(69.3±3.7)〕歲;老年EH伴PAOD組59例，漢族，男17例，女42例，年齡60～85〔平均(70.2±3.0)〕歲。

篩選標(biāo)準(zhǔn):NC組為經(jīng)病史、體格檢查、心電圖及實(shí)驗(yàn)室檢查排除了冠心病(參照1979年WHO頒布的診斷標(biāo)準(zhǔn))、糖尿病(參照1997年ADA頒布的診斷標(biāo)準(zhǔn))、高血壓(參照1999年中國(guó)高血壓防治指南頒布的診斷標(biāo)準(zhǔn))以及PAOD等心腦血管疾病的健康人群。EH組診斷標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)NC組，排除繼發(fā)性高血壓、冠心病、糖尿病以及PAOD，收縮壓(SBP)≥140 mmHg和(或)舒張壓(DBP)≥90 mmHg。PAOD組診斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)〔4〕，排除高血壓、冠心病和糖尿病。EH+PAOD組診斷標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)EH和PAOD組，排除繼發(fā)性高血壓。

1.2 研究方法 經(jīng)典酚-氯仿抽提法提取全血DNA。采用multiplex T-ARMS PCR法檢測(cè)ApoE基因型，引物參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)〔3〕，由上海英駿生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列為:FO:5'-ACTGACCCCGGTGGCGGAGGA-3';RO:5'-CAGGCGTATCTGCTGGGCCTGCTC-3';FI-1:5'-GGCGCGGACATGGAGGACGgGC-3';RI-1:5'-GCGGTACTGCACCAGGCGGCCtCA-3';FI-2:5'-CGATGCCGATGACCTGCAGA c GC-3';RI-2:5'-CCCGGCCTGGTACACTGCCAG t CA-3'。其中FI-1和 RI-1分別用于檢測(cè)ApoE基因第112位精氨酸(Arg112)密碼子cGC的C和第112位半胱氨酸(Cys112)密碼子tGC的T，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為:FI-1/RO 444 bp和FO/RI-1 115 bp;FI-2和RI-2分別用于檢測(cè)ApoE基因第158位精氨酸(Arg158)密碼子cGC的C和第158位半胱氨酸(Cys158)密碼子tGC的T，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為:FI-2/RO 307 bp和FO/RI-2 253 bp。為了監(jiān)控反應(yīng)體系的有效性，以FO/RO為內(nèi)參照系統(tǒng)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為514 bp。PCR擴(kuò)增條件:反應(yīng)體系 20 μl，95℃ 預(yù)變性 15 min 后，95℃ 30 s，66℃30 s，72℃ 30 s，共35 個(gè)循環(huán)，最后于 72℃再延伸 7 min。PCR擴(kuò)增儀為Biometra Tgradient，TaKaRa Ex Taq HS DNA聚合酶為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。反應(yīng)完成后，2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，以DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物為參考判定PCR結(jié)果。對(duì)所有受檢者同時(shí)進(jìn)行血脂、血糖、血壓、血漿纖維蛋白原(FIB)、體重指數(shù)(BMI)及聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位指數(shù)(AAI)等的檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以±s表示，基因頻率采用基因計(jì)數(shù)法，基因型及基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較 PAOD組和EH+PAOD組AAI值顯著低于NC組和EH組(P＜0.05);EH+PAOD組和EH組SBP顯著高于NC組(P＜0.05);其余指標(biāo)(血脂、血糖、FIB、BMI)的水平，三組間無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表1。

2.2 ApoE六種基因型頻率及三種等位基因頻率的比較 內(nèi)參照基因514 bp條帶清晰，檢測(cè)樣品均成功擴(kuò)增出目的條帶。共檢測(cè)出6種基因型，每一個(gè)純合子有兩個(gè)不同長(zhǎng)度的片段。ε2/2基因型顯示253 bp(Cys158)和115 bp(Cys112)條帶，ε3/3基因型顯示307 bp(Arg158)和115 bp(Cys112)條帶，ε4/4基因型顯示444 bp(Arg112)和307 bp(Arg158)條帶。雜合子ε4/2基因型擴(kuò)增出4個(gè)條帶，其他兩個(gè)雜合子各擴(kuò)增出3個(gè)條帶，ε3/2擴(kuò)增出除444 bp以外的條帶，ε4/3擴(kuò)增出除253 bp以外的條帶。NC組、EH組、PAOD組和EH+PAOD組ApoE各基因型頻率及等位基因頻率分布均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表2，圖1。

表1 NC、EH、PAOD與EH+PAOD組一般情況比較(±s)

表1 NC、EH、PAOD與EH+PAOD組一般情況比較(±s)

與NC組比較:1)P＜0.05;與EH組比較:2)P＜0.05;與PAOD組比較:3)P＜0.05

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表2 NC、EH、PAOD與EH+PAOD組ApoE各基因型頻率及等位基因頻率分布〔n(%)〕

圖1 ApoE等位基因Multi-ASP-PCR圖譜

3 討論

ApoE是由299個(gè)氨基酸組成的糖蛋白，分子量34.2 kD，主要存在于血漿乳糜微粒、極低密度脂蛋白和高密度脂蛋白中。ApoE作為ApoE受體與低密度脂蛋白(LDL)受體的配基，能高親和性地與這兩種受體結(jié)合，是調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝的重要因素。Utermann等〔5〕的研究表明，ApoE基因位于第19號(hào)染色體上，該基因第4外顯子內(nèi)編碼第112位氨基酸及第158位氨基酸的密碼子具有多態(tài)性，可產(chǎn)生三種常見(jiàn)的等位基因:ε4、ε3和ε2，分別編碼 Apo E 的三種主要異構(gòu)體 ε2、ε3和 ε4，其中 ε3是人群中最常見(jiàn)的一種異構(gòu)，故常稱為野生型，而ε2、ε4稱為變異型，從而形成6 種不同表型:3 種純合子(ε2/2、ε3/3、ε4/4)和3種雜合子(ε2/3、ε3/4、ε2/4)。攜帶不同 ApoE 基因型的個(gè)體其血脂水平有差異，從而影響與血脂水平相關(guān)疾病的發(fā)病率〔6〕。在不同國(guó)家和地區(qū)人群中ApoE 6種基因型的分布不均勻，有明顯的共同特點(diǎn)，即:ε3/3型發(fā)生頻率最高;含ε3等位基因的雜合子(ε4/3，ε3/2)次之;ε2/2、ε4/4、ε4/2 的發(fā)生頻率最低。本研究結(jié)果顯示:在北京市社區(qū)老年人群中，老年健康對(duì)照組 ApoE 基因型頻率分別為 ε3/3，72.0%;ε4/3，12.0%;ε3/2，14.0%;ε2/2，0%;ε4/4，0%;ε4/2，2.0%;ε4 等位基因頻率為7.0%，符合上述規(guī)律。與馬鳳等〔7〕報(bào)告的2 000例中國(guó)農(nóng)村地區(qū)65歲及以上老年人群ApoE基因型頻率及ε4等位基因頻率分布 (ε3/3，68.8%;ε4/3，13.3%;ε3/2，13.6%;ε2/2，1.1%;ε4/4，1.2%;ε4/2，2.0%;ε4，8.8%)相近。ε4 等位基因頻率亦接近于香港的7.4%;略高于臺(tái)灣的4.9%和新加坡的6.4%;低于大多數(shù)歐洲及北美人群。

PAOD和EH的共同病理基礎(chǔ)主要是動(dòng)脈粥樣硬化。李小鷹等〔8〕對(duì)北京社區(qū)2 124例60歲及60歲以上老年人的流行病學(xué)調(diào)查資料表明，PAOD在北京地區(qū)老年人群中的現(xiàn)患率為15.91%;在老年血脂異常患者中為17.18%;在老年血脂異常合并高血壓患者中為19.18%;在老年血脂異常合并糖尿病患者中為19.48%;在高齡血脂異?；颊咧袨?2.86%;高齡血脂異常患者PAOD的現(xiàn)患率是普通老年患者的2～3倍。由此說(shuō)明導(dǎo)致PAOD病理改變的因素中血脂異常與高齡起了關(guān)鍵的作用，高血壓、糖尿病亦是促進(jìn)PAOD病理改變的不容忽視的因素。PAOD、高血壓均為老年常見(jiàn)病，其發(fā)生發(fā)展與吸煙、飲酒、高鹽高脂飲食、肥胖、精神緊張和情緒變化等多種外界因素相關(guān)，遺傳因素在其發(fā)病中也起著重要作用〔4〕。ApoE是調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝的重要因素，有關(guān)ApoE基因多態(tài)性與PAOD的易感性研究在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。為了避免因病例選擇造成的偏倚，本研究選擇的病例及對(duì)照組均為中國(guó)北方漢族人、居住同一社區(qū)、無(wú)血脂異常、繼發(fā)性高血壓、糖尿病、血管梗死性疾病，盡可能減少這些因素的影響。本研究通過(guò)對(duì)EH、PAOD、EH+PAOD老年病例組與NC組ApoE基因多態(tài)性的分析發(fā)現(xiàn)，盡管ε4等位基因頻率三個(gè)病例組均高于NC組，ε3和ε2等位基因頻率均低于NC組，但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從而表明，在本研究人群中，ApoE等位基因ε4、ε3和ε2多態(tài)性不是老年EH和老年P(guān)AOD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可能與血脂正常的老年EH和老年P(guān)AOD發(fā)生無(wú)關(guān)，即血脂正常的老年人群中EH與PAOD的發(fā)生還有其他影響因素的參與。Yilmaz等〔9〕報(bào)道ApoE等位基因ε4與EH相關(guān)，與本研究結(jié)論不一致，可能與其病例組的選擇不都是血脂正常的老年人有關(guān)?？傊?，進(jìn)一步研究遺傳易感因素在老年EH和老年P(guān)AOD發(fā)病中的貢獻(xiàn)，有助于減少該病在老年人群中的發(fā)病率改善人們的生活質(zhì)量。

1 Weitz JI，Byrne J，Clagett GP，et al.Diagnosis and treatment of chronic arterial insufficiency of the lower extremities:a critical review〔J〕.Circulation，1996;94(11):3026-49.

2 Reilly SL，F(xiàn)errell RE，Kottke BA，et al.The gender-specific apolipoprotein E genotype influence on the distribution of lipids and apolipoproteins in the population of Rochester，MN.I.Pleiotropic effects on means and variances〔J〕.Am J Hum Genet，1991;49(6):1155-66.

3 Yang YG，Kim JY，Park S，et al.Apolipoprotein E genotyping by multiplex tetra-primer amplification refractory mutation system PCR in single reaction tube〔J〕.J Biotechnol，2007;131(2):106-10.

4 Smith FB，Lee AJ，Rumley A，et al.Tissue-plasminogen activator，plasminogen activator inhibitor and risk of peripheral arterial disease〔J〕.Atherosclerosis，1995;115(1):35-43.

5 Utermann G，Vogenberg KH，Steinmetz A，et al.Polymorphism of apolipoprotein E genetics of hyperlipoprotypeinemia type Ⅲ〔J〕.Clin Genet，1979;15(1):37-62.

6 Rastas S，Mattila K，Verkkoniemi A，et al.Association of apolipoprotein E genotypes，blood pressure，blood lipids and ECG abnormalities in a general population aged 85〔J〕.BMC Gefiatr，2004;4:1.

7 馬 鳳，梁超軻，程義斌，等.中國(guó)農(nóng)村老年人群APOE基因型頻率分布研究〔J〕.環(huán)境與健康雜志，2008;25(8):662-4.

8 李小鷹，王 潔，王全義，等.周圍動(dòng)脈硬化閉塞癥在老年血脂異常人群中的現(xiàn)患率調(diào)查〔J〕.中華老年心腦血管病雜志，2005;7(1):3-6.

9 Yilmaz H，Isbir T，Agachan B，et al.Is epsilon 4 allele of apolipoprotein E associated with more severe end-organ damage in essential hypertension〔J〕.Cell Biochem Funct，2001;19(3):191-5.