李萌萌 尹林偉 牛尚博 劉靜 黃夏榮 王金玲 孫光華 鐘培瑞 彭婷 曾國鋒 周君

【摘 要】目的：探討脈沖電磁場(chǎng)對(duì)老年大鼠關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨凋亡蛋白的影響。方法：采用隨機(jī)抽樣法將16只24月齡SD自然衰老雄性大鼠隨機(jī)等分為老年組和脈沖電磁組，8只6月齡SD青年雄性大鼠作為青年組。脈沖電磁組予脈沖電磁場(chǎng)干預(yù)，頻率為8 Hz，強(qiáng)度為3.82 mT，每日40 min，每周

5 d，持續(xù)8周。青年組和老年組固定于脈沖電磁場(chǎng)下，儀器不通電。8周后取材，ELISA法檢測(cè)血清

Ⅱ型膠原C端肽（CTX-Ⅱ）含量；顯微CT檢測(cè)左側(cè)脛骨軟骨下骨微結(jié)構(gòu)并分析骨組織形態(tài)量化指標(biāo)；番紅O-固綠染色觀察大鼠左側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，改良Mankin's評(píng)分評(píng)估大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織退行性變化程度。RT-qPCR、Western blot檢測(cè)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8（Caspase-8）、血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬蛋白酶-4（ADAMTS-4），以及血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬蛋白酶-5（ADAMTS-5）的mRNA與蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：①與青年組比較，老年組大鼠軟骨膠原分解產(chǎn)物CTX-Ⅱ水平升高（P < 0.05）；骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)量均降低

（P < 0.05），骨小梁厚度、骨小梁間距均增大（P < 0.05）；番紅O-固綠染色顯示，大鼠軟骨表面粗糙

有裂隙，軟骨與軟骨下骨界限模糊不清，且有潮線，低細(xì)胞化，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)不規(guī)則，蛋白多糖丟失且紅染變淡；改良Mankin's評(píng)分增加（P < 0.05）；Caspase-3、Caspase-8、ADAMTS-4、ADAMTS-5的mRNA及蛋白表達(dá)升高（P < 0.05）。②與老年組比較，脈沖電磁組大鼠軟骨膠原分解產(chǎn)物CTX-Ⅱ水平降低

（P < 0.05）；左側(cè)脛骨軟骨下骨的骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)升高，骨小梁數(shù)量增加（P < 0.05），骨小梁間距減?。≒ < 0.05），骨小梁厚度有降低趨勢(shì)（P > 0.05）；番紅O-固綠染色顯示，大鼠軟骨表面較為平整，軟骨與軟骨下骨界限分明，細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則、數(shù)量較多，蛋白多糖豐富且染色均勻；改良Mankin's評(píng)分較小

（P < 0.05）；Caspase-3、Caspase-8、ADAMTS-4、ADAMTS-5的mRNA及蛋白表達(dá)降低（P < 0.05）。結(jié)論：脈沖電磁場(chǎng)可能通過降低凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-8的表達(dá)及金屬蛋白酶ADAMTS-4、ADAMTS-5的表達(dá)，延緩老年大鼠關(guān)節(jié)軟骨退變與細(xì)胞外基質(zhì)降解，抑制局部骨質(zhì)疏松，發(fā)揮抗骨關(guān)節(jié)炎作用。

【關(guān)鍵詞】 膝骨關(guān)節(jié)炎；脈沖電磁場(chǎng)；關(guān)節(jié)軟骨；軟骨下骨；凋亡；大鼠

The Effect of Pulsed Electromagnetic Field on Apoptosis Proteins in Articular Cartilage and Subchondral Bone of Elderly Rats

LI Meng-meng，YIN Lin-wei，NIU Shang-bo，LIU Jing，HUANG Xia-rong，WANG Jin-ling，SUN Guang-hua，ZHONG Pei-rui，PENG Ting，ZENG Guo-feng，ZHOU Jun

【ABSTRACT】Objective：To explore

the effects of pulsed electromagnetic fields on apoptosis proteins in articular cartilage and subchondral bone of elderly rats.Methods：Sixteen 24-month-old SD naturally aging male rats were randomly divided into an elderly group and a pulsed electromagnetic group using random sampling method.

Eight 6-month-old SD young male rats were selected as the youth group.The pulsed electromagnetic group received pulsed electromagnetic field intervention at a frequency of 8 Hz and an intensity of 3.82 mT，with a duration of 40 minutes per day and 5 days per week for 8 weeks.The youth and elderly groups were fixed under pulsed electromagnetic fields，and the instruments were not powered on.After 8 weeks，samples were taken and ELISA was used to detect the content of C-telopeptide of typeⅡcollagen（CTX-Ⅱ）in serum;Micro CT（Micro-CT）was used to detect the microstructure of the left tibial subchondral bone and analyze quantitative indicators of bone tissue morphology;the morphological structure of the cartilage tissue on the left tibial plateau of rats was observed using safranin O-solid green staining，and the degree of degenerative changes in the knee joint cartilage tissue of rats was evaluated using the improved Mankin's score.RT-qPCR and Western blot were used to detect the mRNA and protein expression levels of Caspase-3，Caspase-8，ADAMTS-4 and ADAMTS-5.Results：

①Compared with the young group，the CTX - Ⅱ level of cartilage collagen decomposition product in the elderly group rats increased（P < 0.05）;bone density，bone volume fraction，and number of trabeculae all decreased（P < 0.05），

while bone trabecular thickness and spacing increased（P < 0.05）;safranin O-solid green staining showed that the surface of rat cartilage was rough with cracks，the boundary between cartilage and subchondral bone was unclear，and there was a tidal line，low cell count，irregular cell morphology and structure，loss of proteoglycans，and pale red staining;improved Mankin's score increased（P < 0.05）;the mRNA and protein expression of Caspase-3，

Caspase-8，ADAMTS-4，and ADAMTS-5 increased（P < 0.05）.②Compared with the elderly group，the

CTX -Ⅱ level of cartilage collagen decomposition products in the pulsed electromagnetic group rats decreased

（P < 0.05）;the bone density and bone volume fraction of the subchondral bone of the left tibia increased，the number of trabeculae increased（P < 0.05），the distance between trabeculae decreased（P < 0.05），and the thickness of trabeculae showed a decreasing trend（P > 0.05）;safranin O-solid green staining showed that the surface of rat cartilage was relatively flat，with clear boundaries between cartilage and subchondral bone，the cell morphology was more regular and numerous，and protein polysaccharides were abundant and evenly stained;the improved Mankin's score was relatively small（P < 0.05）;the mRNA and protein expression of Caspase-3，

Caspase-8，ADAMTS-4，and ADAMTS-5 decreased（P < 0.05）.Conclusion：Pulsed electromagnetic fields may delay articular cartilage degeneration and extracellular matrix degradation in elderly rats，inhibit local osteoporosis，and exert anti osteoarthritis effects by reducing the expression of apoptosis related proteins Caspase-3 and Caspase-8，as well as the expression of metalloproteinases ADAMTS-4 and ADAMTS-5.

【Keywords】 knee osteoarthritis;pulsed electromagnetic field;joint cartilage;subchondral bone;

apoptosis;rats

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是以軟骨退行性病變?yōu)橹饕卣?，伴軟骨下骨骨質(zhì)增生、滑膜炎癥反應(yīng)的異質(zhì)性疾?。?］。流行病學(xué)調(diào)查顯示，全世界有3億人患有OA，且患病率隨著人口老齡化加劇逐漸增加［2］。膝關(guān)節(jié)是高機(jī)械負(fù)荷的身體關(guān)鍵承受部位且使用頻繁，更易磨損導(dǎo)致膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）［3］。中國KOA患病率為21.51%［4］，給社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成極大負(fù)擔(dān)。脈沖電磁場(chǎng)是治療OA的一種安全無創(chuàng)的物理治療手段，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、促進(jìn)微循環(huán)等多種作用［5］。基礎(chǔ)研究顯示，脈沖電磁場(chǎng)可減輕KOA大鼠軟骨損傷，抑制滑膜炎癥［6］。臨床研究顯示，脈沖電磁場(chǎng)可有效緩解KOA患者的疼痛、關(guān)節(jié)僵硬，改善膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度［7］。近年來，軟骨細(xì)胞凋亡在OA發(fā)生、發(fā)展中的作用逐漸引起重視，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8（Caspase-8）等凋亡蛋白在軟骨退變過程中發(fā)揮重要作用［8］。課題組前期研究顯示，脈沖電磁場(chǎng)可增加軟骨細(xì)胞數(shù)量，減輕KOA大鼠軟骨損傷，下調(diào)促炎因子表達(dá)，但其具體機(jī)制尚未明確［9］。本研究基于細(xì)胞凋亡視角下觀察脈沖電磁場(chǎng)對(duì)老年大鼠關(guān)節(jié)軟骨的影響，并進(jìn)一步對(duì)軟骨下骨微結(jié)構(gòu)進(jìn)行量化分析，以期為臨床應(yīng)用脈沖電磁場(chǎng)治療OA提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 16只24月齡SD自然衰老雄性大鼠，體質(zhì)量（753±39）g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（川）2020-030。8只6月齡SD青年雄性大鼠，體質(zhì)量（527±46）g，由長沙天勤生物技術(shù)公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0013。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均于南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，每籠3只，活動(dòng)自由，飼料及飲水充足。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（湘）2020-0002。所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 血清Ⅱ型膠原C端肽試劑盒（廣州皓躍生物科技有限公司，批號(hào)7E2B2C3）；瓊脂糖（西班牙BIOWEST，批號(hào)111860）；mRNA、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)CW2569，CW2141）；TEMED試劑（Abiowell公司，批號(hào)AWB0068）；Trizol試劑（美國Thermo公司，批號(hào)15596026）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀，型號(hào)H1650R）；熒光定量RCP儀（美國Thermo公司，型號(hào)PIKOREAL96）；電泳儀（北京六一公司，型號(hào)DYY-2C）；電子天平（美國雙杰公司，型號(hào)JJ224BC）；生物樣品均質(zhì)儀（杭州奧盛公司，型號(hào)BioPrep-24）；顯微CT（廣州中科愷盛醫(yī)療科技有限公司，型號(hào)ZKKS-MCT-Sharp）。

2 方 法

2.1 分組與模型制作 按照隨機(jī)數(shù)字表法將16只24月齡SD自然衰老雄性大鼠隨機(jī)等分為老年組和脈沖電磁組，8只6月齡SD青年雄性大鼠為青年組。通過自然衰老復(fù)制老年組和脈沖電磁組的原發(fā)性O(shè)A模型［10］。青年組大鼠不做處理，2個(gè)月后取材時(shí)仍屬青年期年齡范疇。

2.2 實(shí)驗(yàn)干預(yù) 脈沖電磁組接受脈沖電磁場(chǎng)干預(yù)。脈沖電磁場(chǎng)參數(shù)參考課題組前期研究［9］：頻率為8 Hz，強(qiáng)度為3.82 mT。每日40 min，每周5 d，持續(xù)8周。青年組和老年組大鼠暴露于脈沖電磁場(chǎng)線圈的中心區(qū)域下，時(shí)間同脈沖電磁組，但儀器不通電。

2.3 指標(biāo)檢測(cè) 腹膜腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的戊巴比妥鈉（3 mL·kg-1）對(duì)大鼠行全身麻醉。

2.3.1 ELISA法檢測(cè)血清CTX-Ⅱ水平 取大鼠眼眶血3 mL，經(jīng)臺(tái)式離心機(jī)4 ℃，4000 r·min-1離心12 min，離心半徑10 cm，取上清液。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)血清CTX-Ⅱ水平。

2.3.2 顯微CT檢測(cè)骨微結(jié)構(gòu) 取大鼠左側(cè)脛骨近端，于多聚甲醛組織液中固定，顯微CT掃描并對(duì)軟骨下骨組織定量分析，檢測(cè)各組大鼠骨密度（BMD）、骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁間距

（Tb.Sp）。

2.3.3 番紅O-固綠染色及改良Mankin's評(píng)分 大鼠左側(cè)脛骨切片，脫蠟，水化，置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的固綠溶液中1 min，隨后置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為

1%的乙酸溶液中30 s，再置于番紅染液15 min，脫水、透明，封固。顯微鏡下觀察軟骨組織并進(jìn)行改良Mankin's評(píng)分，軟骨呈紅色，胞質(zhì)呈綠色。評(píng)分細(xì)則見表1，得分越高表示關(guān)節(jié)退變程度越重。

2.3.4 RT-qPCR檢測(cè)Caspase-3、Caspase-8、血小

板反應(yīng)蛋白解整合素金屬蛋白酶-4（ADAMTS-4）、血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬蛋白酶-5（ADAMTS-5）的mRNA表達(dá) 取適量大小關(guān)節(jié)組織，加液氮研磨，加1 mL Trizol混勻后裂解，加200 μL三氯甲烷劇烈振蕩，離心機(jī)4 ℃

12 000 r·min-1離心15 min，離心半徑10 cm，取上層液加等體積異丙醇混勻，同上參數(shù)離心去上清，加1 mL體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇洗滌沉淀，再離心，空氣干燥，溶解沉淀，計(jì)算濃度與純度，提取總RNA。以總mRNA為模板，離心，孵育，離心，冰上冷卻，逆轉(zhuǎn)錄cDNA。運(yùn)用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，北京擎科合成引物，熒光定量PCR反應(yīng)。引物序列見表2。

2.3.5 Western blot檢測(cè)Caspase-3、Caspase-8、ADAMTS-4、ADAMTS-5的蛋白表達(dá) 剪取0.025 g

組織，洗滌，加300 μL的RIPA裂解液，生物勻質(zhì)儀勻漿，冰上裂解10 min，離心，取離心后上清液。制膠，準(zhǔn)備樣品，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。加入Caspase-3、Caspase-8、ADAMTS-4、ADAMTS-5，將膜依次與一抗、二抗室溫孵育，ECL顯色、曝光。底片掃描，使用Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用IBM SPSS 26軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料均進(jìn)行SW檢驗(yàn)，且均符合正態(tài)分布。計(jì)量資料以表示，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差不齊則用韋爾奇檢驗(yàn)替代，組間比較采用F檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組CTX-Ⅱ水平比較 老年組大鼠血清CTX-Ⅱ水平較青年組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。脈沖電磁組大鼠血清CTX-Ⅱ水平較老年組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表3。

3.2 各組顯微CT及骨組織顯微結(jié)構(gòu)比較 顯微CT二維圖結(jié)果顯示，青年組大鼠脛骨解剖結(jié)構(gòu)清晰可見，骨松質(zhì)密度均勻，骨小梁結(jié)構(gòu)連續(xù)且排列規(guī)則整齊，骨小梁厚度均勻并呈海綿網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。老年組大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)連續(xù)性破壞且排列紊亂，骨小梁略微增厚且間隙增加，骨小梁數(shù)量較青年組有所減少。脈沖電磁組大鼠較老年組骨小梁數(shù)量有所增多，連續(xù)性介于青年組與老年組之間，排列緊湊，見圖1。與青年組比較，老年組大鼠BMD、BV/TV、Tb.N均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；Tb.Th、Tb.Sp均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

與老年組比較，脈沖電磁組大鼠BMD、BV/TV、Tb.N升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；Tb.Sp降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），Tb.Th有降低趨勢(shì)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表4。

3.3 各組番紅O-固綠染色及改良Mankin's評(píng)分比較 青年組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面平整光滑，軟骨與軟骨下骨結(jié)構(gòu)分明且界限清晰，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則且排列有序，紅染均勻。與青年組大鼠相比，老年組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙有裂隙，軟骨與軟骨下骨界限模糊不清，且有潮線，低細(xì)胞化，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)不規(guī)則且排列紊亂，蛋白多糖丟失且紅染變淡。與老年組大鼠相比，脈沖電磁組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面較為平整光滑，軟骨結(jié)構(gòu)清晰分明，細(xì)胞數(shù)量較為完整，細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則且排列較為有序，蛋白多糖豐富且染色均勻。見圖2。老年組改良Mankin's評(píng)分較青年組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；脈沖電磁組較老年組改良Mankin's評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表5。

3.4 各組Caspase-3、Caspase-8、ADAMTS-4、ADAMTS-5的mRNA表達(dá)比較 與青年組比較，老年組大鼠軟骨組織中Caspase-3、Caspase-8、ADAMTS-4、ADAMTS-5的mRNA水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；與老年組比較，脈沖電磁組大鼠軟骨組織中Caspase-3、Caspase-8、ADAMTS-4、ADAMTS-5的mRNA 水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表6。

3.5 各組Caspase-3、Caspase-8、ADAMTS-4及ADAMTS-5的蛋白表達(dá)比較 與青年組比較，老年組大鼠軟骨組織中Caspase-3、Caspase-8、ADAMTS-4、ADAMTS-5的蛋白水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與老年組比較，脈沖電磁組大鼠軟骨組織中Caspase-8、ADAMTS-4、ADAMTS-5的蛋白水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；Caspase-3的蛋白水平有降低趨勢(shì)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表7，圖3。

4 討 論

原發(fā)性KOA是臨床上最常見的OA類型，是指隨年齡自然衰老的退行性關(guān)節(jié)病變，衰老是其主要危險(xiǎn)因素［11］。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨的重要組成部分，可分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，為軟骨的力學(xué)功能提供重要基礎(chǔ)［12］。研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡是引起OA的主要原因［13］。

自然衰老是最接近原發(fā)性O(shè)A的造模方法，無創(chuàng)且高度模擬軟骨退行性病變的發(fā)展過程，較其他造模方式而言，該模型具有更高的可靠性和穩(wěn)定

性［14］。番紅O-固綠染色顯示，老年組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙有裂隙，軟骨結(jié)構(gòu)模糊不清并有多重潮線，改良Mankin's評(píng)分與青年組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。表明老年組大鼠軟骨損傷較嚴(yán)重，OA大鼠模型復(fù)制較成功。

脈沖電磁場(chǎng)是1970年由BASSETT等［15］引入的一種治療方法，1979年經(jīng)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床治療骨質(zhì)疏松、OA、骨折等骨科疾病。脈沖電磁場(chǎng)是一種非侵入性治療手段，采用重復(fù)脈沖頻率在短時(shí)間內(nèi)對(duì)機(jī)體組織施加間歇電流脈沖產(chǎn)生的磁場(chǎng)脈沖，導(dǎo)致離子或帶電粒子的強(qiáng)制運(yùn)動(dòng)。膠原蛋白的電特性使骨細(xì)胞可以感知壓力區(qū)域，進(jìn)而使人體發(fā)生電-物理相互作用，誘導(dǎo)骨的生長和重塑。WANG等［16］研究發(fā)現(xiàn)，脈沖電磁場(chǎng)可通過初生纖毛的存在調(diào)節(jié)骨細(xì)胞凋亡并抑制破骨細(xì)胞的形成。PAPACCIO等［17］研究發(fā)現(xiàn)，脈沖電磁場(chǎng)激活腺苷受體A2A和A3下游的基因誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖與分化。徐揚(yáng)等［18］研究發(fā)現(xiàn)，暴露于75 Hz脈沖電磁場(chǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體可有效緩解軟骨細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)合成，發(fā)揮抗OA作用，但脈沖電磁場(chǎng)對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡作用機(jī)制仍尚未明確，需要進(jìn)一步研究。

關(guān)節(jié)軟骨由少量軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成，其中膠原纖維、聚蛋白多糖是細(xì)胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)成分，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、遷移和動(dòng)態(tài)平衡等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。Ⅱ型膠原是膠原纖維的重要組成部分，CTX-Ⅱ是Ⅱ型膠原裂解產(chǎn)物并常被用于檢測(cè)軟骨降解與代謝情況［19］。CTX-Ⅱ也是OA診斷中最常見的標(biāo)志物之一。一項(xiàng)臨床研究表明，KOA患者血液、尿液中CTX-Ⅱ濃度水平同關(guān)節(jié)液中CTX-Ⅱ濃度水平變化趨勢(shì)一致，血液與尿液中CTX-Ⅱ濃度可以作為OA軟骨破損程度的有效早期診斷指標(biāo)［20］。CTX-Ⅱ的表達(dá)隨軟骨降解增加而升高。劉靜等［21］研究發(fā)現(xiàn)，OA大鼠血清CTX-Ⅱ表達(dá)顯著升高。HONG等［22］研究發(fā)現(xiàn)，脈沖電磁場(chǎng)治療可有效改善膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型。ADAMTS-4和ADAMTS-5屬于ADAMTS家族的基質(zhì)金屬蛋白酶，兩者具有相似的結(jié)構(gòu)域，都參與軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的裂解［23］。ZHAO等［24］研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素通過下調(diào)ADAMTS-4表達(dá)抑制OA實(shí)驗(yàn)大鼠軟骨細(xì)胞基質(zhì)降解。SIEBUHR等［25］研究發(fā)現(xiàn)，ADAMTS-5抑制劑可有效保護(hù)體內(nèi)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白聚糖。本研究老年組大鼠血清CTX-Ⅱ表達(dá)增加，ADAMTS-4、ADAMTS-5的mRNA與蛋白表達(dá)顯著升高，表明老年組大鼠的軟骨降解。隨著年齡增長，ADAMTS-4與ADAMTS-5表達(dá)升高，可能是通過切割聚蛋白多糖Glu373和Ala374切割位點(diǎn)裂解聚蛋白多糖［26］，進(jìn)而降解軟骨細(xì)胞外基質(zhì)。脈沖電磁場(chǎng)干預(yù)后，CTX-Ⅱ、ADAMTS-4、ADAMTS-5的表達(dá)均降低，表明脈沖電磁場(chǎng)可抑制軟骨降解。

近幾年，軟骨下骨在OA進(jìn)展中的作用逐漸引起研究者的關(guān)注。影像學(xué)技術(shù)顯示，OA關(guān)節(jié)軟骨下骨存在微結(jié)構(gòu)改變，包括早期骨質(zhì)流失，晚期骨質(zhì)硬化和組織病理學(xué)改變［27］。研究發(fā)現(xiàn)，OA早期軟骨下骨骨重塑異常，骨吸收更易被激活，可形成局部骨質(zhì)疏松［28］。OA的炎癥反應(yīng)會(huì)增加骨吸收，抑制骨形成，OA患者大都伴有全身性骨量丟失和骨質(zhì)疏松的高風(fēng)險(xiǎn)［29］。本研究中顯微CT顯示，老年組大鼠較青年組大鼠軟骨下骨組織中BMD、BV/TV、Tb.N顯著降低，Tb.Th、Tb.Sp顯著升高，提示軟骨下骨微環(huán)境異常，存在局部骨質(zhì)疏松。BLOISE等［30］研究表明，脈沖電磁場(chǎng)選擇性介導(dǎo)鈣相關(guān)的成骨途徑影響成骨細(xì)胞的分化，并顯著增強(qiáng)人間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化特征。本研究中脈沖電磁場(chǎng)干預(yù)后BMD、BV/TV、Tb.N明顯增多，Tb.Sp減少，表明脈沖電磁場(chǎng)干預(yù)可改善老年大鼠軟骨下骨微環(huán)境，抑制局部骨質(zhì)疏松的進(jìn)展。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，OA患者的軟骨細(xì)胞存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，且軟骨細(xì)胞凋亡與OA嚴(yán)重程度呈正相

關(guān)［31］。細(xì)胞凋亡是人體生長發(fā)育過程中的基本生理過程，在維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著不可或缺的作用。Caspase-3和Caspase-8都是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，屬于白細(xì)胞介素-1轉(zhuǎn)化酶家族，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［32］，兩者都以級(jí)聯(lián)放大的方式對(duì)胞內(nèi)蛋白進(jìn)行高效切割介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［33］。研究發(fā)現(xiàn)，OA軟骨細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的FADD-Caspase依賴性凋亡，與FAS/DR4/DR5-FADD-Caspase信號(hào)通路有關(guān)，通過激活Caspase-8及下游效應(yīng)因子Caspase-3觸發(fā)細(xì)胞凋亡［34］，凋亡小體在吸收鈣離子后會(huì)成為新的病理性礦化結(jié)晶，即病理性鈣化軟骨，病理性鈣化軟骨通過分泌炎癥因子、降解軟骨基質(zhì)引發(fā)組織炎癥，最終又促進(jìn)凋亡，循環(huán)往復(fù)，致使軟骨退變加重［35］。本研究發(fā)現(xiàn)，老年組大鼠Caspase-3和Caspase-8的mRNA和蛋白表達(dá)均升高，經(jīng)脈沖電磁場(chǎng)干預(yù)后Caspase-3和Caspase-8的mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低，說明脈沖電磁場(chǎng)能抑制軟骨細(xì)胞凋亡，減輕軟骨損傷。

綜上所述，脈沖電磁場(chǎng)可能通過抑制老年大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡與細(xì)胞外基質(zhì)過度降解，減輕軟骨下骨骨質(zhì)流失，發(fā)揮保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨作用。此實(shí)驗(yàn)所用參數(shù)參考國內(nèi)外相關(guān)研究，但未探討不同脈沖電磁場(chǎng)參數(shù)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的影響，這也是需要進(jìn)一步研究的方向。

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收稿日期：2023-11-20；修回日期：2024-01-09