孫靚楠，紅 雨，2，3，王伶瑞，薛轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)，吳艷玲，2

（1.內(nèi)蒙古師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010022；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校蒙古高原生物多樣性保護(hù)與可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010022；3.無窮維哈密頓系統(tǒng)及其算法應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010022）

土壤線蟲是一類較低等的異養(yǎng)多細(xì)胞真核生物［1］，是土壤動物中物種多樣性最高的一類，也是土壤食物網(wǎng)的重要組成部分［2］。土壤線蟲可依據(jù)生活方式和頭部形態(tài)學(xué)特征將其劃分為4 種營養(yǎng)類群，分別為食細(xì)菌類線蟲（BF）、食真菌類線蟲（FF）、植食類線蟲（PP）以及捕食-雜食類線蟲（OP）［3］。土壤線蟲通過與其他土壤動物的相互作用參與到復(fù)雜的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中，占據(jù)土壤食物網(wǎng)中的大多數(shù)重要位置，在有機(jī)質(zhì)分解、養(yǎng)分循環(huán)和能量傳遞等關(guān)鍵生態(tài)過程中發(fā)揮重要作用［4］。土壤線蟲群落的生態(tài)功能是指土壤線蟲與非生物環(huán)境的相互關(guān)系以及在環(huán)境多因子驅(qū)動下的物質(zhì)轉(zhuǎn)換等生態(tài)過程［5］。研究表明，土壤線蟲通過促進(jìn)植物與土壤間的負(fù)反饋、改變根際微生物群落和促進(jìn)養(yǎng)分循環(huán)而影響植物生長［6］。作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要指示生物之一，土壤線蟲能迅速響應(yīng)土壤環(huán)境變化［7］，因此以線蟲為基礎(chǔ)的生態(tài)指標(biāo)可以較為準(zhǔn)確地反映土壤生態(tài)功能的變化，為土壤健康的評估提供參考［8］。

生物炭是利用農(nóng)業(yè)廢棄物在低氧或缺氧條件下，經(jīng)高溫（<700 ℃）熱解形成的一類高度芳香化的富含碳質(zhì)的難溶性固體物質(zhì)［9］，用于廢物處理、減緩氣候變化、提高土壤肥力、生物能源生產(chǎn)和污染物修復(fù)等一系列應(yīng)用［10］。生物炭可以從各種各樣的廢棄生物質(zhì)中產(chǎn)生［11］，這使得廢物處理成為可能，生物炭可以通過提高土壤肥力和植物生產(chǎn)力實(shí)現(xiàn)糧食安全管理，通過固碳和最大限度減少溫室氣體排放減緩氣候變化，并修復(fù)土壤、水和空氣中的污染物，廣泛的適用性表明生物炭在全球可持續(xù)發(fā)展中可以發(fā)揮關(guān)鍵作用［12-13］。生物炭還在作物可持續(xù)生產(chǎn)過程中扮演著重要角色，具有調(diào)節(jié)土壤理化特性與生物群落等作用［14］。牛亞茹［15］研究表明，生物炭改變了土壤線蟲群落結(jié)構(gòu)，適量生物炭能夠使食細(xì)菌類線蟲增加，短期內(nèi)施加生物炭對土壤線蟲的群落多樣性和穩(wěn)定性均沒有顯著影響。隨著我國對農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展的重視程度逐步增加，以線蟲生態(tài)指標(biāo)為主的土壤健康評價受到更多關(guān)注，并將其用于指導(dǎo)田間施肥措施的優(yōu)化［16］。本試驗(yàn)采用生物炭改良高粱根際土壤，通過研究施加不同含量生物炭對土壤線蟲群落的影響，進(jìn)一步探討施加不同含量生物炭對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究樣地位于內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市達(dá)拉特旗昭君鎮(zhèn)（圖1），地處內(nèi)蒙古自治區(qū)西南部，屬于溫帶大陸性季風(fēng)氣候，冬冷夏熱，四季分明，降水集中且年降水量較少。地下煤炭資源豐富，儲量達(dá)20 多億噸。樣地坐標(biāo)為40°25′1″N，109°35′33″E。采集鄂爾多斯市達(dá)拉特旗昭君鎮(zhèn)高粱樣地25 個樣點(diǎn)的高粱根際土壤，地塊面積約為670 m2，樣點(diǎn)分布為處理-對照間隔分布，試驗(yàn)土壤為砂質(zhì)土壤。

1.2 試驗(yàn)方案

以鄂爾多斯杭錦旗沙質(zhì)化土地和鹽堿化土壤為改良對象，以伊泰北牧田園公司種植的農(nóng)作物秸稈為生物炭原料，利用炭化技術(shù)制備生物炭。炭化后的生物炭基本保留了原有生物質(zhì)的良好孔隙結(jié)構(gòu)，具有較大的孔隙度和比表面積。2021 年4 月，生物炭施于樣地土壤表層后，與土壤耕層（0～20 cm）攪拌混勻。施用量根據(jù)盆栽實(shí)驗(yàn)所得結(jié)論設(shè)置5 個水平，分別為：對照組Z0（0 kg生物炭/hm2）、Z1（10 kg 生物炭/hm2）、Z2（30 kg 生物炭/hm2）、Z3（50 kg 生物炭/hm2）、Z4（70 kg 生物炭/hm2），采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計進(jìn)行分區(qū)小組試驗(yàn)，在2021 年4 月20 日種植高粱，高粱品種為高雜4 號和遼粘3 號，高粱生長期間除正常灌水耕種，不再添加其他影響因素。2021 年10 月，采集高粱樣地的土壤用于測定土壤化學(xué)指標(biāo)。采樣高粱根際土壤，每個分區(qū)隨機(jī)采集5 次重復(fù)；此外，去除地表板結(jié)的部分，沿根系生長的方向?qū)⒏吡桓等客诔?，輕輕抖動根系，再挑選粘有土壤的根放入滅菌離心管，置于液氮罐中，送回實(shí)驗(yàn)室在-80 ℃保存?zhèn)溆?。各重?fù)土樣共計25 份。

1.3 樣品分析

土壤理化性質(zhì)測定參考《土壤農(nóng)化分析》，土壤pH 測定用pH 計；土壤有機(jī)質(zhì)測定（OM）采用重鉻酸鉀外加熱法；土壤速效氮（AN）測定方法為堿解擴(kuò)散法；速效磷（AP）含量測定方法為0.5 mol/L NaHCO3法。凍干管中的土樣送至上海美吉生物公司，由公司進(jìn)行DNA 抽提，用1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的提取質(zhì) 量，然 后 采 用 引 物NF1F5′-GGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTT-3′和18Sr2bR5′-TACAAAGG GCAGGGACGTAAT-3′進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，Miseq 文庫構(gòu)建和測序等利用PE 300 平臺進(jìn)行測序，之后在美吉生物云平臺對土壤線蟲數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 18.0 對土壤線蟲的多樣性指數(shù)和土壤理化性質(zhì)進(jìn)行單因素方差分析，用Origin 2022 b 軟件繪圖。在上海美吉生物公司云平臺進(jìn)行在線分析，對土壤線蟲進(jìn)行OTU 水平分析并生成Venn 圖，將不同施炭量與土壤線蟲的關(guān)系生成Circos 樣本與物種關(guān)系圖，在土壤線蟲屬水平上進(jìn)行多樣性分析，基于Bray-Curtis 距離算法對土壤線蟲群落進(jìn)行PCoA 分析，對土壤理化性質(zhì)與土壤線蟲相關(guān)性進(jìn)行熱圖分析。

圖1 樣地位置Fig.1 Plot location

2 結(jié)果分析

2.1 OTU 水平相似性分析

OTU 即操作分類單元。通過一定的距離度量方法計算兩兩不同序列之間的距離量度或相似性，繼而設(shè)置特定的分類閾值，獲得同一閾值下的距離矩陣，進(jìn)行聚類操作，形成不同的分類單元。分析之前，根據(jù)序列間的相似性（通常為97%）將序列進(jìn)行聚類，分成多個分類單元，一個分類單元稱為一個OTU。然后再基于OTU 分類單元進(jìn)行物種注釋，常規(guī)方法在OTU 分類單元中選出一條代表序列，用此序列進(jìn)行物種注釋得到的結(jié)果即為整個OTU 單元的注釋結(jié)果［17-18］。

圖2 OUT 水平分布韋恩圖Fig.2 Wayne diagram of OUT horizontal distribution

通過對樣本的分析，得到OTU 水平分布韋恩圖（圖2）。由圖2 可知，Z0 組OTU 數(shù)目最高為44；Z2 組OTU 其次，數(shù)目為38；Z4 組OTU 數(shù)目為36；Z3 組OTU 數(shù)目略低于Z4 組為35；Z1 組OTU 數(shù)目最低為31。從兩處所重合的OTU 數(shù)目對比可得：Z0 組與Z3 組的線蟲群落相似性最高為31；Z0 組與Z4 組的相似性其次為29；Z0 組與Z2 組的相似性為28；Z0 組與Z1 組的相似性為27。

2.2 土壤線蟲組成分析

通過OTU 物種分類可知，該樣地內(nèi)的土壤線蟲種類共計1 門3 綱7 目23 科33 屬（圖3）。除未分類的線蟲外，食細(xì)菌類線蟲（BF）有8 種、食真菌類線蟲（FF）有3 種、植食類線蟲（PP）有12 種、捕食-雜食類線蟲（OP）有4 種。其中Z0樣地植食類線蟲占48.69%，Z1 樣地植食類線蟲占63.13%，Z2 樣地植食類線蟲占65.59%，Z3 樣地植食類線蟲占33.75%，Z4 樣地植食類線蟲占49.55%；而Z0 樣地雜食-捕食類線蟲占16.88%，Z1 樣地中雜食-捕食類線蟲占4.93%，Z2 樣地中雜食-捕食類線蟲占6.45%，Z3樣地中雜食-捕食類線蟲占12.94%，Z4 樣地中雜食-捕食類線蟲占1.63%。結(jié)果表明，隨著施炭量的增加，植食類線蟲在樣地內(nèi)的相對豐度呈單峰變化趨勢（低濃度促進(jìn)，高濃度抑制），且仍為優(yōu)勢類群，雜食-捕食類線蟲隨施炭量增加而降低。

圖3 屬水平土壤線蟲組成結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Composition structure of soil nematodes at genus level

從屬處理上可得，Z0 組線蟲種類最多，共24 屬；Z2 組線蟲種類有23 屬；Z1 組和Z4 組的線蟲種類屬數(shù)均為20；Z3 組線蟲種類數(shù)最少，為16 屬。其中Z0 組和Z2 組有3 個特有屬；Z4 組有2 個特有屬；Z1 組有1 個特有屬；Z3 組沒有特有屬。5 組共有的線蟲屬有10 屬。除未分類的線蟲外，Z0 組的優(yōu)勢屬有3 個；Z1、Z2、Z4 組的優(yōu)勢屬均有3 個且種類相同；Z3 組的優(yōu)勢屬有5 個（表1）。

Z2 組的稀有屬最多，有14 屬；Z0 組的稀有屬有12 個；Z1 組的稀有屬有10 個；Z4 組的稀有屬有10 屬；Z3 組的稀有屬最少，有7 屬，見表2。

表1 特有屬及優(yōu)勢屬Tab.1 Endemic genus and dominant genus

表2 稀有屬Tab.2 Rare genus

2.3 土壤線蟲多樣性分析

把5 組樣本進(jìn)行α多樣性分析得到多樣性指數(shù)表（表3）。由表3 可知，每個樣本群落覆蓋率高達(dá)99.7%～99.9%，說明本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有代表性。5 組樣本土壤線蟲多樣性的Shannon 指數(shù)排序?yàn)閆4

表3 土壤線蟲多樣性指數(shù)Tab.3 Diversity index of soil nematode

PCoA 主坐標(biāo)分析如圖4 所示。由圖4 可知，前兩個主成分累積貢獻(xiàn)率分別為28.85% 和16.58%。Z1 組樣本點(diǎn)距離最近，說明該組重復(fù)性強(qiáng)，Z4 組樣本點(diǎn)距離最遠(yuǎn)，說明該組重復(fù)性弱。5 個樣本間的差異性不顯著。

2.4 土壤理化性質(zhì)分析

土壤pH 值5 個樣地差異均不顯著，由大到小順序?yàn)閆1>Z0=Z4>Z2>Z3（圖5）。在不同樣地土壤理化性質(zhì)中（圖6），有機(jī)質(zhì)含量Z4 樣地最高為27.053 g/kg，Z0 樣地最低 為7.155 g/kg，Z4 樣地顯 著高于其 他4 個樣地（P<0.05），Z2 樣地顯著高于Z0、Z1 和Z3 樣地（P<0.05），Z3樣地顯著高于Z0 樣地，與Z1 樣地差異不顯著（P>0.05），Z0 樣地與Z1 樣地?zé)o顯著差異（P>0.05）；速效磷含量Z1樣地顯著高于Z0、Z3 樣地（P<0.05），其余4 個樣地差異均不顯著（P>0.05）；速效氮含量5 個樣地均無顯著差異。

2.5 土壤理化性質(zhì)與土壤線蟲關(guān)聯(lián)分析

Pearson 相關(guān)性系數(shù)是度量兩組數(shù)據(jù)相關(guān)性程度的值，數(shù)值小于0 呈負(fù)相關(guān)，大于0 正相關(guān)，等于0 不相關(guān)。熱圖是用顏色來更直觀，明顯的展現(xiàn)數(shù)據(jù)。由土壤理化性質(zhì)與土壤相關(guān)性熱圖（圖7）可知，AN 的含量與Leptonchus細(xì)齒屬（FF）及Cylindrolaimus筒咽屬（BF）兩屬呈顯著正相關(guān)（P<0.05）；pH 與Campydora獨(dú)壁齒屬（OP）呈顯著負(fù)相關(guān)，與Cylindrolaimus筒咽屬（BF）呈極其顯著正相關(guān)；OM 含量與Ecumenicus遍居屬（OP）呈極其顯著負(fù)相關(guān)，與Miculenchus米 卡 墊 刃 線 蟲 屬（PP）、Funaria_f ＿Leptonchidae 及 unclassified_o ＿ Dorylaimida 未 分 類 的矛線目（PP）三屬呈顯著負(fù)相關(guān)；AP 含量與Eumonhystera真單宮屬（BF）呈顯著負(fù)相關(guān)，與Thada薩達(dá)屬（PP）呈顯著正相關(guān)，與Telotylenchus端墊刃屬（PP）呈極其顯著正相關(guān)。在4 個土壤理化性質(zhì)指標(biāo)中OM 含量對土壤線蟲群落影響較大，AN 含量其次，AP 含量和pH 對土壤線蟲群落的影響較小。

圖4 PCoA 分析圖Fig.4 The diagram of PCoA analysis

圖5 不同樣地土壤pHFig.5 The soil pH in different plots

3 討論

圖6 不同樣地土壤理化性質(zhì)Fig.6 The soil physical and chemical properties in different plots

3.1 不同施炭量對土壤線蟲生物多樣性的影響

在農(nóng)田管理措施中，耕作、灌溉以及施肥等人為因素都能改變土壤肥力及土壤微生物特性，從而影響土壤線蟲群落［19］。其中施肥不僅會通過改變土壤理化性質(zhì)來影響土壤線蟲群落組成，還會通過改變土壤微生物、植物等生物因子來影響土壤線蟲［20］。

本文在5 個樣地共檢測出了33 個屬的土壤線蟲，其中未添加生物炭的對照組Z0 樣地Shannon 指數(shù)，Ace 指數(shù)及Chao1 指數(shù)最高；添加了50 kg 生物炭/hm2的Z3 樣地Ace 指數(shù)及Chao1 指數(shù)最低、添加了70 kg生 物 炭/hm2的Z4 樣 地Shannon 指 數(shù) 最 高，Simpson指數(shù)最低。說明土壤線蟲群落多樣性隨生物炭施放量增加而降低。

植食類線蟲作為土壤線蟲中的優(yōu)勢類群，隨著生物炭施炭量的增加呈單峰模式變化，即低濃度促進(jìn)，高濃度抑制。這可能是因?yàn)檫m量的施加生物炭增加了植物生物量，形成了更多的取食位點(diǎn)，有利于植食類線蟲的取食與繁衍，進(jìn)而增加其相對豐度［21］。葉成龍等［19］研究發(fā)現(xiàn)施用有機(jī)肥能增加土壤植食類線蟲的相對豐度，與本研究結(jié)果一致。雜食-捕食類線蟲一般被看作是決定土壤食物網(wǎng)復(fù)雜程度的關(guān)鍵生物類群［22］，對環(huán)境變化敏感［23］，隨施炭量增加雜食-捕食類線蟲在各樣地線蟲群落中的相對豐度減小，說明群落結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。

圖7 不同樣地土壤理化性質(zhì)與土壤相關(guān)性熱圖Fig.7 The heat map of correlation between soil physical and chemical properties and soils of different plots

3.2 土壤理化性質(zhì)對土壤線蟲群落的影響

土壤理化性質(zhì)的變化會影響土壤線蟲群落結(jié)構(gòu)［24］，本文通過Pearson 相關(guān)性系數(shù)分析，得出土壤有機(jī)質(zhì)（OM）是影響土壤線蟲群落最主要的環(huán)境因子，這與楊濤等［25］的研究結(jié)果一致。其他研究結(jié)果表明，土壤線蟲含量與土壤有機(jī)質(zhì)的分解和土壤物質(zhì)循環(huán)密切相關(guān)［26］。施加生物炭量增加導(dǎo)致土壤有機(jī)質(zhì)（OM）含量增高，線蟲群落的食物來源更加豐富，促進(jìn)了食物網(wǎng)的結(jié)構(gòu)化，使其更加復(fù)雜。代江慧等［27］認(rèn)為pH 對土壤細(xì)菌多樣性和結(jié)構(gòu)具有調(diào)控作用，且pH 降低可導(dǎo)致土壤細(xì)菌生物量降低。土壤pH 和氮等養(yǎng)分含量，可以通過影響植物根系生長和微生物活性等間接影響地下資源的質(zhì)量和數(shù)量對線蟲群落組成產(chǎn)生直接或間接影響。高靜等［9］研究發(fā)現(xiàn)土壤pH 的變化是由諸多因素共同造成的，不同生物炭種類及含量對不同性質(zhì)的土壤酸堿度影響不同，本實(shí)驗(yàn)中施加不同生物炭量對土壤pH 的影響不顯著，對土壤線蟲群落影響較小。

4 結(jié)論

利用高通量測序技術(shù)，對比分析了不同生物炭施炭量條件下的土壤線蟲群落，主要從土壤線蟲群落的生物多樣性及土壤理化性質(zhì)兩方面來分析。研究發(fā)現(xiàn)，施加不同量的生物炭能不同程度的降低土壤線蟲的多樣性指數(shù)，與不添加生物炭的對照組相比，施加生物炭量越高，土壤線蟲群落的豐富度越低。施加的生物炭量越高土壤有機(jī)質(zhì)（OM）的含量越高，且差異顯著（P＜0.05），對土壤線蟲群落的影響也越大；速效氮（AN）含量隨生物炭施放量的增加而降低，但無顯著差異，對土壤線蟲群落影響較大；速效磷（AP）和pH 對土壤線蟲群落影響較小。