孫瑤 徐雯雅 周翠 吳慶 陳櫟江 徐春泉 葉建中 周鐵麗

摘要：目的 通過(guò)研究慶大霉素誘導(dǎo)糞腸球菌耐藥突變株對(duì)氯霉素協(xié)同敏感（collateral sensitivity， CS）的相關(guān)特性，為基于協(xié)同敏感治療策略的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。方法 采用慶大霉素通過(guò)梯度濃度平板對(duì)3株慶大霉素敏感的糞腸球菌臨床分離株和1株糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29212進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)耐藥（experimental evolution）；通過(guò)微量肉湯稀釋法測(cè)定慶大霉素誘導(dǎo)后耐藥突變株對(duì)常見抗菌藥物的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentrations， MICs），分析抗菌藥物間交叉敏感性；PCR檢測(cè)誘導(dǎo)耐藥菌株氨基糖苷類修飾酶編碼基因攜帶情況；通過(guò)瓊脂平板稀釋法測(cè)定慶大霉素誘導(dǎo)耐藥（evolved gentamicin-resistant）菌株和親本菌株對(duì)其協(xié)同敏感藥物（氯霉素）的防耐藥突變濃度（mutant prevention concentration， MPC），最后，測(cè)定氯霉素對(duì)慶大霉素誘導(dǎo)耐藥菌株和親本菌株的時(shí)間殺菌曲線。結(jié)果 結(jié)果顯示4株糞腸球菌親本菌株經(jīng)過(guò)慶大霉素誘導(dǎo)后，對(duì)慶大霉素MICs升高了16～

64倍，并對(duì)阿米卡星表現(xiàn)出交叉耐藥；誘導(dǎo)耐藥菌株及其親本菌株均未檢出aac（6'）-Ie-aph（2"）-Ia。此外，研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后菌株對(duì)氯霉素表現(xiàn)出協(xié)同敏感。氯霉素對(duì)慶大霉素誘導(dǎo)耐藥糞腸球菌及其親本菌株的MPC均大于1024 μg/mL，突變選擇窗較寬；時(shí)間殺菌曲線顯示當(dāng)氯霉素濃度為親本菌株的1/2×MIC或1/4×MIC時(shí)，慶大霉素誘導(dǎo)耐藥菌株的生長(zhǎng)被有效抑制，而親本菌株則不能被抑制。結(jié)論 基于協(xié)同敏感性制定抗菌藥物治療策略可能有助于有效清除耐藥病原菌并延長(zhǎng)抗菌藥物的使用壽命。

關(guān)鍵詞：糞腸球菌；協(xié)同敏感；慶大霉素；氯霉素；誘導(dǎo)耐藥

中圖分類號(hào)：R978.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Study on the characteristics of collateral sensitivity to chloramphenicol

of evolved gentamicin-resistant Enterococcus faecalis

Sun Yao， Xu Wen-ya， Zhou Cui， Wu Qing， Chen Li-jiang， Xu Chun-quan， Ye Jian-zhong， and Zhou Tie-li

（Laboratory Medicine Center， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000）

Abstract Objective To study the characteristics of collateral sensitivity to chloramphenicol of evolved gentamicin-resistant Enterococcus faecalis， and to provide foundation for clinical application of treatment strategies based on collateral sensitivity （CS）. Methods Three clinically isolated antimicrobial susceptible Enterococcus faecalis and E. faecalis standard strain ATCC29212 were used to adaptation laboratory evolution in vitro with gentamicin gradient concentration plates. The minimum inhibitory concentrations （MICs） of evolved gentamicin -resistant strains were determined by the microbroth dilution method， and the cross susceptibilities between antimicrobials were analyzed. The prevalence of aminoglycoside modifying enzyme encoding gene was detected by PCR in the evolved resistant strains. The agar plate dilution method was performed to determine the mutant prevention concentration （MPC） of evolved gentamicin-resistant strains and parental strains to the collateral sensitivity drug （chloramphenicol）. Finally， the time-kill curve of chloramphenicol on the strains before and after evolution of gentamicin was determined. Results The results showed that the MICs of four strains of E. faecalis were increased 16～64 fold after evolution to gentamicin， and they showed cross-resistance to Amikacin. aac（6'）-Ie-aph（2"）-Ia had not been detected in all evolved resistant strains and their parental strains. Interestingly， the evolved resistant strains exhibited collateral sensitivity to chloramphenicol. The MPC of chloramphenicol in E. faecalis before and after evolution to gentamicin was higer than 1，024 μg/mL， indicating a wide mutant selection window （MSW）. The time-kill curve showed that when the concentration of chloramphenicol was 1/2×MIC or 1/4×MIC of the ancestral strain， the evolved resistant strains were effectively inhibited， while the parental strains could not be effectively inhibited. Conclusion ?Antimicrobials therapy strategies based on collateral sensitivity possibly help to effectively eliminate drug-resistant pathogens and prolong the lifespan of antimicrobial drugs.

Key words Enterococcus faecalis; Collateral sensitivity; Gentamicin; Chloramphenicol; Evolved resistance

抗菌藥物在人類醫(yī)療、畜牧業(yè)以及農(nóng)業(yè)上的廣泛使用甚至濫用，使得細(xì)菌幾乎對(duì)所有抗菌藥物均出現(xiàn)耐藥并迅速播散[1]。新型抗菌藥物的研發(fā)難度大、周期長(zhǎng)[2]，人們迫切需要尋找新的對(duì)策來(lái)對(duì)抗或者延緩耐藥性的產(chǎn)生。近年來(lái)研究不斷強(qiáng)調(diào)基于進(jìn)化的策略（evolution-based strategies）在優(yōu)化和延長(zhǎng)現(xiàn)有藥物療效方面的前景，包括藥物循環(huán)使用、聯(lián)合用藥、抗菌藥物管理等[3]。近期多項(xiàng)研究表明協(xié)同敏感（collateral sensitivity，CS）可能成為一種有效的手段延緩或者逆轉(zhuǎn)抗菌藥物的耐藥性[4]。

交叉敏感性（cross susceptibility）包括交叉耐藥（cross resistance）及協(xié)同敏感，指耐藥突變導(dǎo)致細(xì)菌耐藥的同時(shí)對(duì)另外一種抗菌藥物敏感性降低或者升高。近年來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)[5]在細(xì)菌及癌癥中均有多種藥物顯示出協(xié)同敏感現(xiàn)象。不斷有研究發(fā)現(xiàn)[6]基于協(xié)同敏感現(xiàn)象制定交替或者聯(lián)合用藥策略能夠一定程度上延緩細(xì)菌耐藥的發(fā)生。然而，協(xié)同敏感發(fā)生機(jī)制及其發(fā)生規(guī)律尚不明確。部分研究顯示[7]協(xié)同敏感譜表現(xiàn)出高度異質(zhì)性和非重復(fù)的特性，使得利用這一機(jī)制制定用藥策略復(fù)雜化。我們前期研究[8]采用5類8種抗菌藥物對(duì)糞腸球菌進(jìn)行體外誘導(dǎo)耐藥，結(jié)果顯示交叉耐藥及協(xié)同敏感現(xiàn)象廣泛存在。

目前，協(xié)同敏感相關(guān)研究主要集中在最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）水平，僅少數(shù)研究[9]開始著眼于闡釋防耐藥突變濃度（mutant prevention concentration，MPC）水平對(duì)細(xì)菌的作用。MPC指防止特定大小菌群中一步耐藥突變菌株選擇性富集的最低抗菌藥物濃度。MIC至MPC之間的濃度范圍稱為突變選擇窗（mutant selection window，MSW），當(dāng)抗菌藥物濃度落在MSW中時(shí)能夠選擇性富集一步耐藥突變株[10]。有研究表明[13]交叉敏感性的發(fā)生能夠引起MSW的改變。協(xié)同敏感菌株可能能夠縮小MSW，從而防止耐藥突變株被選擇性富集并有效清除耐藥細(xì)菌。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于協(xié)同敏感現(xiàn)象及其臨床用藥策略的研究仍較少，并且主要集中于大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌等[9]，罕有腸球菌相關(guān)研究。腸球菌作為一種臨床常見條件致病菌，可引起人類尿路感染、血流感染等多種感染性疾病，是最重要的醫(yī)院獲得性感染病原菌之一。因此，本部分研究?jī)?nèi)容針對(duì)慶大霉素誘導(dǎo)耐藥引起氯霉素敏感性升高的糞腸球菌菌株進(jìn)行MPC測(cè)定和時(shí)間殺菌實(shí)驗(yàn)，了解協(xié)同敏感菌株在各抗菌藥物濃度水平下的清除效率，為臨床制定有效清除感染耐藥病原菌的合理方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

實(shí)驗(yàn)菌株為3株對(duì)慶大霉素敏感的糞腸球菌臨床分離株（菌株編號(hào)分別為FC254、FC446和FC490，分別分離自創(chuàng)面、膽汁及膿液標(biāo)本）、24株慶大霉素高水平耐藥的糞腸球菌臨床分離株和1株糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29212，臨床菌株為分離自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的非重復(fù)標(biāo)本，由法國(guó)梅里埃MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀和VITEK?2 Compact型全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行菌種鑒定和抗菌藥物敏感性初步測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)菌株糞腸球菌ATCC29212購(gòu)自衛(wèi)生部臨檢中心。

1.2 線性梯度平板法體外誘導(dǎo)耐藥

線性梯度平板的制備參考文獻(xiàn)[8]。將加入抗菌藥物的15 mL LB瓊脂培養(yǎng)基（例如終濃度為1×MIC）傾注于90 mm培養(yǎng)皿中，將平皿傾斜放置；瓊脂凝固后使培養(yǎng)皿水平放置，加入另外不含藥的15 mL LB瓊脂培養(yǎng)基，放置擴(kuò)散12 h，所得梯度平板濃度即0～1×MIC，如圖1。

將過(guò)夜培養(yǎng)的4株待測(cè)菌株以無(wú)菌生理鹽水調(diào)成1.5×108 CFU/mL菌懸液；取100 μL上述菌液均勻涂布于瓊脂平板表面（起始梯度平板濃度：0～2×MIC），每4 d傳代1次；4 d后挑取高濃度端生長(zhǎng)菌落保種，新鮮梯度平板上；當(dāng)包括最高濃度處全板均有細(xì)菌生長(zhǎng)后，提高最高抗菌藥物濃度為原濃度5倍進(jìn)一步誘導(dǎo)；傳代10代，共40 d，同時(shí)將親本菌株在不含抗菌藥物L(fēng)B瓊脂平板上傳代，作為空白平行對(duì)照。每株待測(cè)菌株分別平行誘導(dǎo)3系（lineage）。分別取第3次、第6次和第9次傳代菌株進(jìn)行藥物敏感性的監(jiān)測(cè)；慶大霉素體外誘導(dǎo)耐藥菌株在不含抗菌藥物平板上連續(xù)傳代10代，觀察其藥物敏感性改變是否穩(wěn)定存在。

1.3 ?抗菌藥物敏感性試驗(yàn)

采用微量肉湯稀釋法測(cè)定誘導(dǎo)耐藥菌株及其親本菌株對(duì)包括慶大霉素在內(nèi)的13種抗菌藥物的抗菌藥物敏感性，即慶大霉素、阿米卡星、青霉素、氨芐西林、亞胺培南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星、萬(wàn)古霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素和呋喃妥因；確認(rèn)慶大霉素高水平耐藥糞腸球菌臨床分離株對(duì)慶大霉素的MICs值?？咕幬镔?gòu)自溫州市康泰生物科技有限公司。操作規(guī)范及折點(diǎn)判讀參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）標(biāo)準(zhǔn)2021版。采用糞腸球菌質(zhì)控菌株ATCC 29212進(jìn)行質(zhì)控。

1.4 氨基糖苷類修飾酶編碼基因PCR檢測(cè)

采用Biospin細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取慶大霉素誘導(dǎo)耐藥菌株及其親本菌株、24株慶大霉素高水平耐藥糞腸球菌臨床分離株的基因組DNA。PCR擴(kuò)增氨基糖苷類修飾酶aminoglycoside modifying enzymes， AMEs）編碼基因aac（6'）-Ie-aph（2"）-Ia。引物序列為F：CAGAGCCTTGGGAAGATGAAG；R：CCTCGTGTAATTCATGTTCTGGC，產(chǎn)物大小為

348 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，Gel-Red染色后凝膠成像觀察結(jié)果。

1.5 防耐藥突變濃度的測(cè)定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[11]中瓊脂平板稀釋法檢測(cè)慶大霉素誘導(dǎo)耐藥糞腸球菌和親本菌株對(duì)氯霉素的防耐藥突變濃度。以誘導(dǎo)耐藥糞腸球菌對(duì)氯霉素的MIC為基準(zhǔn)，采用倍比稀釋方法進(jìn)行含抗菌藥物的平板配制，藥物濃度自 MIC到1024 μg/mL；將待測(cè)菌株37℃培養(yǎng)18～24 h，挑取單個(gè)純菌落于20 mL MH 肉湯培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)18～24 h，3000 r/min離心

10 min 后將沉淀重懸并加入到200 mL MH肉湯培養(yǎng)基中，200 r/min震蕩培養(yǎng)6 h，再次以3000 r/min離心10 min，取沉淀調(diào)節(jié)菌液濃度為3.0×1010 CFU/mL；吸取100 μL上述菌液均勻涂布于每個(gè)含有倍比稀釋抗菌藥物的胰酶大豆瓊脂平板上，每個(gè)濃度接種4個(gè)平板，并以菌落計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)確定每個(gè)平板細(xì)菌總接種量大于1.0×1010 CFU，將平板置于37℃孵育；于 24、48和72 h時(shí)分別觀察菌落生長(zhǎng)情況，將72 h無(wú)菌落生長(zhǎng)的最低藥物濃度稱為暫定MPC（MPCpr）；以MPCpr為基準(zhǔn)，按抗菌藥物濃度的10%依次遞減配制各濃度含藥平板，重復(fù)上述MPCpr測(cè)定時(shí)操作，將72 h無(wú)菌落生長(zhǎng)的最低藥物濃度稱為MPC。選擇指數(shù)（Selection index， SI）=MPC/MIC。

1.6 時(shí)間-殺菌實(shí)驗(yàn)

將新鮮培養(yǎng)的待測(cè)純菌株以無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌懸液濃度并加入MH肉湯培養(yǎng)基中，使初始接種細(xì)菌濃度約為105～106 CFU/mL；向上述體系中加入抗菌藥物，使抗菌藥物終濃度為1/4×MIC、1/2×MIC、1×MIC、4×MIC 和16×MIC，并設(shè)置不含抗菌藥物的空白生長(zhǎng)對(duì)照，置37℃培養(yǎng)；分別于0、2、4、6、8、10、12 和24 h對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)；以每毫升細(xì)菌數(shù)（CFU/mL）為縱坐標(biāo)，以時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)，取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制各誘導(dǎo)耐藥菌株的時(shí)間-殺菌曲線。

2 結(jié)果

2.1 體外誘導(dǎo)糞腸球菌對(duì)慶大霉素藥物敏感性情況分析

4株親本菌株以慶大霉素進(jìn)行誘導(dǎo)，每株菌設(shè)置3組平行，共獲得12系誘導(dǎo)耐藥菌株（GEN-FC254①、GEN-FC254②、GEN-FC254③、GEN-FC446①、GEN-FC446②、GEN-FC446③、GEN-FC490①、GEN-FC490②、GEN-FC490③、GEN-ATCC29212①、GEN-ATCC29212②和GEN-ATCC29212③）。相比誘導(dǎo)前親本菌株，12系誘導(dǎo)耐藥突變株對(duì)慶大霉素MICs提高了16～64倍；不含抗菌藥物平行傳代獲得的菌株MICs未見明顯改變。3組平行重復(fù)試驗(yàn)誘導(dǎo)獲得的耐藥株間相比，MICs升高倍數(shù)無(wú)明顯差異。12系誘導(dǎo)耐藥菌株在不含抗菌藥物的平板上連續(xù)傳代10代后耐藥性均呈穩(wěn)定存在。

2.2 誘導(dǎo)耐藥菌株對(duì)其他各種藥物交叉敏感性情況分析

藥敏結(jié)果顯示慶大霉素誘導(dǎo)耐藥菌株對(duì)3種抗菌藥物敏感性發(fā)生明顯改變，即12系誘導(dǎo)耐藥菌株均對(duì)阿米卡星MICs升高大于8倍（誘導(dǎo)前4株糞腸球菌對(duì)阿米卡星MIC為64～128 μg/mL，慶大霉素誘導(dǎo)菌株均>1024 μg/mL），對(duì)氯霉素和紅霉素表現(xiàn)為不同程度的協(xié)同敏感性（MIC下降倍數(shù)≥4倍），其中以氯霉素較為顯著，MIC下降4～16倍，見圖2。3組平行誘導(dǎo)獲得的耐藥株間的藥物敏感譜無(wú)明顯差異，臨床菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株相比，誘導(dǎo)耐藥菌株藥物敏感譜同樣無(wú)明顯差異，具體見表1。提示經(jīng)同種抗菌藥物誘導(dǎo)耐藥后，細(xì)菌對(duì)抗菌藥物敏感性的改變可能具有一定的規(guī)律性和可預(yù)測(cè)性。

2.3 氨基糖苷類修飾酶基因攜帶情況

PCR檢測(cè)結(jié)果顯示24株慶大霉素高水平耐藥糞腸球菌臨床分離株（MICs≥512 μg/mL）均攜帶aac（6'）-Ie-aph（2"）-Ia，而12株慶大霉素誘導(dǎo)耐藥菌株及其4株親本菌株均不攜帶該基因。

2.4 防耐藥突變濃度的測(cè)定

氯霉素對(duì)4株糞腸球菌親本菌株和12株慶大霉素誘導(dǎo)耐藥糞腸球菌的MPC均大于1024 μg/mL，遠(yuǎn)高于MIC值，選擇指數(shù)均SI>512，防耐藥突變選擇窗MSW較寬。

2.5 時(shí)間殺菌實(shí)驗(yàn)分析

時(shí)間殺菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抗菌藥物濃度為親本菌株氯霉素MICs的1/2×MIC或1/4×MIC時(shí)，誘導(dǎo)耐藥菌株可以被有效抑制，而親本菌株則不能被有效抑制生長(zhǎng)（圖3），1/4×MIC抗菌藥物濃度時(shí)，誘導(dǎo)耐藥菌株僅在12 h后生長(zhǎng)曲線開始升高；藥物濃度為1×MIC時(shí)，誘導(dǎo)耐藥菌株生長(zhǎng)被抑制，而親本菌株仍能緩慢生長(zhǎng)；當(dāng)抗菌藥物水平為親本菌株氯霉素MICs的4倍及16倍時(shí)，誘導(dǎo)耐藥前后的菌株均被完全抑制生長(zhǎng)，兩者時(shí)間殺菌曲線無(wú)明顯區(qū)別，見圖3。

3 ? ?討論

數(shù)十年來(lái)，多重耐藥病原菌的快速出現(xiàn)和流行給公共衛(wèi)生安全造成嚴(yán)重威脅?；趨f(xié)同敏感現(xiàn)象制定抗菌藥物使用策略能夠有效減低耐藥的發(fā)生率甚至逆轉(zhuǎn)已經(jīng)存在的耐藥性[8]。在本研究中通過(guò)慶大霉素對(duì)糞腸球菌進(jìn)行體外誘導(dǎo)耐藥實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果顯示交叉耐藥及協(xié)同敏感廣泛存在，相同作用機(jī)制的抗菌藥物之間存在交叉耐藥，而協(xié)同敏感發(fā)生于作用機(jī)制不同的抗菌藥物之間。然而，有研究顯示交叉耐藥不僅能發(fā)生于同種類抗菌藥物間，也可以發(fā)生于不同種類藥物之間。例如，Lázár等[13]研究發(fā)現(xiàn)拓?fù)洚悩?gòu)酶基因gyrA突變的喹諾酮類耐藥的大腸埃希菌，能夠引起氨芐西林、頭孢西丁及妥布霉素等藥物的耐藥性升高，以及對(duì)呋喃妥因和多西環(huán)素敏感性的升高。協(xié)同敏感普遍存在，但在不同種細(xì)菌甚至同種細(xì)菌中也存在異質(zhì)性，可能與細(xì)菌不同的基因背景、適合度代價(jià)以及可移動(dòng)元件等因素有關(guān)[9]。研究顯示大腸埃希菌經(jīng)氨基糖苷類藥物誘導(dǎo)耐藥后，對(duì)四環(huán)素和氯霉素發(fā)生協(xié)同敏感，可能與質(zhì)子泵動(dòng)力勢(shì)（proton-motive force，PMF）有關(guān)[14]。本研究中糞腸球菌對(duì)氯霉素協(xié)同敏感的機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明。

臨床病原菌對(duì)氨基糖苷類耐藥可以由多種耐藥機(jī)制引起，其中以氨基糖苷類修飾酶滅活抗菌藥物分子最為常見，即乙?；D(zhuǎn)移酶（aminoglycoside acetyltransferases，AACs）、腺苷酸/核苷酸轉(zhuǎn)移酶（adenylyltransferases or nucleotidyltransferases，ANTs）和磷酸轉(zhuǎn)移酶（phosphotransferases，APHs），其中以雙功能酶aac（6'）-Ie-aph（2"）-Ia最為常見[15]。本研究中臨床分離慶大霉素高水平耐藥糞腸球菌中均檢出aac（6'）-Ie-aph（2"）-Ia基因，誘導(dǎo)耐藥菌株及其親本菌株均未攜帶該基因，提示誘導(dǎo)耐藥菌株可能是由其他耐藥機(jī)制引起對(duì)慶大霉素耐藥，如30S核糖體蛋白編碼基因突變[3]、外排泵表達(dá)量升高[14]等。研究提示與可移動(dòng)基因元件攜帶AMEs引起臨床菌株對(duì)慶大霉素耐藥不同，長(zhǎng)期用藥引起的慶大霉素耐藥演變可能由其他多種機(jī)制介導(dǎo)，并引起對(duì)其他抗菌藥物協(xié)同敏感，為臨床選用發(fā)生協(xié)同敏感的藥物進(jìn)行交替治療提供指導(dǎo)。

臨床上治療感染性疾病時(shí)常采用高于MIC的抗菌藥物濃度來(lái)清除致病菌，然而治療過(guò)程中當(dāng)抗菌藥物濃度介于MIC之上而低于MPC，即落在MSW內(nèi)時(shí)，耐藥突變株菌株則能夠被選擇性富集[16]，因此，臨床用藥時(shí)應(yīng)使感染部位抗菌藥物濃度保持在MPC之上。有研究發(fā)現(xiàn)體外誘導(dǎo)耐藥菌株存在協(xié)同敏感現(xiàn)象，協(xié)同敏感菌株在MIC降低的同時(shí)MPC也相應(yīng)減低[17]，較低的抗菌藥物濃度則達(dá)到防耐藥突變濃度，從而在防止耐藥突變株不被篩選富集的同時(shí)保證臨床用藥的安全性。然而，本研究中，慶大霉素誘導(dǎo)耐藥菌株相比親本菌株，氯霉素MIC降低到1/4～1/16，但誘導(dǎo)前后菌株MPC均達(dá)到1024 μg/mL以上，遠(yuǎn)高于氯霉素的最高血藥濃度（Cmax=26 μg/mL）及安全用藥范圍[18]，防耐藥突變選擇窗MSW較寬，本研究中氯霉素MIC降低沒有能夠顯著減小其MSW，提示該理論可能并不適用于采用氯霉素治療糞腸球菌感染時(shí)耐藥突變株的清除。相同藥物對(duì)不同菌種的選擇指數(shù)SI不同，如氯霉素對(duì)大腸埃希菌的選擇指數(shù)SI為6.3，而對(duì)金黃色葡萄球菌的SI則為5.7[19]。本研究中氯霉素對(duì)糞腸球菌的選擇指數(shù)SI達(dá)512以上。因此，系統(tǒng)、全面地測(cè)定臨床常見抗菌藥物對(duì)不同病原菌的協(xié)同敏感及MPC值是臨床應(yīng)用的前提。

有研究報(bào)道誘導(dǎo)耐藥菌株對(duì)其他抗菌藥物產(chǎn)生協(xié)同敏感現(xiàn)象時(shí)，在野生菌株MIC的16倍抗菌藥物濃度作用下，協(xié)同敏感菌株相比野生菌株能夠更快速地被有效清除[17]。本研究中時(shí)間殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在高于親本菌株MIC的抗菌藥物水平下，即4×MIC和16×MIC時(shí)，慶大霉素誘導(dǎo)耐藥前后菌株生長(zhǎng)被抑制程度相似，24 h后菌落數(shù)仍保持在與接種菌量相當(dāng)水平，這可能與氯霉素僅具有抑菌作用而無(wú)殺菌作用有關(guān)。而當(dāng)抗菌藥物濃度低于MIC，即為1/4×MIC和1/2×MIC時(shí)，慶大霉素誘導(dǎo)耐藥菌株被有效抑制，而親本菌株則不能被有效抑制。該研究結(jié)果提示我們協(xié)同敏感現(xiàn)象的發(fā)生使得耐藥菌株能夠在較低的抗菌藥物濃度作用下被清除，尤其對(duì)存在較嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病患者使用具有較強(qiáng)副作用二線藥物情況下，將能夠允許安全用藥的前提下有效清除耐藥菌株。

綜上所述，本研究顯示糞腸球菌經(jīng)慶大霉素體外誘導(dǎo)耐藥能夠快速獲得耐藥性，并對(duì)氯霉素協(xié)同敏感。低水平氯霉素能夠有效抑制協(xié)同敏感菌株的生長(zhǎng)，這為基于協(xié)同敏感的交替用藥策略的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，協(xié)同敏感的發(fā)生發(fā)展規(guī)律及其發(fā)生機(jī)制仍有待進(jìn)一步的闡釋。

參 考 文 獻(xiàn)

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收稿日期：2021-09-24

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 81802069）

作者簡(jiǎn)介：孫瑤，女，生于1990年，主管技師，主要研究方向?yàn)榕R床微生物耐藥機(jī)制研究，E-mail： sunyaowzmu@163.com

通訊作者，E-mail： wyztli@163. com