林偉雄,王壽富,陳仕妍,陳清怡,莫秋怡,吳曉英,張正,鄧?yán)罴t

(廣東一方制藥有限公司,廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 佛山 528244)

五味子為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實(shí),又稱“北五味子”,在《神農(nóng)本草經(jīng)》中列為上品,主產(chǎn)于東北三省[1]。五味子具有益氣生津,收斂固澀,補(bǔ)腎寧心的功效,用于治療久咳虛喘、心悸失眠、自汗、盜汗、遺精遺尿等病癥[2]。五味子具有悠久的用藥歷史及臨床安全性,已被列入《可用于保健食品的物品名單》[3],其中所含的木脂素、有機(jī)酸及黃酮等[3-6]多種化學(xué)物質(zhì)群具有明顯的抗氧化效果[7-8],作為天然的抗氧化劑具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景[9]。

中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑是基于中醫(yī)理論與臨床基礎(chǔ),經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備而成的水煎劑,作為中藥配方顆粒工藝優(yōu)化和質(zhì)量控制的參照基準(zhǔn)[10-11]?！吨兴幣浞筋w粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》提出,明確標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及其在制劑制備中的應(yīng)用方法,有助于全過(guò)程把控中藥制劑的整體內(nèi)在質(zhì)量,進(jìn)而保障配方顆粒與臨床湯劑用藥和劑量的一致性[12]。目前,關(guān)于五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研究報(bào)道較少,僅有文獻(xiàn)[13-15]涉及了相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及評(píng)價(jià)研究,尚無(wú)針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)湯劑中化學(xué)成分與抗氧化活性方面的相關(guān)性評(píng)價(jià)。中藥水煎劑成分,作用靶點(diǎn)、途徑以及藥效規(guī)律復(fù)雜,單一的化學(xué)質(zhì)量研究不能滿足中藥評(píng)價(jià)整體性、臨床用藥一致性的需求,因此,對(duì)中藥進(jìn)行多層次質(zhì)量控制顯得尤為重要[16]。本文以五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑為研究對(duì)象,結(jié)合超高效液相色譜(UPLC)法和一測(cè)多評(píng)(QAMS)法同時(shí)測(cè)定8種成分的含量,并基于抗氧化活性和成分指標(biāo)的相關(guān)性評(píng)價(jià),初步篩選抗氧化質(zhì)量標(biāo)志物;進(jìn)一步針對(duì)候選成分進(jìn)行分子對(duì)接以及抗氧化活性的單體驗(yàn)證,以確定合理的質(zhì)量標(biāo)志物。本文旨在為五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的全面質(zhì)量評(píng)價(jià)提供有效、客觀、可行的方法。

1 材料

1.1 儀器

MiliQ Direct 8型超純水機(jī)(德國(guó)Merck公司);KQ-500DE型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);H-Class型UPLC儀(Empower3工作站,美國(guó)Waters公司);Thermo Vanquish型UPLC儀[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司];Agilent 1290 Infinity Ⅱ型UPLC儀(美國(guó)Agilent公司);UV-2600 probe型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司);ME204E型萬(wàn)分之一天平、XP26百萬(wàn)分之一天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

1.2 藥材與試劑

5-羥甲基糠醛對(duì)照品(批號(hào):CFS202102;純度:98%)購(gòu)自ChemFaces公司;原兒茶酸對(duì)照品(批號(hào):110809-201906;純度:99.7%)、五味子醇甲對(duì)照品(批號(hào):110857-201815;純度:99.7%)、五味子甲素對(duì)照品(批號(hào):110764-201915;純度:99.5%)、五味子乙素對(duì)照品(批號(hào):110765-201813;純度:99.1%)、維生素C(批號(hào):100425-202105;純度:100%)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;五味子醇乙對(duì)照品(批號(hào):ST05480120;純度:98%)購(gòu)自上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司;當(dāng)歸酰基戈米辛H對(duì)照品(批號(hào):wkq20090202;純度:99.51%)購(gòu)自四川省維克奇生物技術(shù)有限公司;五味子酯乙對(duì)照品(批號(hào):21091406;純度:98.81%)購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司;2,2'-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽(ABTS)和1,1-二苯基-2-三硝基苯自由基(DPPH)購(gòu)自蘇州格銳思生物科技有限公司;乙腈為色譜級(jí),其余試劑為分析純,水為超純水。

15批五味子飲片(編號(hào)S1～S15,具體來(lái)源信息見(jiàn)表1)經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實(shí)。

表1 15批五味子飲片來(lái)源信息Table 1 Resource information of 15 batches of Schisandra Chinensis Fructus

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Waters ACQUITY UPLC HSS T3(150 mm×2.1 mm, 1.8 μm);流動(dòng)相A:乙腈,流動(dòng)相B:0.2%冰醋酸溶液,梯度洗脫(0～3 min,5%A;3～5 min,5%～45%A;6～13 min,45%～50%A;13～23 min,50%～100%A;23～25 min,100%A;25～31 min,100%～5%A);檢測(cè)波長(zhǎng):260 nm;流速:0.4 mL·min-1;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:1 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取對(duì)照品5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、五味子醇甲、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H、五味子酯乙、五味子甲素和五味子乙素適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL中分別含5-羥甲基糠醛321.83 μg,原兒茶酸470.33 μg,五味子醇甲390.75 μg,五味子醇乙268.13 μg,當(dāng)歸?；昝仔罤 340.72 μg,五味子酯乙197.82 μg,五味子甲素299.10 μg和五味子乙素138.15 μg的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取干燥的五味子飲片100 g,加入8倍量的水,浸泡30 min后,武火煮沸后用文火保持微沸30 min,經(jīng)紗布濾過(guò);殘?jiān)尤?倍量的水,武火煮沸后用文火保持微沸25 min,經(jīng)紗布濾過(guò);合并2次煎液,60 ℃減壓濃縮至500 mL,共制備15批生藥濃度為200 mg·mL-1的五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑濃縮液[17]。取標(biāo)準(zhǔn)湯劑濃縮液各1 mL,置10 mL量瓶中,加入甲醇定容,搖勻,0.22 μm微孔濾膜濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別精密量取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白溶劑(甲醇)各1 μL,注入H- Class型UPLC儀。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,結(jié)果見(jiàn)圖1。空白溶劑對(duì)待測(cè)成分無(wú)檢測(cè)干擾,各成分保留時(shí)間一致、色譜峰的分離度均大于1.5。

注:A.混合對(duì)照品;B.標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品;C.空白溶劑;1.5-羥甲基糠醛;2.原兒茶酸;3.五味子醇甲;4.五味子醇乙;5.當(dāng)歸?；昝仔罤;6.五味子酯乙;7.五味子甲素; 8.五味子乙素

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.1、0.25、0.5、2.5、5 mL,分別置于10 mL量瓶中,甲醇定容得5個(gè)不同質(zhì)量濃度的系列混合對(duì)照品溶液,連同儲(chǔ)備溶液一起,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,記錄峰面積。以各待測(cè)對(duì)照品的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸。由表2可見(jiàn)8個(gè)成分在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表2 8個(gè)成分線性關(guān)系Table 2 Linear relationships for 8 constituents

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取同一批五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑(編號(hào)S1)1份,按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別于室溫放置0、2、4、8、12、24 h時(shí),按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄各成分的保留時(shí)間和峰面積,計(jì)算RSD。5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、五味子醇甲、五味子醇乙、當(dāng)歸?；昝仔罤、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素峰面積的RSD分別為1.80%、1.18%、0.37%、0.67%、0.52%、1.08%、0.38%、0.74%,保留時(shí)間的RSD分別為0.65%、0.68%、0.11%、0.14%、0.20%、0.12%、0.08%、0.07%(n=6),表明五味子供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 精密度試驗(yàn) 精密量取同一批五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑(編號(hào)S1)1份,按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄各成分的保留時(shí)間和峰面積,計(jì)算RSD。5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、五味子醇甲、五味子醇乙、當(dāng)歸?；昝仔罤、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素峰面積的RSD分別為1.59%、0.81%、0.14%、0.22%、0.46%、0.42%、0.11%、0.56%,保留時(shí)間的RSD分別為0.81%、0.85%、0.15%、0.17%、0.19%、0.10%、0.07%、0.06%(n=6),表明本儀器精密度良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取同一批五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑(編號(hào)S1)6份,按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄各成分的保留時(shí)間和峰面積,計(jì)算RSD。5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、五味子醇甲、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素含量的RSD分別1.83%、2.09%、1.70%、1.91%、1.47%、1.94%、1.83%、1.81%,保留時(shí)間的RSD分別為0.30%、0.33%、0.04%、0.05%、0.06%、0.03%、0.01%、0.01%(n=6),表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率考察 精密稱定已知含量的同一批五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑6 份,每份0.5 mL,按照1∶1比例加入對(duì)照品適量,按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,計(jì)算加樣回收率。5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、五味子醇甲、五味子醇乙、當(dāng)歸?；昝仔罤、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素的平均加樣回收率分別為106.84%、95.85%、102.78%、100.82%、102.24%、105.17%、102.10%、95.47%,RSD分別為1.67%、1.88%、0.76%、1.91%、2.71%、2.37%、1.29%、1.80%。

2.5 6種木脂素類成分QAMS法的建立

2.5.1 相對(duì)校正因子(fi)的測(cè)定 分別精密吸取“2.4.2” 項(xiàng)下的系列混合對(duì)照品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積。以五味子醇甲為內(nèi)參物,根據(jù)公式fi=(As·Ci)/(Ai·Cs)(As、Ai為內(nèi)參物和待測(cè)成分的峰面積,Cs、Ci為內(nèi)參物和待測(cè)成分的質(zhì)量濃度),計(jì)算得到五味子醇乙、當(dāng)歸?；昝仔罤、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素的fi分別為1.03、1.31、1.61、1.18、1.19,其RSD分別是1.05%、0.67%、0.35%、0.52%、1.27%,相對(duì)保留時(shí)間分別是1.14、1.34、1.49、1.66、1.72。

2.5.2 不同儀器、色譜柱、柱溫、流速對(duì)fi的影響 在其它色譜條件不變的情況下,分別考察不同儀器(Waters H-Class型、Thermo Vanquish型、Agilent 1290 Infinity Ⅱ型UPLC儀)、色譜柱[ACQUITY UPLC HSS T3(150 mm×2.1 mm, 1.8 μm)、CORTECS UPLC T3(150 mm×2.1 mm, 1.6 μm)、ACQUITY UPLC BEH C18(150 mm×2.1 mm, 1.7 μm)]、柱溫(25、30、35 ℃)、流速(0.3、0.35、0.4 mL·min-1)對(duì)各成分fi的影響,結(jié)果見(jiàn)表3。各成分fi的RSD為0.77%～1.86%,表明不同儀器、色譜柱、柱溫、流速對(duì)5種成分的fi的影響較小。

表3 不同儀器、色譜柱、柱溫和流速對(duì)fi的影響Table 3 Effects of various instruments, chromatographic columns, column temperatures and flow rates on fi

2.5.3 不同儀器、色譜柱、柱溫、流速對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響 以五味子醇甲為內(nèi)參物,考察“2.5.2”項(xiàng)下不同儀器、色譜柱、柱溫、流速對(duì)五味子醇乙、當(dāng)歸?；昝仔罤、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素相對(duì)保留時(shí)間的影響,結(jié)果見(jiàn)表4。5種成分的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.71%～2.71%,表明該方法可用于對(duì)目標(biāo)色譜峰的準(zhǔn)確定位。

表4 不同儀器、色譜柱、柱溫和流速對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響Table 4 Effects of various instruments, chromatographic columns, column temperaturesand flow rates on the relative retention time

2.6 五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑8種成分含量測(cè)定

取15批五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑,分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,采用外標(biāo)法(ESM)計(jì)算2種有機(jī)酸和6種木脂素類成分的含量,并進(jìn)一步比較ESM和QAMS計(jì)算方法下5個(gè)木脂素成分的含量結(jié)果差異,見(jiàn)表5。2種檢測(cè)結(jié)果較為接近,相對(duì)誤差(RE)<3.5%;同時(shí),借助Prism 9.0 對(duì)2者進(jìn)行t檢驗(yàn),2種測(cè)定方法的結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),所建立的方法可用于五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑中5-羥甲基糠醛、原兒茶酸和木脂素類(五味子醇甲、五味子醇乙、當(dāng)歸?；昝仔罤、五味子酯乙、五味子甲素和五味子乙素)共8種成分的同步含量測(cè)定。

表5 各成分含量測(cè)定結(jié)果(%,n=2)Table 5 Results of content determination results for various components(%,n=2)

2.7 化學(xué)模式分析

以不同批次五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的不同成分含量為原始數(shù)據(jù),MetaboAnalyst,以基于Ward法的歐氏距離為度量進(jìn)行系統(tǒng)聚類熱圖,可直觀反映樣品的近似程度及化學(xué)成分的整體分布規(guī)律,結(jié)果見(jiàn)圖2。所有樣品大致聚為3類,Ⅰ類包括S2～S3,Ⅱ類包括S7～S8、S11～S12、S14,Ⅲ類包括S1、S4～S6、S9～S10、S13、S15。其中,產(chǎn)自黑龍江的S2和S3,與另外1批黑龍江產(chǎn)的樣品(S1)以及其它2個(gè)產(chǎn)地明顯區(qū)分開(kāi),說(shuō)明樣品可能受產(chǎn)地來(lái)源以及加工等因素影響,其質(zhì)量存在一定個(gè)體差異。不同顏色代表不同成分指標(biāo)的含量高低,第Ⅰ類標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的原兒茶酸和五味子醇乙含量響應(yīng)強(qiáng)度較高,五味子酯乙、五味子甲素、當(dāng)歸?；昝仔罤和五味子乙素在第Ⅲ類中響應(yīng)較高,這些成分可能構(gòu)成不同批次樣品之間的主要差異性組分。

圖2 系統(tǒng)聚類熱圖Fig.2 Heatmap of system cluster analysis

為了更客觀地量化導(dǎo)致樣品質(zhì)量差異的化學(xué)成分,將不同成分的含量導(dǎo)入SIMCAP 14.0以進(jìn)行OPLS-DA建模,分別生成得分散點(diǎn)圖(圖3)以及變量投影重要性(VIP)值圖(圖4)。所擬合的模型中,R2x(cum)為0.840,穩(wěn)定性參數(shù)R2y(cum)為0.756,模型預(yù)測(cè)能力Q2(cum)為0.627,表明模型穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)能力均良好。200次置換檢驗(yàn)(圖5)顯示R2和Q2左側(cè)的點(diǎn)均高于右側(cè)的點(diǎn),斜率均為正值,Q2與縱軸相交數(shù)值<0,模型驗(yàn)證有效,無(wú)過(guò)擬合現(xiàn)象。圖3中樣品劃分為3類,且結(jié)果與聚類分析一致。VIP值>1的變量對(duì)解釋差異具有較大的貢獻(xiàn)意義,可作為影響五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的主要質(zhì)量差異物質(zhì)[18]。以VIP值>1為條件篩選質(zhì)量差異成分,可得到對(duì)樣品質(zhì)量差異貢獻(xiàn)較大的4個(gè)成分:原兒茶酸(VIP值=1.140 1)、五味子醇乙(VIP值=1.139 2)、五味子乙素(VIP值=1.021 2)、五味子酯乙(VIP值=1.002 7),提示這4者為質(zhì)量控制過(guò)程中的潛在質(zhì)量標(biāo)志物。

圖3 OPLS-DA得分散點(diǎn)圖Fig.3 Scoring scatter plot by OPLS-DA

圖4 VIP值圖Fig.4 VIP values

圖5 OPLS-DA模型置換檢驗(yàn)Fig.5 Permutation test for OPLS-DA model

2.8 五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑抗氧化活性測(cè)定

2.8.1 樣品溶液的制備 取15批“2.3”項(xiàng)下五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑濃縮液,濾過(guò),取續(xù)濾液,加水稀釋,制得質(zhì)量濃度(按生藥量計(jì))分別為0.25、0.5、2.0、5.0、10.0 mg·mL-1的系列濃度溶液A,用于DPPH自由基清除試驗(yàn);同法制得質(zhì)量濃度(按生藥量計(jì))分別為1.0、2.0、5.0、10.0、25.0 mg·mL-1的系列濃度溶液B,用于ABTS自由基清除試驗(yàn)。

2.8.2 DPPH自由基清除試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[19]方法并做出調(diào)整,配制0.06 mmol·L-1的DPPH作為反應(yīng)底物,以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照,取“2.8.1”項(xiàng)下樣品溶液A,分別設(shè)置空白組(400 μL甲醇+600 μL DPPH溶液)、對(duì)照組(400 μL樣品+600 μL甲醇)、樣品組(400 μL樣品或維生素C+600 μL DPPH溶液),避光反應(yīng)30 min后,使用紫外-分光光度計(jì)測(cè)得517 nm波長(zhǎng)處的吸光度,計(jì)算自由基清除率:自由基清除率=[1-(A樣品組-A對(duì)照組)/A空白組]×100%。以樣品濃度為橫坐標(biāo),自由基清除率為縱坐標(biāo),繪制清除曲線,計(jì)算DPPH自由基半數(shù)清除濃度(IC50)值,結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 15批五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑抗氧化活性測(cè)定結(jié)果Table 6 Results of antioxidative activities for 15 batchesof Schisandra Chinensis Fructus standard decoction

2.8.3 ABTS自由基清除試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[19]方法并做出調(diào)整,將7 mmol·L-1的ABTS儲(chǔ)備液和140 mmol·L-1的K2S2O8等體積混合,于4 ℃下避光保存12 h,得到ABTS·+工作液,反應(yīng)時(shí)采用無(wú)水乙醇進(jìn)行稀釋。以ABTS·+為底物,維生素C為陽(yáng)性對(duì)照,取“2.8.1”項(xiàng)下樣品溶液B,分別設(shè)置空白組(50 μL無(wú)水乙醇+950 μL ABTS·+溶液)、對(duì)照組(50 μL樣品+950 μL 無(wú)水乙醇溶液)、樣品組(50 μL樣品+950 μL ABTS·+溶液),避光反應(yīng)6 min后,于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度,計(jì)算自由基清除率:自由基清除率=[1-(A樣品組-A對(duì)照組)/A空白組]×100%。以樣品濃度為橫坐標(biāo),自由基清除率為縱坐標(biāo),繪制清除曲線,計(jì)算ABTS自由基半數(shù)清除濃度(IC50)值,結(jié)果見(jiàn)表6。

2.8.4 結(jié)果分析 由表6可知,各樣品對(duì)DPPH和ABTS自由基均有一定的清除效果,但均弱于陽(yáng)性組。不同批次樣品之間抗氧化能力差異較大,代表DPPH清除能力的IC50值在1.561～5.444 mg·mL-1之間,樣品清除DPPH的能力大小為S2>S3>S9>S5>S15>S14>S10>S11>S8>S1>S4>S6>S13>S7>S12,其中,排名靠前的為產(chǎn)自黑龍江的S2和S3批次;代表ABTS清除能力的IC50在2.048～11.364 mg·mL-1之間,樣品清除ABTS的能力大小為S6>S2>S3>S14>S12>S10>S9>S5>S15>S4>S11>S7>S8>S1>S13,排名靠前的為黑龍江的S2和S3、吉林的S6批次。雖然整體上S2和S3這2批黑龍江產(chǎn)地樣品對(duì)DPPH和ABTS的清除能力較為靠前,但剩余的1個(gè)黑龍江批次樣品與其余2個(gè)產(chǎn)地(吉林和遼寧)的樣品之間無(wú)明顯強(qiáng)弱之分,說(shuō)明五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑抗氧化效果的差異可能受產(chǎn)地來(lái)源、加工處理以及采收時(shí)間等多種外界條件影響。

2.9 譜效關(guān)系分析

2.9.1 灰色關(guān)聯(lián)度分析(GRA) 以DPPH、ABTS自由基清除活性指標(biāo)為母序列,五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的8種成分含量為子序列,進(jìn)行GRA,采用均值化將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)量綱化,再計(jì)算各子序列與母序列的絕對(duì)差、關(guān)聯(lián)系數(shù),最終確定關(guān)聯(lián)度(r),結(jié)果見(jiàn)表7。一般認(rèn)為,r>0.5時(shí)表示子序列與母序列有一定關(guān)系,數(shù)值越大則該成分與抗氧化作用的相關(guān)性越大[20]。由此可知,8個(gè)成分與DPPH、ABTS自由基清除能力的r值均大于 0.5,說(shuō)明各成分對(duì)抗氧化效應(yīng)均有不同程度的貢獻(xiàn)。8種成分對(duì)DPPH自由基清除作用的貢獻(xiàn)度為原兒茶酸>五味子醇乙>五味子乙素>當(dāng)歸?；昝仔罤>五味子酯乙>五味子甲素>五味子醇甲>5-羥甲基糠醛,對(duì)ABTS自由基清除作用的貢獻(xiàn)度為原兒茶酸>五味子醇乙>五味子甲素>五味子酯乙>五味子乙素>5-羥甲基糠醛>當(dāng)歸?；昝仔罤>五味子醇甲。在2種抗氧化能力GRA排名中均靠前5位的成分為原兒茶酸、五味子醇乙、五味子酯乙、五味子乙素。

表7 GRA結(jié)果Table 7 Results of GRA

2.9.2 偏最小二乘回歸分析(PLSR) 由于GRA側(cè)重于闡述成分與活性之間關(guān)聯(lián)程度的大小,因此需要進(jìn)一步結(jié)合PLSR綜合描述各成分對(duì)活性指標(biāo)的貢獻(xiàn)率和相互作用。以樣品8個(gè)成分的含量為自變量,以DPPH、ABTS自由基清除作用為因變量,分別導(dǎo)入SIMCA 14.0進(jìn)行PLSR。一般情況下,VIP值大于0.5的自變量被認(rèn)為對(duì)解釋因變量具有意義,VIP值大于1的自變量被認(rèn)為對(duì)解釋因變量有較大意義[18];同時(shí),當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)為正值則表示成分含量與抗氧化效應(yīng)呈正相關(guān),反之為負(fù)相關(guān)。由圖6可知,五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑中對(duì)DPPH清除活性的VIP值大于0.5的成分為原兒茶酸、五味子醇乙、5-羥甲基糠醛、五味子甲素和五味子酯乙,提示這些成分與DPPH自由基反應(yīng)密切相關(guān);其中,原兒茶酸、五味子醇乙、五味子乙素的回歸系數(shù)分別為0.395、0.360、0.035,呈正相關(guān)性,提示這3個(gè)成分對(duì)清除DPPH具有重要作用。由圖7可知,五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑中對(duì)ABTS清除活性的VIP值大于0.5的成分為原兒茶酸、五味子醇乙、五味子酯乙、五味子甲素、5-羥甲基糠醛和五味子醇甲,提示這些成分與ABTS自由基反應(yīng)密切相關(guān);其中,原兒茶酸、五味子醇乙、五味子酯乙的回歸系數(shù)分別為0.382、0.279、0.131,呈明顯正相關(guān),提示其對(duì)清除ABTS具有重要作用。此外,五味子乙素的VIP值(0.492)接近0.5,且具有較明顯的正回歸值(0.085),因此推測(cè)其對(duì)ABTS清除作用也具有貢獻(xiàn)意義。

圖6 各成分對(duì)DPPH清除作用的VIP值貢獻(xiàn)圖(A)和標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)圖(B)Fig.6 VIP contribution(A) and normalized regression coefficient(B) diagrams ofDPPH scavenging activity by various components

圖7 各成分對(duì)ABTS清除作用的VIP貢獻(xiàn)圖(A)和標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)圖(B)Fig.7 VIP contribution(A) and normalized regression coefficient(B) diagrams ofABTS scavenging activity by various components

根據(jù)GRA和PLSR的綜合結(jié)果,在GRA排名前5位的基礎(chǔ)上,以DPPH或ABTS任一指標(biāo)的PLSR模型中VIP值接近或大于0.5、回歸系數(shù)為正值優(yōu)選原兒茶酸、五味子醇乙、五味子酯乙和五味子乙素為五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑抗氧化活性的候選質(zhì)量標(biāo)志物。

2.10 分子對(duì)接預(yù)測(cè)

通過(guò)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué),篩選出4個(gè)備選的質(zhì)量和抗氧化活性差異成分原兒茶酸、五味子醇乙、五味子酯乙及五味子乙素,基本滿足作為質(zhì)量標(biāo)志物的專屬性、穩(wěn)定性、可測(cè)性、有效性等基本特征[20],推測(cè)其可能為五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑發(fā)揮抗氧化活性的質(zhì)量標(biāo)志物。為進(jìn)一步探究4個(gè)成分與抗氧化活性的關(guān)聯(lián),采用分子對(duì)接初步預(yù)測(cè)其與相關(guān)靶點(diǎn)的結(jié)合機(jī)制。從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲取配體化合物SDF結(jié)構(gòu),通過(guò)檢索相關(guān)文獻(xiàn)[21-24]和RSCB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)獲取9個(gè)抗氧化相關(guān)受體的晶體結(jié)構(gòu),具體信息見(jiàn)表8。對(duì)蛋白進(jìn)行去水和修飾配體、加電荷、計(jì)算Gasteiger等常規(guī)處理,導(dǎo)出PDB格式文件完成受體準(zhǔn)備。將受體和化合物導(dǎo)入AutoDockTools 1.5.6軟件,確定對(duì)接盒子的位置及大小,導(dǎo)出PDBQT格式文件;之后用AutoDock vina 1.1.2軟件進(jìn)行配體化合物與受體的對(duì)接模擬,所得結(jié)果采用Pymol軟件進(jìn)行可視化分析[25]。

表8 抗氧化相關(guān)受體蛋白信息Table 8 Information about antioxidant-related receptors

化合物與靶點(diǎn)之間的結(jié)合能越小,表明釋放的能量更多,結(jié)合體的構(gòu)象越穩(wěn)定,一般認(rèn)為結(jié)合能<-5.0 kJ·moL-1表示結(jié)合活性較好,結(jié)合能<-7.0 kJ·moL-1表示結(jié)合活性極強(qiáng)[26]。根據(jù)表9結(jié)果可知,4個(gè)活性成分與多個(gè)抗氧化受體蛋白均有一定的結(jié)合能力,主要與LOX-5、HO-1、CYP2C9、HO-2、XOD均有較好的親和力,原兒茶酸、五味子酯乙與CYP2C9,五味子醇乙與HO-2,五味子乙素與XOD的結(jié)合性最好,具體對(duì)接示意圖見(jiàn)圖8。分子通過(guò)與氨基酸殘基的相互作用保證其與靶點(diǎn)之間較強(qiáng)的結(jié)合力,原兒茶酸結(jié)合CYP2C9,與TRP-120、ARG-124、ILE-112和VAL-436等殘基形成氫鍵作用,平均鍵長(zhǎng)為2.1 ?;五味子醇乙結(jié)合HO-2,與ALA-208和ASP-210殘基形成氫鍵作用,平均鍵長(zhǎng)為2.6 ?;五味子酯乙結(jié)合CYP2C9,與ARG-132和LYS-270殘基形成氫鍵作用,平均鍵長(zhǎng)為2.3 ?;五味子乙素結(jié)合XOD,與ASN-1173殘基形成氫鍵作用,平均鍵長(zhǎng)為2.7 ?。4個(gè)高活性成分可能通過(guò)參與酶促氧化體系調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激進(jìn)而發(fā)揮抗氧化作用。

注:A.原兒茶酸與CYP2C9對(duì)接圖;B.五味子醇乙與HO-2對(duì)接圖;C.五味子酯乙與CYP2C9對(duì)接圖;D.五味子乙素與XOD對(duì)接圖

表9 五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑活性成分與靶點(diǎn)對(duì)接的結(jié)合能/(kJ·moL-1)Table 9 Binding energy between active components from Schisandra Chinensis Fructusstandard decoction and targets/(kJ·moL-1)

2.11 單體成分對(duì)DPPH和ABTS自由基清除能力的驗(yàn)證

精密稱定4種活性成分單體對(duì)照品,以甲醇為溶劑,分別將其配制成1.07、0.43、0.17、0.069、0.027、0.011、0.004 mg·mL-1的系列濃度的溶液,與DPPH、ABTS工作液反應(yīng),計(jì)算各成分的清除率。表10結(jié)果表明,原兒茶酸對(duì)DPPH和ABTS自由基均具有較強(qiáng)的清除活性,且呈現(xiàn)明顯的濃度依賴關(guān)系,IC50值分別為0.020、0.049 mg·mL-1。而五味子醇乙、五味子酯乙及五味子乙素的單體對(duì)照品溶液在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)對(duì)DPPH和ABTS均無(wú)清除作用,因此,最終建議將原兒茶酸作為五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑抗氧化活性的質(zhì)量標(biāo)志物。

表10 單體化合物DPPH、ABTS自由基清除率(%)Table 10 Free radical scavenging rate against DPPHand ABTS by single compound(%)

3 討論

預(yù)實(shí)驗(yàn)分別對(duì)甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%冰醋酸、乙腈-0.2%冰醋酸等不同流動(dòng)相體系進(jìn)行了考察,發(fā)現(xiàn)采用乙腈-0.2%冰醋酸流動(dòng)相系統(tǒng)時(shí),各色譜峰分離效果良好,峰形較好,且基線相對(duì)平穩(wěn)。考察不同流速0.3、0.35、0.4 mL·min-1下,各成分色譜峰峰形和分離度均良好,最終選擇0.4 mL·min-1,客觀上可提高分析效率。以五味子醇甲為內(nèi)標(biāo)物,對(duì)6種木脂素類成分建立QAMS,QAMS與ESM的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異(P>0.05),并對(duì)其余2種成分(5-羥甲基糠醛、原兒茶酸)同步進(jìn)行含量測(cè)定,進(jìn)而建立了基于QAMS的8種成分的含量測(cè)定方法。

樣品含量聚類和OPLS-DA分析結(jié)果顯示,原兒茶酸、五味子醇乙、五味子酯乙、五味子乙素是導(dǎo)致批次間質(zhì)量差異的主要成分。批次S2和S3均聚為一類,這2批樣品中原兒茶酸和五味子醇乙的含量均明顯高于其它批次;這2批樣品清除DPPH和ABTS自由基的能力亦在樣品中靠前,抗氧化效果較好,可能與原兒茶酸和五味子醇乙含量較高有關(guān),同時(shí)推測(cè)這可能是由于藥材的產(chǎn)地、采收期以及加工方式等因素綜合導(dǎo)致的質(zhì)量差異。

GRA結(jié)果顯示,8種成分均與抗氧化作用具有關(guān)聯(lián)性,其中原兒茶酸、五味子醇乙的關(guān)聯(lián)度最高;在PLSR中,原兒茶酸、五味子醇乙、五味子乙素與DPPH、ABTS的清除作用均呈正相關(guān),五味子酯乙則與ABTS的清除作用呈正相關(guān)。同時(shí),借助標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)表征不同成分與活性指標(biāo)之間的正負(fù)相關(guān)性,剔除GRA數(shù)值大但對(duì)抗氧化產(chǎn)生抑制作用的物質(zhì),2種方法互為補(bǔ)充和印證。原兒茶酸是典型的具鄰羥基的多酚化合物,鄰苯二酚結(jié)構(gòu)決定了其羥基極易斷裂并失去電子的性質(zhì),該結(jié)構(gòu)能夠結(jié)合活性自由基ROS、O2等并使其淬滅;此外,原兒茶酸通過(guò)螯合過(guò)渡金屬離子,或上調(diào)機(jī)體超氧化歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)多種酶活性,以阻止H2O2等自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng),在多種氧化應(yīng)激模型中具有明顯的抗氧化能力[27]。DPPH和ABTS自由基分別通過(guò)氫轉(zhuǎn)移和電子轉(zhuǎn)移終止自由基反應(yīng),理論上由聯(lián)苯環(huán)辛烯型木脂素上的酚羥基提供可解離的質(zhì)子或電子進(jìn)行清除,但大部分木脂素類的酚羥基很少,多為解離度較低的二氧甲基取代基團(tuán),因此與自由基的結(jié)合特性主要取決于該基團(tuán)C原子的正電荷密度大小和空間位阻。本研究綜合五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)DPPH和ABTS的清除活性,推測(cè)木脂素成分對(duì)自由基的清除活性可能存在以下規(guī)律:五味子醇乙、五味子乙素和五味子酯乙均有相對(duì)良好的活性,而五味子醇甲、當(dāng)歸?；昝仔罤以及五味子甲素的活性相對(duì)較弱甚至無(wú)清除活性[28-29]。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,CYP2C9屬于細(xì)胞色素酶家族成員,正常生理狀態(tài)下通過(guò)催化代謝途徑中的氧化還原反應(yīng)維持氧化還原的平衡,病理狀態(tài)下CYP2C9基因過(guò)表達(dá)導(dǎo)致副產(chǎn)物ROS自由基的大量產(chǎn)生,從而加劇氧化應(yīng)激、肝損傷、炎癥反應(yīng)等各種代謝異常[30]。XOD通過(guò)催化黃嘌呤氧化生成超氧陰離子或過(guò)氧化氫,引起多種組織氧化損傷[31],而五味子活性成分可以作為這些氧化關(guān)鍵酶的抑制劑。分子對(duì)接是一種常用的分子構(gòu)象模擬工具,可用于探究活性物質(zhì)與不同氧化酶的結(jié)合機(jī)制?；谧V效篩選結(jié)果,進(jìn)一步對(duì)潛在的單體成分進(jìn)行分子對(duì)接預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)原兒茶酸、五味子醇乙、五味子酯乙、五味子乙素均能與多種抗氧化相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合,但隨后的體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,3種木脂素成分均無(wú)明顯的DPPH和ABTS清除活性,原兒茶酸對(duì)2種自由基均有較高的清除能力,其IC50值分別為0.020、0.049 mg·mL-1。

綜上所述,原兒茶酸可能通過(guò)清除自由基及結(jié)合多種核心靶點(diǎn)的方式發(fā)揮抗氧化效應(yīng),建議將其作為五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑抗氧化作用的質(zhì)量標(biāo)志物。值得關(guān)注的是,多項(xiàng)研究顯示五味子木脂素提取液對(duì)DPPH和ABTS均有良好的清除效果[5,32],其清除能力與木脂素成分具有明顯的關(guān)聯(lián)性[33-34],由此推測(cè)五味子醇乙、五味子酯乙及五味子乙素的清除作用可能是與五味子中多種成分協(xié)同作用的結(jié)果。同樣地,Song等[35-36]表明五味子木脂素單體雖不能直接清除體外DPPH或ABTS自由基,但五味子乙素能通過(guò)清除細(xì)胞自由基ROS,以及通過(guò)Bax和Caspase-3轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號(hào)通路,降低Aβ介導(dǎo)的PC12細(xì)胞毒性[35]。五味子醇乙可降低卵巢癌細(xì)胞中的ROS水平,并下調(diào)細(xì)胞周期蛋白CDK4、CCNB1的表達(dá),進(jìn)而抑制癌細(xì)胞增殖[37]。Liu等[38]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示五味子酯乙可抑制APP/PS1模型小鼠的氧化應(yīng)激和BACEI酶以提高其認(rèn)知水平。此外,本文通過(guò)含量-活性關(guān)系發(fā)現(xiàn)五味子醇乙、五味子酯乙及五味子乙素可能與五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的抗氧化作用呈正相關(guān),上述分子對(duì)接和文獻(xiàn)研究亦顯示三者可能介導(dǎo)多種相關(guān)靶點(diǎn)從而調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激系統(tǒng),提示五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的抗氧化效果可能是通過(guò)成分之間的不同作用效應(yīng)聯(lián)合產(chǎn)生的。所以,在后續(xù)研究中可以更深入地探索成分之間的作用關(guān)系,以研究五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的抗氧化作用機(jī)制。本研究為評(píng)價(jià)五味子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量指標(biāo)、抗氧化的藥效基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供新思路。