趙玉婷 廖黎 王鏡雅 楊晨 魯蘭

文章編號：1004－5422（2023）02－0119－06

DOI：10.3969/j.issn.1004-5422.2023.02.002

收稿日期：2022-06-27

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（81803812）；四川省科技廳科技創(chuàng)新苗子工程項目（2022046）

作者簡介：趙玉婷（1998—），女，碩士研究生，從事天然產(chǎn)物抗感染藥物的篩選研究.E-mail：1142774770@qq.com

通信作者：魯蘭（1983—），女，博士，研究員，從事抗感染小分子藥物的篩選及機制研究.E-mail：345747278@qq.com

摘要：采用結(jié)晶紫染色法、掃描電鏡法觀察亞抑菌濃度川銀花水煎液對耐藥銅綠假單胞菌生物被膜形成的影響，并從整體水平上運用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)分析耐藥銅綠假單胞菌基因表達情況，對差異基因進行功能富集及通路分析.結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄組測序共篩選出362個差異表達基因，其中下調(diào)基因206個，上調(diào)基因156個，可為耐藥銅綠假單胞菌在臨床上感染造成的相關(guān)疾病的治療提供新思路.

關(guān)鍵詞：川銀花；轉(zhuǎn)錄組學(xué)；銅綠假單胞菌；亞抑菌濃度；生物被膜

中圖分類號：R965

文獻標志碼：A

0引言

銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）是極易引起慢性感染的常見病原菌之一［1］.PA的耐藥機制繁多，且極易形成多藥耐藥（multi-drug resistance，MDR-PA）菌株，MDR-PA菌株的不斷增加，使一線抗菌藥物難以治療PA感染［2-3］.中藥在抗感染方面受到越來越多關(guān)注，具有多途徑、多組分與多靶點的特點，毒副作用小且不易產(chǎn)生耐藥性，凸顯了其在抗菌治療中的良好應(yīng)用前景［4］.川銀花為忍冬科忍冬屬植物細氈毛忍冬的干燥花蕾或帶初開的花，具有清熱解毒、保肝、抗菌、抗病毒、抗氧化和抗炎等藥理作用［5］.有研究通過性狀鑒別、顯微鑒別與超高效液相色譜法（UPLC）指紋圖譜比較了川銀花、金銀花與山銀花的異同，發(fā)現(xiàn)3種中藥的成分具有一定相似性，且川銀花的酚酸類成分占比最大［6］，中藥的酚酸類物質(zhì)是其抗菌的功效成分［7］.金銀花對PA、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌與蠟樣芽孢桿菌等有一定的抑菌活性［8-9］.研究發(fā)現(xiàn)，金銀花對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌與多重耐藥肺炎鏈球菌等5種兒童呼吸道多重耐藥菌具有較好的抑菌效果；金銀花水煎劑在體外可通過消除R質(zhì)粒的方式逆轉(zhuǎn)產(chǎn)金屬酶PA的耐藥性［10-11］.目前關(guān)于川銀花抑制臨床耐藥菌的作用機制研究較少，細菌生物被膜的形成是細菌產(chǎn)生耐藥性的典型機制之一，可阻止藥物穿入并逃逸宿主的免疫系統(tǒng)，是目前抗耐藥性研究的熱點.轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)已經(jīng)成為中藥研究中的重要方法［12-14］，本研究以收集的臨床常見致病耐藥PA菌株為對象，觀察川銀花的水煎液對PA菌株生物被膜的影響，采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)從整體水平分析耐藥PA菌株基因表達情況，探究川銀花抑制耐藥PA菌株生物被膜的作用機制.

1材料

1.1儀器

HFsafe 1200型超凈工作臺（上海力申科學(xué)儀器有限公司），LDZX-75L型立式高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠），GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），CR-2032型數(shù)顯游標卡尺（德清盛泰芯電子科技有限公司），ELx-800型光吸收酶標儀（美國伯騰儀器有限公司），ZHWY-100B型恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司），Regulus 8100型掃描電子顯微鏡（SEM）（日立高新技術(shù)有限公司）.

1.2材料

川銀花，購自成都市荷花池中藥材市場，經(jīng)四川抗菌素工業(yè)研究所魯蘭研究員鑒定為忍冬科忍冬屬植物細氈毛忍冬的干燥花蕾或帶初開的花；PA質(zhì)控菌株（編號，ATCC27853），購自美國標準菌種收藏所；3株臨床分離PA菌株，由四川抗菌素工業(yè)研究所提供；MH（A）培養(yǎng)基（批號，20200730），購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；結(jié)晶紫（批號，115Y041）、瓊脂粉（批號，909A027）、LB 培養(yǎng)基（批號，20210527），均購自索萊寶科技有限公司；胰蛋白胨（批號，2426150），購自英國Oxoid公司； 無菌96孔板（批號，072020BA01），購自無錫耐思生命科技股份有限公司；麥氏比濁儀（批號，075870），購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司.

2方法與結(jié)果

2.1藥液制備

稱取川銀花80 g，用潔凈紗布包好放置于煎藥壺中，加入超純水1 000 mL，武火煮沸后切換為文火煎2 h，倒出取藥液，加入1 000 mL超純水，按此方法繼續(xù)煎煮藥液，過濾合并2次藥液，濃縮至10 mL，此時藥液濃度為8 000 mg/mL，121℃滅菌30 min，使用時現(xiàn)配現(xiàn)用.

2.2篩選耐藥PA菌株

將復(fù)蘇質(zhì)控菌株ATCC27853與臨床分離PA菌株用無菌生理鹽水調(diào)整菌懸液麥氏比濁度為0.5，用無菌棉簽伸入菌懸液蘸取適量菌液后，將菌液在MH（A）平皿上涂布均勻，晾干平皿，于平皿合適位置放置美羅培南、亞胺培南與左氧氟沙星藥敏紙片，10 min內(nèi)倒置平板，35～37 ℃下培養(yǎng)16～18 h.PA菌株的耐藥性根據(jù)相關(guān)的標準來判定，使用游標卡尺準確讀取抑菌圈的直徑［15］.

篩選出3株耐3種抗生素的PA菌株，名稱依次為PA101、PA102和PA103，3種抗生素對耐藥PA和ATCC27853菌株的抑菌圈直徑結(jié)果見表1.ATCC27853菌株的抑菌圈直徑結(jié)果均處于質(zhì)量控制（QC）范圍內(nèi)，美羅培南和亞胺培南對3株臨床PA菌株的抑菌圈直徑均≤15 mm，左氧氟沙星對3株臨床PA菌株的抑菌圈直徑均≤13 mm.菌物的最低抑菌濃度（MIC）是未見細菌生長時的最低藥物濃度.

采用瓊脂二倍稀釋法，分別于無菌平皿內(nèi)加入濃度為8 000 mg/mL的川銀花水煎液1 mL，50 ℃ MH（A）培養(yǎng)基14 mL，混勻，使每皿中所含的川銀花水煎液終濃度依次為500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81和3.91 mg/mL；另外再配制左氧氟沙星作為陽性對照組，于無菌平皿內(nèi)加入1 mL濃度為1 920 μg/mL左氧氟沙星， 50 ℃ MH（A）培養(yǎng)基14 mL，混勻，使每皿中所含左氧氟沙星的終濃度依次為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03、0.015和0.008 μg/mL.待平皿中的含藥瓊脂培養(yǎng)基冷卻凝固后，用多點接種儀接種稀釋好的菌液，并且設(shè)立不含藥的菌對照組， 35～37℃下培養(yǎng)18～24 h.

川銀花水煎液對ATCC27853和3株耐藥PA菌株的MIC值見表2.左氧氟沙星對ATCC27853和3株耐藥PA菌株的MIC值分別為1、32、16和16 μg/mL，川銀花對ATCC27853和3株耐藥PA菌珠的MIC值均為250 mg/mL.結(jié)合前期的藥敏紙片結(jié)果，采用PA101菌株進行后續(xù)實驗.

2.4亞抑菌濃度對菌株生物被膜的影響在TSA平皿上將耐藥PA101菌株培養(yǎng)18～24 h，挑取數(shù)個單菌落于營養(yǎng)肉湯中，調(diào)至菌懸液麥氏比濁度為1.0，用營養(yǎng)肉湯稀釋10倍備用.在96孔板第2～3列加入無菌營養(yǎng)肉湯100 μL，作為菌對照組；第4～7列分別加入濃度為500、250、125、62.5 mg/mL的川銀花水煎液各100 μL，每列6個復(fù)孔；再在第2～7列的6個復(fù)孔中加入稀釋好的菌液100 μL，使第4～7列川銀花藥物終濃度依次為250、125、62.5、31.25 mg/mL，即川銀花藥物濃度范圍為 1 MIC～1/8 MIC；其余孔加入200 μL的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基.于35～37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72 h.培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄96孔板中每孔的剩余培養(yǎng)液，用滅菌生理鹽水漂洗3次，去除浮游菌，加入250 μL 濃度為2 %的結(jié)晶紫溶液染色10 min，用無菌生理鹽水緩慢洗去多余結(jié)晶紫，加入250 μL無水乙醇溶解PA菌株生物被膜，在波長為570 nm 處用酶標儀測定各孔吸光度值［16-17］.

亞抑菌濃度的川銀花水煎液對PA101菌株生物被膜的影響作用見表3.與菌對照組相比，川銀花水煎液在亞抑菌濃度為125和62.5 mg/mL（即1/2 MIC和1/4 MIC）時，對PA101菌株生物被膜形成有抑制作用（P＜0.01和P<0.05）.川銀花水煎液濃度在250 mg/mL（即1MIC）時，抑制PA101菌株生長，也抑制其生物被膜形成.

2.5亞抑菌濃度對菌株生物被膜形態(tài)學(xué)的影響蓋玻片經(jīng)高壓滅菌后置于無菌 6 孔平底培養(yǎng)板中，每孔 2 片，斜放在孔中，菌對照組加入2 mL肉湯培養(yǎng)基，低、中和高劑量組分別加入2 mL的含藥物質(zhì)量濃度為1/8 MIC、1/4 MIC和1/2 MIC的肉湯液體培養(yǎng)基，將200 μL的1×104 CFU /mL的PA101菌體混懸液加入6孔板中，封口膜密封，37 ℃孵育 72 h 后取出蓋玻片，棄去培養(yǎng)基，用高壓滅菌的PBS緩沖液緩緩漂洗各孔蓋玻片3次，去除浮游菌，用2.5%的戊二醛固定12 h，SEM形態(tài)學(xué)觀察.

亞抑菌濃度的川銀花水煎液對PA101菌株生物被膜的作用如圖1所示.SEM圖顯示，川銀花對PA101生物被膜的抑制作用隨藥物質(zhì)量濃度增加而加強，其中生物被膜產(chǎn)生量為菌對照組＞1/8 MIC＞1/4 MIC＞1/2 MIC.

2.6轉(zhuǎn)錄組測序及差異表達基因分析

復(fù)蘇PA101菌株，置35～37 ℃下培養(yǎng)18～24 h，用滅菌生理鹽水調(diào)至菌懸液麥氏比濁度為1.0，LB培養(yǎng)基稀釋菌量至5×106 ?CFU/mL左右.在150 r/min、37 ℃條件下培養(yǎng)3～4 h，測定菌液麥氏比濁度為0.5左右.設(shè)立不含藥液的菌對照組，給藥組則在培養(yǎng)液加入適量川銀花水煎液，使藥物終濃度為62.5 mg/mL（即1/4 MIC），37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h.然后在4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min，吸棄培養(yǎng)液，用滅菌生理鹽水洗滌PA101菌株3次，然后在4℃、8 000 r/min條件下離心10 min，吸干生理鹽水，于-80 ℃貯存樣品，菌對照組和給藥組各取3個平行樣品檢測.用 DEGseq2 軟件分析2組基因差異表達，下調(diào)差異基因篩選標準為P＜0.05，log2 Fold Change<-1；上調(diào)差異基因的篩選標準為log2 Fold Change>1，|log2 Fold Change|＞1.分析結(jié)果表明，給藥組與菌對照組進行比較，有362個表達基因發(fā)生明顯變化，包括上調(diào)基因156個，下調(diào)基因206個，結(jié)果如圖2所示.其中，綠色代表下調(diào)基因，紅色代表上調(diào)基因，藍色代表無顯著差異基因.

2.7差異表達基因GO生物富集和KEGG通路分析差異表達基因GO生物富集在DAVID數(shù)據(jù)庫中分析，篩選標準為P＜0.05，并繪制生物過程（BP）、細胞組成（CC）和分子功能（MF）GO結(jié)果注釋圖.差異基因的KEGG通路分析在KOBAS數(shù)據(jù)庫中進行.

在差異表達基因進行GO生物富集分析結(jié)果中，滿足篩選標準的上調(diào)基因MF和BP條目共9個，如圖3（A）所示.BP主要富集在陰離子跨膜轉(zhuǎn)運、有機酸跨膜轉(zhuǎn)運與羧酸跨膜轉(zhuǎn)運；CC沒有顯著富集；MF主要富集在電子轉(zhuǎn)移活性、血紅素結(jié)合與NADP結(jié)合等.BP、MF和CC條目中滿足篩選標準的下調(diào)基因共12個，如圖3（B）所示.BP大部分富集在α-氨基酸代謝過程、α-氨基酸分解代謝過程、細胞—氨基酸分解代謝過程、硫化合物代謝過程、天冬氨酸家族氨基酸代謝過程與氧化還原過程；CC主要富集在外膜邊界質(zhì)周空間；MF主要富集在鐵離子結(jié)合與抗氧化活性等過程.

對差異表達基因進行KEGG通路分析，由篩選標準得到13條與上調(diào)基因相關(guān)的通路，如圖4（A）所示.富集在抗生素的生物合成、不同環(huán)境中的微生物代謝、碳代謝、吩嗪生物合成、代謝途徑、次級代謝產(chǎn)物的生物合成、糖酵解/糖異生、果糖和甘露糖代謝、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）、戊糖磷酸途徑、精氨酸生物合成、檸檬酸循環(huán)（TCA循環(huán)）與氮代謝.下調(diào)基因得到14條通路，如圖4（B）所示.富集在代謝途徑、陽離子抗菌肽（CAMP）耐藥性、色氨酸代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、群體感應(yīng)、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝、生物被膜形成-PA、卟啉與葉綠素代謝、碳代謝、賴氨酸降解、甘油磷脂代謝、次級代謝產(chǎn)物的生物合成與芳香族化合物的降解.

3討論

PA是常見的條件致病菌之一，其引起的相關(guān)感染性疾病的治療及嚴重耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)成為臨床的棘手問題［18］.研究發(fā)現(xiàn)，許多中草藥在抗菌、抗病毒及逆轉(zhuǎn)耐藥性方面具有確定的活性作用［19-20］.中藥是具有多途徑、多組分與多靶點等特點的復(fù)雜化合物體系，近年來多組學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物系統(tǒng)的整體變化水平研究中［21-22］.轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)可以從整體水平上研究中藥干預(yù)前后細胞或組織中系列的基因變化情況，組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用更有利于對中藥的作用機制進行全面而系統(tǒng)地研究［23-24］.

觀察亞抑菌濃度川銀花水煎液對臨床耐藥PA101菌株生物被膜形成的影響發(fā)現(xiàn)，川銀花水煎液能抑制PA101菌株生物被膜的形成，并且生物被膜的形成量隨著川銀花藥物質(zhì)量濃度增加而減少.通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，川銀花水煎液作用后，PA101菌株中有362個表達基因發(fā)生明顯變化，其中206個下調(diào)基因，156個上調(diào)基因.

群體感應(yīng)系統(tǒng)（quorum sensing，QS）是一種細菌細胞間的信號傳遞機制，在細菌生物被膜形成過程中，QS具有重要調(diào)控作用.下調(diào)基因主要富集在代謝途徑、CAMP耐藥性、色氨酸代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、群體感應(yīng)、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝與生物被膜形成-PA等生物學(xué)途徑.本研究利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)亞抑菌濃度川銀花水煎液能抑制耐藥PA菌株生物被膜的形成，作用的機制可能是通過下調(diào)相關(guān)基因的表達來影響細菌的QS或氨基酸代謝等途徑，從而抑制PA菌株生物被膜的形成，為耐藥PA菌株在臨床上感染造成的相關(guān)疾病的治療提供新思路.

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（責(zé)任編輯：伍利華）

Effect of Lonicerae Similis Flos on Biofilm of Drug-Resistant Pseudomonas Aeruginosa Based on Transcriptomics Strategy

ZHAO Yuting，LIAO Li， WANG Jingya，YANG Chen，LU Lan

（Sichuan Industrial Institute of Antibiotics，Chengdu University，Chengdu 610052，China）

Abstract：

This study investigated the effect of sub-MICs of Lonicerae similis flos decoctions on the formation of biofilm of clinical drug-resistance ?pseudomonas aeruginosa（PA） .Crystal violet staining and scanning by electron microscopy were applied to observe the effect.And transcriptomics was used to analyze the gene expression of drug-resistance ?PA ?at the overall level，and analyze the function enrichment and pathway of these genes.A total of 362 differentially expressed genes were screened by transcriptome sequencing，including 206 down regulated genes and 156 up-regulated genes so as to explore the potential mechanism of sub-MICs of Lonicerae similis flos decoctions inhibiting the biofilm of clinical drug-resistance ?PA and provide new ideas and a series of references for the treatment of related diseases caused by clinical infection of drug-resistant pseudomonas aeruginosa.

Key words：

Lonicerae similis flos;transcriptomics;pseudomonas aeruginosa;sub-minimum inhibitory concentration;biofilm