劉經(jīng)州，楊紅群，馬東旺

（1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 承德067000； 2.承德市婦幼保健院，河北 承德067000； 3.天津市人民醫(yī)院，天津 300000）

結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤類型之一，其發(fā)病率在消化道腫瘤中高居第三位，嚴(yán)重威脅人類健康和生命安全［1］。盡管手術(shù)輔以化療、免疫治療顯著提高結(jié)腸癌患者生存率，但仍存在嚴(yán)重的不良反應(yīng)和毒副作用。近年來，天然化合物在人類癌癥防治中的作用受到特別關(guān)注。原兒茶酸是一種廣泛存在的天然酚酸，具有抗氧化、抗炎、抗高血糖、抗纖維化以及心血管和神經(jīng)保護(hù)活性［2?3］。研究顯示，原兒茶酸顯著抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，并抑制二乙基亞硝胺／苯巴比妥誘發(fā)的小鼠肝細(xì)胞癌形成［4?5］。但其在結(jié)腸癌中的抗腫瘤機(jī)制并未完全闡明。長非編碼RNA（lncRNAs）是由200多個核苷酸組成的RNA 轉(zhuǎn)錄本，其通過轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、基因組印跡等參與調(diào)節(jié)多種人類惡性腫瘤的生理和病理過程，是癌癥治療的潛在靶點(diǎn)［6?7］。研究顯示，lncRNA心肌素基因（MYOSLID）在骨肉瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)增加，干擾MYOSLID可降低細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力［8?9］。然而MYOSLID在結(jié)腸癌中的抗腫瘤作用鮮有研究。糖酵解代謝活躍、過度增殖是腫瘤細(xì)胞的重要特征，本研究擬從糖酵解、增殖角度研究原兒茶酸、MYOSLID在結(jié)腸癌中的抗腫瘤作用，探討其潛在分子機(jī)制，以期為原兒茶酸用于防治結(jié)腸癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織來源 收集2018 年1 月至2019 年1 月于承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織樣本及癌旁組織樣本（距離腫瘤邊緣5 cm 處癌旁黏膜組織）共41 對，男23例，女18 例，所有患者術(shù)前未接受放療、化療或免疫治療等輔助治療。該研究獲得承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)和患者知情同意（2018000421）。

1.2 細(xì)胞 人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。

1.3 藥物和試劑 原兒茶酸（純度≥98%，生產(chǎn)批號809?201603）購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；小干擾RNA 序列片段（si?RNA）、質(zhì)粒（pcDNA）購于廣州復(fù)能基因有限公司；TRIzol 試劑、乳酸檢測試劑盒、葡萄糖檢測試劑盒、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK?8）購自北京索萊寶生物科技有限公司；第一鏈cDNA 合成試劑盒、SYBR Green PCR 試劑盒購于大連寶生物工程有限公司；羊抗兔IgG 二抗（7074）、兔源細(xì)胞周期素D1（CyclinD1）（55506）、p21（2947）、甘油醛?3?磷酸脫氫酶（GAPDH）（5174）單克隆抗體購于上海賽信通生物試劑有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 SW620 細(xì)胞采用補(bǔ)充10% 胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞70%融合時(shí)，胰酶消化，按照1 ∶3 比例稀釋，將細(xì)胞接種于新的培養(yǎng)瓶中，每2 d 換液1次，取對數(shù)期SW620 細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用原兒茶酸終濃度分別為0、5、10、20 μmol／L 的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞48 h，分別命名為對照組、原兒茶酸低濃度組、原兒茶酸中濃度組和原兒茶酸高濃度組。為探討原兒茶酸的抗腫瘤作用和MYOSLID關(guān)系，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將si?NC、si?MYOSLID分別轉(zhuǎn)染SW620 細(xì)胞，分別命名為si?NC 組、si?MYOSLID組；將pcDNA、pcDNA?MYOSLID 分別轉(zhuǎn)染SW620 細(xì)胞，用原兒茶酸終濃度20 μmol／L 的培養(yǎng)液處理轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞48 h，分別命名為原兒茶酸＋pcDNA 組、原兒茶酸＋pcDNA?MYOSLID 組。

2.2 葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生水平檢測 采用乳酸檢測試劑盒、葡萄糖檢測試劑盒，收集細(xì)胞培養(yǎng)基，3 000 r／min 離心獲得上清液。按照試劑盒說明書步驟，測定各組細(xì)胞的乳酸產(chǎn)量以及葡萄糖消耗量。

2.3 細(xì)胞活力檢測 采用CCK?8 法。將未轉(zhuǎn)染的SW620細(xì)胞接種96 孔板，貼壁后用含5、10、20 μmol／L 原兒茶酸［8］的培養(yǎng)液（每孔100 μL）孵育48 h；將轉(zhuǎn)染si?NC 或轉(zhuǎn)染si?MYOSLID 的SW620 細(xì)胞接種96 孔板，培養(yǎng)48 h。將轉(zhuǎn)染pcDNA 或pcDNA?MYOSLID 的SW620 細(xì)胞接種96孔板，貼壁后用含20 μmol／L 原兒茶酸的培養(yǎng)液（每孔100 μL）孵育48 h，設(shè)置3 個復(fù)孔。每孔加入10 μL 的CCK?8 溶液，再培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀在450 nm 處測量OD。增殖抑制率＝（1－OD實(shí)驗(yàn)組／OD對照組）×100%。

2.4 細(xì)胞克隆形成能力檢測 采用集落形成實(shí)驗(yàn)檢測。各組取2 mL 細(xì)胞懸液（約5×102個細(xì)胞）接種到96 孔板中，米字型晃動平板使細(xì)胞分散均勻。約培養(yǎng)14 d 時(shí)，用甲醇固定集落，用0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)算大于50 個細(xì)胞的集落數(shù)。

2.5 lncRNA MYOSLID 表達(dá)檢測 采用RT?PCR 法。TRIzol 試劑提取細(xì)胞總RNA 后。采用第一鏈cDNA 合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用SYBR Green PCR 試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)RT?qPCR。GAPDH 作 為MYOSLID的內(nèi)源 性對照，MYOSLID表達(dá)水平以2－△△Ct公式計(jì)算。MYOSLID正向5′?AAGAGGGAGTGGGAGTTAGGC?3′，正向 5′?CACTGTGGT GGGATCTGCAAG?3′；GAPDH正向 5′?TGATGACCCTTTT GGCTCCC?3′，反向5′?GAAGCTTGTCATCAA TGGAAAT?3′。

2.6 CyclinD1 和p21 蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot 法。

放射免疫測定（RIPA）緩沖液冰上裂解細(xì)胞30 min，離心收集上清液并測定蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，并恒流轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜。4 ℃下用5%脫脂奶粉將膜封閉12 h。棄去封閉液，室溫下加入特異性一抗溶液（1 ∶1 000）孵育膜2 h。隨后將膜與相應(yīng)二抗（1 ∶1 000）室溫下孵育2 h。洗膜后，加入顯影劑暗室反應(yīng)15 min，以GAPDH 為內(nèi)參，使用Quantity One軟件對蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行定量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（）表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組差異，采用單因素方差分析和SNK?q 檢驗(yàn)比較多組間差異。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 原兒茶酸對結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞糖酵解的影響 與對照組比較，原兒茶酸低、中、高濃度組SW620 細(xì)胞葡萄糖消耗量、乳酸產(chǎn)生量降低（P＜0.05），且表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。見表1。

表1 原兒茶酸對結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞糖酵解的影響（，n＝9）

表1 原兒茶酸對結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞糖酵解的影響（，n＝9）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與原兒茶酸低濃度組比較，＃P＜0.05；與原兒茶酸中濃度組比較，＆P＜0.05。

3.2 原兒茶酸對結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞增殖的影響 與對照組比較，原兒茶酸低、中、高濃度組SW620 細(xì)胞增殖抑制率、p21 蛋白表達(dá)升高，克隆形成數(shù)、CyclinD1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），且表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。見表2、圖1。

表2 原兒茶酸對結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞增殖的影響（， n＝9）

表2 原兒茶酸對結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞增殖的影響（， n＝9）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與原兒茶酸低濃度組比較，＃P＜0.05；與原兒茶酸中濃度組比較，＆P＜0.05。

圖1 原兒茶酸對結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞增殖的影響

3.3 lncRNAMYOSLID在結(jié)腸癌組織中的表達(dá) lncRNAMYOSLID在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)較癌旁組織升高（P＜0.01）。見表3。

表3 lncRNA MYOSLID 在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)（，n＝3）

表3 lncRNA MYOSLID 在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)（，n＝3）

注：與癌旁組織比較，**P＜0.01。

3.4 原兒茶酸對結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞中l(wèi)ncRNAMYOSLID表達(dá)的影響 與對照組比較，原兒茶酸低、中、高濃度組SW620 細(xì)胞lncRNAMYOSLID的表達(dá)降低（P＜0.05），且表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。見表4。

表4 原兒茶酸對結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MYOSLID表達(dá)的影響（， n＝9）

表4 原兒茶酸對結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MYOSLID表達(dá)的影響（， n＝9）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與原兒茶酸低濃度組比較，＃P＜0.05；與原兒茶酸中濃度組比較，＆P＜0.05。

3.5 干擾lncRNAMYOSLID表達(dá)對結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞糖酵解和增殖的影響 與si?NC 組比較，si?MYOSLID 組SW620細(xì)胞lncRNAMYOSLID表達(dá)降低，葡糖糖消耗量、乳酸產(chǎn)生量、克隆形成數(shù)、以及CyclinD1 蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞增殖抑制率、p21 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。見表5、圖2。

圖2 干擾lncRNA MYOSLID 表達(dá)對結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞增殖的影響

表5 干擾lncRNA MYOSLID 表達(dá)對結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞糖酵解和增殖的影響（， n＝9）

表5 干擾lncRNA MYOSLID 表達(dá)對結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞糖酵解和增殖的影響（， n＝9）

注：與si?NC 組比較，**P＜0.01。

3.6 lncRNAMYOSLID過表達(dá)逆轉(zhuǎn)原兒茶酸（20 μmol／L）對結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞糖酵解和增殖的作用與原兒茶酸＋pcDNA 組比較，原兒茶酸＋pcDNA?MYOSLID 組SW620 細(xì)胞lncRNAMYOSLID表達(dá)顯著升高，葡糖糖消耗量、乳酸產(chǎn)生量、克隆形成數(shù)以及CyclinD1 蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞增殖抑制率、p21 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。見表6、圖3。

表6 lncRNA MYOSLID 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了原兒茶酸對結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞糖酵解和增殖的作用（， n＝9）

表6 lncRNA MYOSLID 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了原兒茶酸對結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞糖酵解和增殖的作用（， n＝9）

注：與原兒茶酸＋pcDNA 組比較，**P＜0.01。

圖3 lncRNA MYOSLID 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了原兒茶酸對結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞增殖的作用

4 討論

原兒茶酸存在于許多水果和蔬菜中，具有多種生物活性。Owumi 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，原兒茶酸通過升高大鼠肝臟和腎臟中抗氧化酶活性、抑制脂質(zhì)過氧化、拮抗細(xì)胞凋亡機(jī)制保護(hù)抗癌藥甲氨蝶呤誘導(dǎo)的肝腎毒性。Tsao 等［11］研究表明原兒茶酸以劑量依賴方式抑制肺癌細(xì)胞生長、降低線粒體膜電位和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，原兒茶酸通過抑制核因子κB（NF?κB）激活、下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP?2）表達(dá)進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲，抑制小鼠中黑色素瘤細(xì)胞的肝轉(zhuǎn)移［12］。以上研究表明，原兒茶酸具有防治人類癌癥的巨大潛力。糖酵解是癌細(xì)胞的重要生化特征之一，糖酵解不僅為腫瘤細(xì)胞提供充足的能量，而且為腫瘤細(xì)胞的快速增殖提供大量的生物合成原料，抑制糖酵解反應(yīng)可抑制結(jié)腸癌進(jìn)程［13］。CyclinD1 是G1到S 周期轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵介質(zhì)，其上調(diào)導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞的快速生長，而p21 則通過抑制G1到S 期轉(zhuǎn)換具有抗增殖作用［14?15］。本研究發(fā)現(xiàn)，原兒茶酸以劑量依賴方式抑制葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生，抑制細(xì)胞增殖、克隆形成和CyclinD1 表達(dá)，促進(jìn)p21 表達(dá)。提示，原兒茶酸通過抑制SW620 細(xì)胞增殖和糖酵解反應(yīng)在結(jié)腸癌癌中具有抗腫瘤作用。

lncRNA 參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、周期分布、凋亡、遷移侵襲、糖酵解代謝等多個生物學(xué)過程，是人類癌癥進(jìn)展的重要調(diào)節(jié)劑［16?17］。lncRNAMYOSLID在胃癌組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤大小，腫瘤分期、浸潤深度和生存時(shí)間相關(guān)，干擾MYOSLID表達(dá)可誘導(dǎo)凋亡和生長停滯，抑制裸鼠移植瘤形成［18］。此外，MYOSLID高表達(dá)可預(yù)測骨肉瘤患者預(yù)后不良，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移［8］。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中MYOSLID表達(dá)水平顯著升高，轉(zhuǎn)染si?MYOSLID 干擾MYOSLID表達(dá)可降低SW620 細(xì)胞克隆形成能力，降低Cyclin D1 表達(dá)，提高p21 表達(dá)，降低乳酸消耗和葡萄糖產(chǎn)生量，這提示干擾MYOSLID 表達(dá)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和糖酵解反應(yīng)。原兒茶酸處理后MYOSLID表達(dá)以劑量依賴方式降低，提示原兒茶酸的抗腫瘤作用可能與調(diào)節(jié)MYOSLID表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步研究證實(shí)，過表達(dá)MYOSLID降低了原兒茶酸對SW620 細(xì)胞增殖、克隆形成和糖酵解的抑制作用，恢復(fù)細(xì)胞增殖、糖酵解以及Cyclin D1 和p21 表達(dá)。提示，原兒茶酸通過下調(diào)MYOSLID在結(jié)腸中發(fā)揮抗腫瘤作用。

總之，原兒茶酸通過抑制SW620 細(xì)胞增殖和糖酵解反應(yīng)在結(jié)腸癌中具有抗腫瘤作用，其機(jī)制與下調(diào)MYOSLID表達(dá)有關(guān)，為原兒茶酸在結(jié)腸癌防治中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。