劉曉鳳 楊放 梁洪 熊毅 梁晴 袁寧謠 葉萌

文章編號：1004－5422（2023）02－0113－06

DOI：10.3969/j.issn.1004-5422.2023.02.001

收稿日期：2022-03-08

基金項(xiàng)目：新藥中試四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（XYZS2022-22）；四川省中醫(yī)藥文化傳承與研究中心2021年度科研項(xiàng)目（2021Y012）；德陽市科技局計劃資助2022年度科研項(xiàng)目（2022SZ068）；廣西壯瑤藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 2020 年開放課題（GXZYKF2020-04） ；四川省科技成果轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化示范項(xiàng)目（2023ZHCG0071）

作者簡介：劉曉鳳（1987—），女，碩士，講師，從事中藥活性成分的提取研究.E-mail：11739589@qq.com

摘要：利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選車前草的有效活性成分，采取高效液相色譜法建立指標(biāo)性成分大車前苷含量測定的方法，將含量作為參比，借助偏最小二乘回歸算法建立車前草大車前苷的定量校正模型，并對未知樣品中大車前苷含量進(jìn)行預(yù)測.結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出排名靠前的活性成分有木犀草素、黃芩素、大車前苷、羥基木犀草素和高車前素.近紅外檢測的大車前苷定標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對分析誤差、交叉檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)誤差、校正模型的決定系數(shù)、交叉驗(yàn)證相對分析誤差和相關(guān)系數(shù)分別為0.043、7.030、0.265、0.600、1.140和0.993.本研究建立的模型檢測速度快、效率高、結(jié)果可靠，可用于車前草大車前苷的質(zhì)量控制.

關(guān)鍵詞：車前草；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；含量測定；近紅外快檢技術(shù)；定量模型

中圖分類號：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A0引言車前草為車前科植物車前（Plantago asiatica L.）或平車前（Plantago depressa Willd.）的干燥全草，具有利尿通淋、抗菌抗炎、涼血解毒及清熱明目的功效［1］ .《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版［2］規(guī)定車前草的指標(biāo)性成分為大車前苷，但其是否是車前草的有效成分還需要進(jìn)一步研究.

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從系統(tǒng)生物學(xué)的角度闡述中藥成分與疾病靶點(diǎn)之間關(guān)系的學(xué)科，其可闡明中藥的有效活性成分及治療疾病的作用機(jī)制，廣泛用于多種疾病、藥理及毒理的機(jī)制研究，對臨床合理用藥、發(fā)展創(chuàng)新藥物及發(fā)現(xiàn)新的適應(yīng)證等可提供數(shù)據(jù)支撐.中藥具有多成分、多靶標(biāo)和多通路的特點(diǎn)，其并不是通過單一成分預(yù)防或治療疾病，而是通過多成分共同調(diào)節(jié)發(fā)揮作用［3-6］.故采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對車前草進(jìn)行有效活性成分篩選可進(jìn)一步為研究車前草的有效活性成分、質(zhì)量控制指標(biāo)及藥理作用機(jī)制提供理論依據(jù).車前草作為常用中藥［7-9］，其應(yīng)用廣泛.市場上的清寧丸、止瀉靈片、復(fù)方枇杷葉膏和廣東神曲等中成藥處方中均含有車前草.由于市場需求較大，藥材流通市場上個別原料供應(yīng)商常通過摻偽或以次充好，導(dǎo)致藥品質(zhì)量參差不齊，故對車前草進(jìn)行快速檢測具有重要意義.

近紅外光譜（NIR）法是光譜衡量技術(shù)法和化學(xué)計量學(xué)技術(shù)法有效結(jié)合的二級分析法，已廣泛應(yīng)用于中草藥及其產(chǎn)品分析中［10-13］，相較傳統(tǒng)分析方法而言，其具有快速、高效和無污染等優(yōu)點(diǎn)［10］ .相關(guān)研究人員利用NIR技術(shù)對川貝母及其摻偽品進(jìn)行了快速鑒別及摻偽量快速檢測［14-15］，建立了三七的質(zhì)量快速評價體系等［16］.本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)為手段，《中國藥典》2020 年版為基準(zhǔn)，采用NIR法對車前草制定快速檢測的方法，高效完成車前草質(zhì)量分級，增加栽培、采收、加工與銷售等各環(huán)節(jié)的質(zhì)量把控，以期為車前草質(zhì)量控制提供參考.

1材料

1.1儀器

NIR Magic 3500型近紅外光譜分析儀（北京偉創(chuàng)英圖科技有限公司），DHS16-A型快速水分測定儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司），PCDX-J-10型超純水儀（成都品成科技有限公司），ESJ182-4型電子分析天平（沈陽龍騰電子有限公司），PS-40型超聲波清洗器（深圳得康洗凈電器有限公司），LC-2010AAT型高效液相色譜儀（日本島津公司），F(xiàn)W-80型萬能粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）.

1.2材料

大車前苷對照品（批號，20190122），成都科隆化學(xué)品有限公司；51批車前草原藥材（批號，CQC20201201～CQC20201251），均采自四川省德陽市，經(jīng)成都大學(xué)郭曉恒副教授鑒定為車前科植物車前（Plantago asiatica L.）的干燥全草；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純.

2方法與結(jié)果

2.1網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)法

2.1.1“成分—靶點(diǎn)—通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫和分析軟件、中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析工具，以及中國天然產(chǎn)物化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，檢索獲得車前草有效活性成分中“化合物—靶點(diǎn)—通路”相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)，得到 47個節(jié)點(diǎn)（5 個化合物節(jié)點(diǎn)與42 個靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)）及274個基因?qū)?yīng)通路.該網(wǎng)絡(luò)中，每個化合物平均與8.40個靶點(diǎn)相互作用，每個靶點(diǎn)平均與6.52個疾病通路有關(guān).因此，車前草中存在單化合物與多靶點(diǎn)的作用，同時也存在多化合物作用于單靶點(diǎn)的現(xiàn)象.

2.1.2GO功能富集分析

通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能富集分析研究，共得到60個GO條目（P＜0.05），分別對應(yīng)生物過程（BP）、細(xì)胞組成（CC）和分子功能（MF）各20個條目，如圖1所示.2.1.3KEGG通路富集分析

同時利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG通路富集分析，共獲得前列腺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌與非小細(xì)胞肺癌等274條信號通路（P＜0.05）.其中，前列腺癌通路涉及RB1、HSP90AA1、CDKN1B、EGFR、PIK3CG、RELA、IGF1R、CASP9、NFKBIA、AR和TP53等基因；膀胱癌通路涉及CCND1、MMP1、CDK4、MMP2、ERBB2、MDM2、MAPK1、TP53、MMP9和EGFR等基因；小細(xì)胞肺癌通路涉及NFKBIA、CASP9、CDKN1B、CDK4、AKT1、PTGS2、TP53、RELA、PIK3CG和BCL2L1等基因；非小細(xì)胞肺癌涉及RB1、CASP9、CCND1、CDK4、ERBB2、MAPK1和EGFR等基因.選P值較小的前20個通路進(jìn)行可視化，結(jié)果如圖2所示.

2.1.4有效成分篩選通過分析“化合物—靶點(diǎn)”的中心度值、親中心度值及等級值等，篩選出排名前5位的化合物依次為木犀草素、黃芩素、大車前苷、羥基木犀草素和高車前素，分別能與42、9、3、3和2個靶點(diǎn)蛋白發(fā)生作用.從靶點(diǎn)的角度分析，排名前5的靶點(diǎn)為AHT1、MAPK1、PIK3CG、TP53和CCND1，分別能與19、17、16、15和15個疾病通路作用［5］.上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選結(jié)果表明，中藥是多成分與多靶點(diǎn)共同發(fā)揮作用的，而有效成分的含量直接影響中藥的質(zhì)量.通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究可以從整體上對車前草成分進(jìn)行理論篩選，為后續(xù)含量研究提供參考.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果驗(yàn)證了《中國藥典》2020年版規(guī)定車前草的指標(biāo)性成分為大車前苷具有合理性，可通過對車前草中大車前苷的含量對其質(zhì)量進(jìn)行控制.

2.2NIR法

采用高效液相色譜（HPLC）法建立車前草中的指標(biāo)性成分大車前苷含量測定的方法，將含量作為參比，借助偏最小二乘回歸算法建立車前草中大車前苷的定量校正模型，并對未知樣品中大車前苷含量進(jìn)行預(yù)測.

2.2.1HPLC色譜條件

色譜柱為Supersil ODS2 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.1%甲酸溶液（17∶83）為流動相；檢測波長為330 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為10 μL.理論板數(shù)按大車前苷峰計算應(yīng)不低于3 000.

2.2.2對照品溶液制備

取大車前苷對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加60%甲醇制成每1 mL含0.1 mg的對照品溶液，備用.

2.2.3供試品溶液制備

將車前草樣品干燥后，粉碎過2號篩，取樣品粉末約0.5 g，精密稱定， 置于50 mL錐形瓶中，加入 60%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（溫度30 ℃，頻率300 W，功率50 kHZ） 40 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用 60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液.

2.2.4方法學(xué)考察

1）系統(tǒng)適用性試驗(yàn).精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液與“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液各10 μL，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定.結(jié)果表明，供試品溶液與對照品溶液的保留時間一致，分離度均大于1.5.

2）本研究已經(jīng)進(jìn)行線性、儀器精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收試驗(yàn)，結(jié)果均符合相關(guān)要求.

2.2.5樣品測定

按照“2.2.3”項(xiàng)下制備51批車前草供試品溶液，精密吸取10 μL，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，HPLC圖譜如圖3和圖4所示，結(jié)果見表1.圖譜將采用HPLC法測得的含量作為參比，借助偏最小二乘回歸算法建立車前草中大車前苷的定量校正模型，并對未知樣品中大車前苷含量進(jìn)行預(yù)測.

2.2.6車前草NIR模型的建立

從51批車前草樣品中隨機(jī)選取CQC20201201、CQC20201205、CQC20201209、CQC20201215、CQC20-?201221、CQC20201225、CQC20201230、CQC202012-?35、CQC20201241和CQC20201248共10批車前草樣品作為驗(yàn)證集樣.余下41批次車前草作為校正集樣.

2.2.7車前草NIR圖譜采集

將 NIR分析儀開機(jī)預(yù)熱30 min，將41批車前草粉末樣品（過2號篩）放入樣品袋中，壓實(shí)樣品直至不松動，再把樣品袋對準(zhǔn)垂直的儀器進(jìn)行測定.儀器基線噪聲值 0.000 01，光源能量值 35 927，基線重復(fù)性值 0.000 1，波長準(zhǔn)確性值 0.402，波長重復(fù)性值 0.002，吸光度重復(fù)值 0.000 1，測量模式均為正常［12］.光譜掃描時，參比為儀器內(nèi)置背景，掃描次數(shù) 32 次，分辨率值為 8 cm-1，掃描范圍為 900～1 800 cm-1［13］. 41批車前草樣品NIR原始疊加圖譜如圖5所示.圖541批車前草樣品NIR原始疊加圖譜2.2.8光譜預(yù)處理

光譜預(yù)處理應(yīng)選擇最適合的方法，這樣不僅能除去噪聲的干擾，還能減少雜光、散光及樣品物理狀態(tài)等因素對模型準(zhǔn)確性的影響.本研究所用的化學(xué)計量學(xué)分析軟件V2.6.1.0具有多種光譜預(yù)處理的方法，例如，消除常數(shù)偏移量、矢量歸一化和一階導(dǎo)數(shù)等［14］.本研究對疊加光譜圖進(jìn)行了前處理和波段選擇，消除了噪聲比較大的波段，結(jié)果如圖6所示.圖641批車前草樣品NIR精簡圖譜2.2.9校正模型的建立

利用化學(xué)計量學(xué)分析軟件V2.6.1.0的優(yōu)化功能完成模型的構(gòu)造，做完內(nèi)部交叉檢驗(yàn)，從而確定一定參數(shù)作為指標(biāo)性參考，包括系數(shù)、內(nèi)部交叉驗(yàn)證均方差和相對分析誤差等，獲得車前草中大車前苷最優(yōu)的校正模型.本研究把41份校正集車前草樣品的NIR圖譜和HPLC法測定值運(yùn)用偏最小二乘回歸算法擬合，使用留一法進(jìn)行內(nèi)部交互驗(yàn)證，從而達(dá)到模型驗(yàn)證，得到模型的主因子數(shù)，確定車前草中大車前苷含量的定量模型，將含量預(yù)測值與真實(shí)值進(jìn)行比較.結(jié)果如圖7所示.圖7車前草中大車前苷定量模型校正曲線初步建立的車前草中大車前苷定量校正模型方程式為Y=0.99X+0.01，R2=0.993，表明模型準(zhǔn)確性高.采用交叉驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)誤差和相關(guān)系數(shù)等相關(guān)數(shù)據(jù)對模型的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行客觀評價.其中，定標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對分析誤差、交叉檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)誤差、校正模型的決定系數(shù)、交叉驗(yàn)證相對分析誤差和相關(guān)系數(shù)分別為0.043、7.030、0.265、0.600、1.140和0.993.

2.2.10模型驗(yàn)證

取驗(yàn)證集樣品10批，利用已建立的定量模型進(jìn)行外部交叉驗(yàn)證，如圖8所示.圖8車前草大車前苷定量模型外部驗(yàn)證結(jié)果獲得預(yù)測的結(jié)果方程式為Y=0.992 05X+1.134 57，R2=0.998 4，結(jié)果證明預(yù)測值與參考值相關(guān)性接近，所建定量模型穩(wěn)定可靠，可用于車前草樣品中大車前苷含量的快速檢測，具體結(jié)果見表2.

目前，多數(shù)中藥有效成分不明，作用機(jī)制不清，其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中測定的成分不能確定是指標(biāo)性成分還是有效成分，這為中藥質(zhì)量控制帶來了一定的難度.現(xiàn)代研究指出，中藥及其復(fù)方制劑具有多成分、多靶點(diǎn)與多通路的特點(diǎn)，多個成分共同協(xié)調(diào)發(fā)揮藥效作用［17-18］.本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對車前草的成分和相關(guān)通路進(jìn)行分析，篩選出排名靠前的5種成分中包括《中國藥典》2020年版中規(guī)定車前草的指標(biāo)性成分大車前苷，從而驗(yàn)證了該指標(biāo)測定的必要性與重要性.

本研究建立的NIR快檢技術(shù)，能夠快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行現(xiàn)場質(zhì)量評價，樣品處理操作簡單，在不耗損樣品的情況下可對車前草中大車前苷進(jìn)行高效率、精準(zhǔn)和穩(wěn)定地測定.在車前草成熟期采收及銷售現(xiàn)場即可滿足產(chǎn)品等級的劃分，可以減少質(zhì)量把關(guān)不足的缺點(diǎn)，同時減少檢測時間，提高工作效率.

本研究建立了車前草中大車前苷快速檢測模型，用已建立的定量模型進(jìn)行外部交叉驗(yàn)證，預(yù)測的結(jié)果與《中國藥典》2020年版中的方法測定值較為接近.NIR快速測定為間接分析法，其準(zhǔn)確性與大量有代表性的樣品的數(shù)量密切相關(guān)，因此為了確保測定的準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性，應(yīng)該要提高各地區(qū)的樣本數(shù)量，對不同產(chǎn)地與不同階段的車前草應(yīng)重新建立對應(yīng)的模型.

參考文獻(xiàn)：

［1］陳啟鑫.中藥車前草的研究進(jìn)展［J］.中西醫(yī)結(jié)合心血管病電子雜志，2019，7（25）：151-152.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020.

［3］孫浪.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的痛風(fēng)定膠囊治療痛風(fēng)及高尿酸血癥的作用機(jī)制研究［D］.大理：大理大學(xué)，2021.

［4］胡子毅，張平，李人亮，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討消痛湯治療痛風(fēng)的作用機(jī)制［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2021，17（6）：110-116.

［5］劉浪，莫易，朱蠡慶，等.車前草治療隱匿性腎炎的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制［J］.武漢工程大學(xué)學(xué)報，2021，43（5）：500-507.

［6］張貴彪，陳啟龍，蘇式兵.中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究進(jìn)展［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2013，20（8）：103-106.

［7］王琪，陶河清.車前草藥理作用的研究進(jìn)展［J］.世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2017，17（102）：72+75.

［8］王歌.車前草化學(xué)成分與藥理作用的研究［J］.黑龍江醫(yī)藥，2014，27（4）：864-865.

［9］張雪芹，曲瑋，梁敬鈺.車前草化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展［J］.海峽藥學(xué)，2013，25（11）：1-8.

［10］蒙杰丹.近紅外光譜法快速無損分析測定中藥活性成分的研究［D］.重慶：西南大學(xué)，2012.

［11］陳穎，王璐，尚宏鑫，等.近紅外光譜技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的應(yīng)用進(jìn)展［J］.河北漁業(yè)，2022，50（2）：33-37.

［12］楊帆.近紅外光譜法在汽柴油分析檢測中的應(yīng)用［J］.中國石油和化工標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量，2022，42（1）：44-46.

［13］胡楊，李先芝，劉洋，等.近紅外光譜技術(shù)在中藥質(zhì)量監(jiān)控中的研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，50（1）：8-11.

［14］范林宏，何林，譚超群，等.基于便攜式近紅外光譜技術(shù)快速檢測川貝母摻偽問題［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2022，28（3）：131-138.

［15］周婷，付紹兵，謝慧敏，等.近紅外光譜在川貝母及非川貝母品種鑒別中的應(yīng)用［J］.華西藥學(xué)雜志，2021，36（2）：193-197.

［16］周雨楓.近紅外光譜法應(yīng)用于三七質(zhì)量評價［D］.天津：天津醫(yī)科大學(xué)，2019.

［17］李海英，潘雪，王敏存，等.基于超分子“氣析”理論定量整合與驗(yàn)證中藥成分及靶點(diǎn)群［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2021，27（21）：207-213.

［18］王升啟.中藥作用分子機(jī)制研究新策略［J］.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2019，33（9）：647.（責(zé)任編輯：伍利華）

Study on Plantaginis Herba Content Based on Active Ingredient Screening and Near-Infrared Rapid Detection Technology

LIU Xiaofeng1，YANG Fang2，LIANG Hong1，XIONG Yi1，LIANG Qing1，YUAN Ningyao1，YE Meng3

（1.Private Sichuan Tianyi College，Deyang 618213，China;2.Chengdu Tianhe Traditional Chinese and Western Medicine Science and Technology Conservation Co.，Ltd.，Chengdu 510000，China;3.School of Pharmacy，Chengdu University，Chengdu 610106，China）

Abstract：

The active ingredients in Plantaginis herba were studied by using cyber pharmacology.The HPLC method was used to establish the method to determine the content of the index component psyllium.The content was used as a reference to establish a quantitative correction model of Plantaginis herba with the help of a partial least squares regression algorithm，and to predict the content of Plantaginis herba in unknown samples.The results of network pharmacology screened out the top active ingredients luteolin，skullcap，planin，hydroxylubelin and hispidulin.Standard deviation of psyllium epigride calibration，relative analysis error，standard error of cross-examination，coefficient of decision of the corrected model，cross-validation relative analysis error and correlation coefficient were 0.043，7.030，0.265，0.600，1.140 and 0.993.It could be concluded that the qualitative model established in this study was fast，efficient and reliable，and could be used for the quality control of Plantaginis herba psyllodyl.

Key words：

Plantaginis herba;cyber pharmacology;content determination;near-infrared rapid detection technology;quantitative models