黃思瑩, 馮旗園, 包旺林, 黃瀟正, 武文星, 趙明,2, 段金廒,2, 劉睿,2

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點(diǎn)研究室,江蘇 南京 210023;2.動物類中藥與功能肽國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210023)

水牛角(Bubali Cornu)是牛科動物水牛的角,始載于《名醫(yī)別錄》:“療時(shí)氣寒熱頭痛”[1],為我國傳統(tǒng)的動物類中藥,具有清熱涼血,解毒定驚的功效,常用于溫病高熱、神昏譫語、發(fā)斑發(fā)疹、吐血衄血、驚風(fēng)、癲狂等疾病的治療[1-2]。課題組前期研究表明水牛角含巰基類成分(-SH active fraction, SHF)為重要的功效物質(zhì),通過納米材料、親和層析等方法制備的水牛角含-SH肽類成分能夠顯著提高氧化損傷小鼠微腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活率,并減少炎癥損傷小鼠單核巨噬細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌,表現(xiàn)出顯著的抗炎、抗氧化作用[1]。

現(xiàn)代研究表明,含-SH或二硫鍵(-S-S-)類成分具有解熱、抗炎、抗氧化等效應(yīng),如N-乙酰半胱氨酸(NAC)、谷胱甘肽(GSH)、α-硫辛酸等,與-SH、-S-S-類成分參與機(jī)體炎癥、氧化應(yīng)激通路等有關(guān),NAC一方面通過抑制MAPK/NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎作用,另一方面通過激活Nrf2通路減輕氧化應(yīng)激[3-4];GSH能夠通過激活Nrf2/HO-1信號通路從而降低過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和活性氧的產(chǎn)生[5];α-硫辛酸通過抑制NF-κB信號通路,下調(diào)IL-6、IL-1β及TNF-α的表達(dá),減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥模型[6]。

角蛋白含有豐富的-SH、-S-S-類成分,并具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗驚厥等作用[7],課題組前期采用納米材料富集、親和樹脂層析等方法制備了水牛角SHF,并從細(xì)胞層面評價(jià)其抗炎、抗氧化作用[1,3]。然而,這些方法過程繁瑣,且富集量為μg或mg級別,僅可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞層面評價(jià)其效應(yīng),無法確保動物實(shí)驗(yàn)及后續(xù)深入研究的開展。

為此,本文采用十二烷基硫酸鈉-二硫蘇糖醇(SDS-DTT)聯(lián)合提取法制備了g級別的水牛角SHF,并對其物質(zhì)基礎(chǔ)及-SH水平進(jìn)行分析表征。采用LPS致大鼠發(fā)熱模型[8],評價(jià)水牛角SHF的解熱效應(yīng),同時(shí)測定了血漿和下丘腦中關(guān)鍵炎癥因子的水平,并采用非靶向代謝組學(xué)研究水牛角SHF對發(fā)熱大鼠血漿代謝物的干預(yù)情況,以期深入闡明水牛角發(fā)揮解熱效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ),為效應(yīng)機(jī)制評價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級SD雄性大鼠,體質(zhì)量180～220 g。購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司,實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2022-0004,飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,室溫保持在21～25 ℃,相對濕度為45%～50%,自由進(jìn)食和飲水。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)(倫理批件號: 202304A047)。

1.2 藥材與試劑

水牛角購自江蘇淮安,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)劉圣金教授鑒定為?？苿游锼ubalusbubalisLinnaeus的角,符合2020年版《中華人民共和國藥典》項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)。BCA蛋白濃度測定試劑盒[翌圣生物科技(上海)股份有限公司,批號:B0220871];5,5′-二硫代雙-2-硝基苯甲酸(DTNB)、二硫蘇糖醇(DTT)、1.5 mol·L-1Tris-HCl緩沖液pH 8.8、十二烷基硫酸鈉(SDS)(南京翼飛雪生物科技有限公司,批號:809Q051、125B0424、TU1124、YS0005-500);碘乙酰胺(IAA)(合肥博美生物科技有限責(zé)任公司,批號:PD110503);乙二胺四乙酸(EDTA)、人工小腸液(上海源葉生物科技有限公司,批號:D09HS203547、L17M11G113388);氯化鈉(NaCl)、戊巴比妥鈉、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號:20220117、F20020405、20120110);半胱氨酸(上海阿拉丁試劑有限公司,批號:G2013204);阿司匹林腸溶片(德國Bayer公司,批號:BJ71772);LPS(Sigma公司,批號:0000189847);氯化鈉注射液(辰欣藥業(yè)股份有限公司,批號:E23050223);PGE2試劑盒、IL-1β試劑盒、TNF-α試劑盒、cAMP試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號:20230810A-25036B、20230810A-16514B、20230810A-10064B、20230810A-36512B);丙酮、乙醇(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號:20180113、20221205);三氟乙酸(TFA)(色譜純,上海麥克林生化科技股份有限公司);乙腈(色譜純,美國天地試劑公司,批號:23095227);甲醇(質(zhì)譜純,Sigma,批號:I117007144);甲酸(質(zhì)譜純,Thermo Fisher Scientific,批號:WA3144081)。

1.3 儀器

Waters Xevo G2-XS QTof系統(tǒng)(英國Waters公司);MassLynx質(zhì)譜工作站(英國Waters公司);戴安U3000 Nano RSLC納升液相系統(tǒng)(美國DIONEX公司);Thermo Q Exactive Plus Orbitrap質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher公司);Multiskan GO型全波長酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific);Tiss-24組織研磨儀(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司);3-16PK高速冷凍離心機(jī)(美國Sigma公司);7810040型真空濃縮蒸發(fā)儀(美國Labconco公司);Freezone 4.5 plus冷凍干燥機(jī)(美國Labconco公司);YT308醫(yī)用電子體溫計(jì)(江蘇魚躍公司);BT 125 D型電子分析天平(德國Sartorious公司);FA 2004型電子分析天平(上海上平儀器設(shè)備有限公司);MO-AOR型培養(yǎng)箱(美國Major Science公司)。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 水牛角水提液的制備 稱取約50 g過45目篩的水牛角粉末,加入500 mL水,回流提取8 h,濾過,得濾液;濾渣加入400 mL水回流提取8 h,濾過,合并2次濾液,將其適當(dāng)濃縮后5 000 r·min-1離心15 min,取上清,得水牛角水提液。

2.1.2 水牛角SHF的制備 按質(zhì)量體積比1 g∶10 mL加入SDS-DTT緩沖液(含0.1mol·L-1DTT的4%SDS Tris-HCl buffer),60 ℃水浴攪拌過夜,5 000 r·min-1離心15 min,取上清,再用終濃度為80%的乙醇4 ℃沉淀過夜,5 000 r·min-1離心15 min,棄上清,沉淀用80%乙醇洗滌2次,敞口放置1 h,得到干燥的水牛角SHF,-80 ℃下冷凍保存。動物實(shí)驗(yàn)臨用前用0.5%CMC-Na溶液配成一定濃度的混懸液。

2.2 水牛角樣品中蛋白和游離-SH的含量測定

將干燥后的水牛角SHF研磨粉碎,按質(zhì)量體積比1 g∶5 mL加入人工小腸液,37 ℃搖床翻轉(zhuǎn)12 h后,3 000 r·min-1離心10 min,取上清,得酶解后的水牛角SHF,用BCA蛋白濃度測定試劑盒和Ellman比色法分別測定水牛角樣品的蛋白濃度和游離-SH含量[3]。

2.3 基于nano LC-MS/MS技術(shù)鑒定水牛角SHF

2.3.1 樣品前處理 按照蛋白和胰酶質(zhì)量比為100∶1的比例向水牛角樣品中加入0.1 μg·μL-1的胰酶,37 ℃水浴12 h,加入10%TFA終止酶解后加入0.1 mol·L-1DTT,放置30 min,加入0.2 mol·L-1IAA,避光放置30 min,采用Waters Sep-Pak C18固相萃取小柱脫鹽后濃縮揮干,加入0.1%甲酸溶解為1.0 μg·μL-1的樣品,待進(jìn)質(zhì)譜分析。

2.3.2 色譜與質(zhì)譜條件 色譜條件:色譜柱為Reprosil C18AQ柱(150 mm×75 μm,5 μm);進(jìn)樣量為2 μL,流速為400 nL·min-1;流動相A為乙腈-甲酸-水(2∶0.2∶98),流動相B為乙腈-甲酸-水(80∶0.2∶20),2%～30%B線性梯度洗脫60 min。

質(zhì)譜條件:噴霧電壓為2.5 kV;離子傳輸毛細(xì)管溫度200 ℃;質(zhì)譜一級全掃描范圍m/z300～2 000;分離寬度3。串聯(lián)質(zhì)譜分析獲得總離子色譜圖(TIC),通過碰撞誘導(dǎo)解離(CID),產(chǎn)生一系列二級串聯(lián)質(zhì)譜圖。

采用PEAKS 8.5軟件進(jìn)行搜庫分析,選擇?？频鞍踪|(zhì)數(shù)據(jù)庫(Bovidae,2023年1月下載于http://www. uniprot.org);檢索參數(shù):前體離子誤差20 ppm,子離子誤差0.2 Da;酶切方式:胰蛋白酶酶切(Trypsin);翻譯后修飾(PTM):固定PTM為半胱氨酸的氨甲酰甲基化(+57.02),可變PTM為甲硫氨酸的氧化(+15.99),脯氨酸的羥基化(+15.99),天冬氨酸和谷氨酰胺的脫酰胺(+0.98),N端的乙?；?+42.01);允許兩個(gè)位點(diǎn)誤切,假陽性率(FDR)≤1%;其他為默認(rèn)參數(shù),在上述檢索條件下所得的分值有顯著性意義(P<0.05)被認(rèn)為有效的鑒定結(jié)果。

2.4 實(shí)驗(yàn)動物造模、分組與給藥

實(shí)驗(yàn)動物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d,實(shí)驗(yàn)前3 d每日早晚各1次對大鼠進(jìn)行適應(yīng)性測體溫操作,實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日致熱前每隔30 min測1次體溫,共2次,取平均值作為基礎(chǔ)體溫,選取體溫范圍在36.5～38.3 ℃,且體溫波動不高于0.5 ℃的大鼠用于實(shí)驗(yàn)。

取10只體溫合格大鼠腹腔注射(10 mL·kg-1)生理鹽水,作為空白組,其余大鼠等體積腹腔注射由生理鹽水現(xiàn)配的LPS溶液(100 μg·kg-1)建立發(fā)熱模型。造模5.5 h后選擇發(fā)熱幅度>1 ℃的大鼠,隨機(jī)分為模型組、阿司匹林組、水牛角SHF低劑量組、水牛角SHF中劑量組、水牛角SHF高劑量組、水牛角水提液組,分組后立即灌胃給藥(10 mL·kg-1)。水牛角SHF低、中、高劑量組分別按合生藥量0.312 5、0.625、1.25 g·kg-1的劑量給予用0.5%CMC-Na溶液配制的水牛角SHF混懸液(按人每日臨床劑量合生藥量0.05、0.1、0.2 g·kg-1折算);阿司匹林組按100 mg·kg-1給予阿司匹林腸溶片混懸液(按人每日臨床劑量0.016 g·kg-1折算);水牛角水提液組按合生藥量3.125 g·kg-1給予水牛角水提液(按人每日臨床劑量0.5 g·kg-1折算);空白組和模型組同時(shí)灌胃等體積0.5% CMC-Na溶液。給藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3.5、4.5 h測量體溫,計(jì)算各組大鼠在各測溫點(diǎn)的體溫增減值(ΔT,實(shí)測體溫值-基礎(chǔ)體溫值),分析解熱效果。

2.5 樣本采集

按照“2.4“項(xiàng)下方法另取一批大鼠分組,各組大鼠灌胃1 h后,腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液(mg·kg-1)麻醉,經(jīng)腹主動脈取血,采用肝素鈉采血管進(jìn)行血液收集,4 ℃,3 000 r·min-1,離心10 min,取上清,得血漿,-80 ℃下冷凍保存。隨后于冰上迅速取出全腦,分離下丘腦組織至液氮速凍,轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存待測。

2.6 血漿及下丘腦炎癥介質(zhì)的測定

按照ELISA試劑盒說明書測定采集的大鼠血漿中PGE2、IL-1β、TNF-α的含量,測定下丘腦組織中cAMP、PGE2、TNF-α的含量。

2.7 血漿非靶向代謝組學(xué)分析

樣品處理:將“2.5”項(xiàng)下凍存的血漿樣本置冰上解凍,每100 μL血漿加入300 μL冷乙腈沉淀蛋白,渦旋混勻1 min,于4 ℃靜置30 min后,4 ℃,13 000 r·min-1離心15 min,取上清注入Waters Xevo G2-XS QTof分析。

LC-MS條件:色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);正離子模式下流動相為0.1%甲酸水(A)-含0.1%甲酸乙腈(B),負(fù)離子模式下流動相為5 mmol·L-1甲酸銨水(A)-乙腈(B);梯度洗脫條件:0～2 min,5%B;2～13 min,5%～95%B;13～16 min,95%B;16～16.5 min,95%～5%B;16.5～18 min,5%B;柱溫40 ℃,進(jìn)樣量2 μL,流速0.35 mL·min-1。采用ESI離子源正、負(fù)離子模式(ESI+/ESl-),質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 000;毛細(xì)管電壓、錐孔電壓分別為3.0 kV和30 V;萃取電壓:2.0 V;離子源溫度120 ℃,脫溶劑氣溫度為350 ℃;錐孔氣流量:50 L·h-1;碰撞能量:20～50 eV,準(zhǔn)確質(zhì)量測定采用亮氨酸-腦啡肽(ESI+:556.277 1m/z,ESI-:554.261 5m/z)溶液為鎖定質(zhì)量溶液[9]。

數(shù)據(jù)處理和多元分析:采用Progenesis QI(V2.4)進(jìn)行峰對比、拾取、噪聲去除、重疊峰解析、標(biāo)準(zhǔn)化、歸一化等處理,分別輸出正、負(fù)離子模式下由保留時(shí)間、質(zhì)荷比值(m/z)和每個(gè)峰值區(qū)域的歸一化峰面積的數(shù)據(jù)列表,導(dǎo)入SIMCA P 14.1進(jìn)行無監(jiān)督主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。通過OPLS-DA中R2Y(Y的累積模型變化)和Q2(累積的預(yù)測變化)2個(gè)關(guān)鍵參數(shù)評價(jià)模型的可靠性,當(dāng)參數(shù)越接近1.0時(shí),則模型預(yù)測可靠性越高,通過200次置換檢驗(yàn)驗(yàn)證模型是否過擬合[10]。選取VIP>1作為潛在差異代謝物,采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,利用t檢驗(yàn)與非參數(shù)檢驗(yàn)等分析方法檢驗(yàn)2組間生物標(biāo)志物的相對峰面積是否具有顯著性差異,以P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義篩選得到差異代謝物。使用HMDB(https://hmdb.ca/)數(shù)據(jù)庫及MetaboAnalyst(https://www.metaboanalyst.ca/)進(jìn)行生物標(biāo)志物鑒定和代謝通路分析[11]。

2.8 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 水牛角水提液及SHF中蛋白和游離-SH的含量

水牛角水提液及SHF中蛋白和游離-SH的含量測定結(jié)果如表1所示,水牛角水提液中游離-SH濃度與蛋白濃度的比值為0.025 mmol·g-1,水牛角SHF中游離-SH濃度與蛋白濃度的比值為0.491 mmol·g-1,約為水牛角水提液的20倍,表明SDS-DTT聯(lián)合提取法制備的水牛角SHF的-SH水平顯著提高,與前期研究采用Thiopropyl Sepharose 6B制備的活性部位-SH水平相當(dāng)[1]。

表1 水牛角水提液和SHF中蛋白和游離-SH含量Table 1 Protein and free -SH levels in extract of Bubali

3.2 基于nano LC-MS/MS技術(shù)表征水牛角SHF

基于nano LC-MS/MS技術(shù)從水牛角水提液中共鑒定到100個(gè)蛋白質(zhì)(唯一肽段數(shù)≥2),其中角蛋白和角蛋白相關(guān)蛋白占總蛋白數(shù)量的20%,分別為8個(gè)Ⅰ型角蛋白、8個(gè)Ⅱ型角蛋白和4個(gè)角蛋白相關(guān)蛋白;從水牛角SHF中共鑒定到19個(gè)蛋白質(zhì)(唯一肽段數(shù)≥2),其中角蛋白、角蛋白相關(guān)蛋白及高硫化角蛋白占總蛋白數(shù)量的52.63%,分別是3個(gè)Ⅰ型角蛋白、4個(gè)Ⅱ型角蛋白、2個(gè)角蛋白相關(guān)蛋白和1個(gè)高硫化角蛋白。肽類成分分析結(jié)果表明,水牛角水提液共鑒定到1 822條肽段,其中含-SH肽段為1條,來源于Ⅱ型角蛋白;水牛角SHF中共鑒定到211條肽段,其中含-SH肽段為62條,有21條來源于Ⅰ型角蛋白,30條來源于Ⅱ型角蛋白,3條來源于角蛋白相關(guān)蛋白,4條來源于高硫化角蛋白,1條來源于橋粒糖蛋白。結(jié)果如圖1、表2所示,水牛角SHF中角蛋白占總蛋白數(shù)的比例大于水牛角水提液,且含-SH肽段數(shù)明顯多于水牛角水提液,亦表明通過SDS-DTT聯(lián)合提取法可有效獲得水牛角含-SH類物質(zhì)。

圖1 水牛角SHF和水提液的蛋白質(zhì)種類Fig.1 Protein types in extract of Bubali Cornu

表2 水牛角SHF的蛋白信息Table 2 Protein information for SHF in Bubali Cornu

3.3 水牛角SHF對LPS致發(fā)熱大鼠體溫的影響

結(jié)果如表3所示,與空白組相比,模型組與給藥組大鼠造模5.5 h后,平均體溫升高1 ℃以上,表明造模成功;與模型組相比,水牛角SHF中劑量與高劑量組在給藥0.5 h后,體溫下降明顯(P<0.05),水牛角SHF低劑量組在給藥1 h后體溫顯著下降(P<0.001),且與水牛角水提液組降溫效果相當(dāng),表明水牛角SHF具有良好的解熱作用。

表3 各組大鼠體溫變化Table 3 Changes in body temperature of rats in each

3.4 水牛角SHF對發(fā)熱大鼠血漿及下丘腦組織炎癥因子水平的影響

血漿及下丘腦組織中炎癥因子的水平如圖2所示。結(jié)果表明,與空白組相比,模型組血漿中PGE2、IL-1β、TNF-α的水平及下丘腦組織中cAMP、PGE2、TNF-α的水平均顯著升高(P<0.001);與模型組相比,水牛角SHF能顯著降低血漿中PGE2、IL-1β、TNF-α的水平(P<0.05),顯著降低下丘腦cAMP、PGE2、TNF-α的水平(P<0.01),表明水牛角SHF發(fā)揮解熱作用的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)大鼠IL-1β、TNF-α、cAMP、PGE2等細(xì)胞因子有關(guān)。

注:與空白組相比,###P<0.001;與模型組相比,

3.5 血漿代謝組學(xué)分析

3.5.1 UPLC-Q-TOF-MS數(shù)據(jù)的多元統(tǒng)計(jì)分析 通過PCA和OPLS-DA分析,繪制樣品得分散點(diǎn)圖,結(jié)果如圖3所示。在正、負(fù)離子模式的PCA分析下,空白組、模型組和水牛角SHF組之間明顯分離,表明各組血漿樣本間代謝圖譜存在明顯差異。在OPLS-DA評分圖中,空白組和模型組區(qū)分明顯,在正離子模式下,R2Y=0.996,Q2=0.971;在負(fù)離子模式下,R2Y=0.992,Q2=0.978;200次置換檢驗(yàn)結(jié)果顯示Q2點(diǎn)的回歸線在縱坐標(biāo)的交叉點(diǎn)小于0,表明模型沒有過擬合且對2組之間的差異具有良好的預(yù)測。

注:C.空白組;M.模型組;S.水牛角SHF組;A1, B1.PCA分析得分圖;A2, B2.OPLS-DA圖;A3, B3.OPLS-DA模型置換檢驗(yàn)圖

3.5.2 差異代謝物鑒定 在OPLS-DA分析下,根據(jù)VIP>1且2組間具有顯著性差異(P<0.05)來篩選差異代謝物。根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù),在HMDB數(shù)據(jù)庫中共鑒定出137種潛在生物標(biāo)志物,具體信息如表4所示。水牛角SHF給藥后可顯著回調(diào)其中的23個(gè)代謝物,具有顯著性差異(P<0.05)的有16個(gè),主要包括溶血磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、甘油三酯、磷脂酰膽堿等。

表4 潛在差異代謝物Table 4 Potential differential metabolites

(續(xù)表)

3.5.3 代謝通路分析 將上述差異代謝物導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0在線分析數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路富集分析,如圖4所示,得到14條與發(fā)熱相關(guān)的代謝通路,以及水牛角SHF發(fā)揮解熱作用的10條代謝通路,以Pathway impact>0.1為標(biāo)準(zhǔn)篩選關(guān)鍵代謝通路[11],結(jié)果表明甘油磷脂代謝通路為水牛角SHF發(fā)揮解熱作用的主要代謝途徑。

4 討論

水牛角作為傳統(tǒng)的角類動物藥,解熱功效確切,而課題組前期研究及前人報(bào)道均表明水牛角發(fā)揮解熱、抗炎等功效,與其所含的角蛋白類成分中的-SH及-S-S-有關(guān)[1,12]。因此本文采用SDS-DTT聯(lián)合提取法制備了水牛角中主要的角蛋白類成分,通過nano LC-MS/MS技術(shù)鑒定得到這些角蛋白類成分主要包括I型角蛋白、Ⅱ型角蛋白、角蛋白相關(guān)蛋白和高硫化角蛋白,并且含-SH肽段主要來源于提取的角蛋白類成分。制備的水牛角SHF的-SH水平較水牛角水提液提高了約20倍,提示該方法能有效制得水牛角SHF。

本文研究表明,水牛角SHF對LPS引起的大鼠發(fā)熱具有顯著的抑制作用,且水牛角SHF低劑量(0.312 5 g·kg-1)在給藥1 h后即可表現(xiàn)出顯著的解熱作用,顯著低于課題組前期研究的水牛角粉或提取物的解熱有效劑量(2.75g生藥/kg)[13]。然而本文研究的SHF解熱作用的劑量依賴性不明顯,提示我們進(jìn)一步降低SHF劑量仍應(yīng)有解熱作用,有待后續(xù)進(jìn)一步研究,以明確水牛角SHF的解熱量效關(guān)系[14]。本文水提液發(fā)揮解熱功效的劑量為3.125 g·kg-1,水牛角SHF的給藥劑量僅為水提液的1/10時(shí)即可顯現(xiàn)出與其相當(dāng)?shù)慕鉄嶙饔?這為角類動物藥功效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),同時(shí)也為類效資源尋找與替代提供一定參考。

引起人體發(fā)熱的熱源包括外源性致熱源和內(nèi)源性致熱源,其中內(nèi)源性致熱源,如IL-1β、TNF-α等一方面可以通過交感神經(jīng)使皮膚血管和豎毛肌收縮,減少散熱,增加產(chǎn)熱從而引起發(fā)熱[15];另一方面還可以通過刺激血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞,向中樞釋放PGE2、cAMP等物質(zhì),間接作用于下丘腦,引起發(fā)熱[16-17]。本文研究提示,水牛角SHF可以顯著降低炎性發(fā)熱大鼠血漿中PGE2、IL-1β、TNF-α以及下丘腦組織中cAMP、PGE2、TNF-α的水平,從而發(fā)揮解熱作用。

代謝組學(xué)研究表明,水牛角SHF主要通過回調(diào)甘油磷脂類、甘油酯類以及鞘脂類等代謝物發(fā)揮解熱作用。其中,甘油磷脂途徑的代謝產(chǎn)物,如磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇等可以通過維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性來抵抗外界刺激,緩解細(xì)胞損傷[18];富含甘油三酯的脂蛋白生化組成可能是介導(dǎo)炎癥的重要因素,細(xì)胞因子如IL-1β、TNF-α的釋放取決于甘油三酯、膽固醇和磷脂的百分比[19];鞘磷脂是細(xì)胞膜重要的結(jié)構(gòu)成分,有研究表明膳食神經(jīng)節(jié)苷脂可降低LPS誘導(dǎo)后血清中IL-1β和TNF-α的水平[20]。此外,KEGG通路富集分析結(jié)果表明水牛角SHF主要通過甘油磷脂代謝途徑,調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,抑制LPS引起的發(fā)熱從而發(fā)揮清熱的傳統(tǒng)功效。

綜上所述,本研究通過SDS-DTT聯(lián)合提取法制備的水牛角SHF,具有顯著的解熱、抗炎作用,進(jìn)一步驗(yàn)證含-SH類成分為水牛角發(fā)揮清熱功效的重要物質(zhì)基礎(chǔ),且水牛角SHF的解熱有效劑量顯著低于臨床規(guī)定用量,提示我們水牛角SHF在新藥創(chuàng)制、珍稀角類動物藥類效資源尋找與發(fā)現(xiàn)等研究領(lǐng)域具有良好的潛在應(yīng)用價(jià)值。在此基礎(chǔ)上,后續(xù)有必要進(jìn)一步探討水牛角SHF在體內(nèi)的作用機(jī)制,為水牛角及其他角類動物藥的臨床應(yīng)用與開發(fā)提供確切的科學(xué)依據(jù)。